蛋白激酶C的动力学和膜相互作用

C1B卡箍

2011年，PKCβII的部分晶体结构褐鼠以4º分辨率测定（PDB ID:3PFQ）。³⁹该结构的一个值得注意的特征是由氨基酸序列中不相邻的三个结构域组成的“C1B钳”：C1B，激酶的N末端叶和V5(表1). 有人提出，这种分子内相互作用本质上是抑制性的，因为：（i）C1B“夹持”在V5的保守Phe629上，阻止该残基与ATP的腺嘌呤相互作用，（ii）V5的残基619-621封闭C1B的DAG结合位点。该结构的另一个特征是C2结构域不进行分子内接触，而是参与与邻近PKC分子的催化结构域的相互作用。理解C2如何在原子水平上稳定潜在形式需要进一步研究(参见下文). 三个PKCβII区域：假底物、C1A结构域和调节与激酶结构域之间的铰链区域在电子密度图中无法识别，因此，在结构中不存在。总的来说，PKCβII结构被解释为催化途径上的“中间”状态（即既不潜伏也不活化）。

表1

PKC同工酶中的分子内相互作用。

异酶me/Ref。	交互域	方法	分子内相互作用示意图
βII39	激酶C1B、V5和N端叶	X射线晶体学、诱变和佛波酯刺激的膜易位	在单独的窗口中打开 PS表示负责自动抑制的假底物区域。
α40,41	C1A和C2	计算建模、突变、SPR体外膜结合、DAG刺激的细胞膜移位
α42	C2和V5	突变、FRET和DAG刺激的细胞膜移位

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C1和C2

使用SPR，Slater等人。⁴¹检测到由串联C1A-C1B结构域组成的芯片固定化C1结构域之间的纳米亲和力相互作用（参见图2B)和全长PKCα。这种相互作用依赖于PKC激活剂十四烷酰基佛波酯（一种佛波酯）的存在。利用PKCα的C1–C2结构将C1的相互作用伙伴鉴定为C2结构域。此外，C1结构域的外源性添加显示以浓度和佛波酯依赖的方式激活PKCα。总的来说，数据与C1和C2结构域的分子内相互作用一致，这些结构域使PKC保持潜在形式。

Stahelin等人还探索了C1-C2相互作用的问题。⁴⁰计算对接程序应用于C2畴的晶体结构和C1A的同源模型，以获得关于畴间界面的信息。通过对得分最高的码头结构的分析，在C1A公司和C2：阿斯普55-Arg252，Arg42型-Glu282和苯基27-Phe255.通过诱变破坏静电相互作用导致PKC对含DAG膜的亲和力增加，这表明C1A构象限制较少，因此具有更容易接近的DAG结合位点。同时电荷反转导致PKC变体具有与野生型蛋白相似的膜亲和力。数据支持C1A和C2结构域之间的直接相互作用或“栓系”，当其与C2相互作用时，由质膜的磷脂酰丝氨酸成分释放。

C2和V5

C2和C末端V5结构域之间存在分子内相互作用⁴²(表1)根据V5与Syndecan-4富含赖氨酸的区域结合的观察结果，推测为PKCα的已知激活物。C2结构域有一个保守的带正电荷的区域，称为“富赖氨酸簇”（LRC），类似地，它可能参与与V5的分子内相互作用。事实上，两个V5磷酸化位点Thr638和S657的突变以及V5疏水基序的酸性残基导致DAG敏感性的增加，正如DAG刺激的PKCα变体向质膜的移位所报告的那样。⁴²PKCα变异体的DAG敏感性与使用FRET在ECFP-PKCα-EYFP融合蛋白的N端和C端之间探测的构象变化相关。通过同时反转C2的LRC和V5的疏水基序，重新引入假定的C2-V5相互作用，导致膜移位行为类似于野生型蛋白质。总之，数据支持C2结构域和C末端V5区域之间存在有助于稳定潜在形式的分子内相互作用。C2和V5结构域之间的功能相互作用在PKCβII中也很明显，其中疏水基序的Ser-660磷酸化增加了酶对钙的亲和力²⁺和PtdSer。⁴³

β12/β34环区的动力学

对载脂蛋白C1结构域的可用核磁共振结构群的检查表明，环区β12和β34的构象存在显著的变异，表明C1配体结合位点的构象可塑性。我们使用溶液NMR技术在多个时间尺度上研究了PKCα（C1Bα）的C1B结构域的动力学。¹⁰⁷为了量化主链N-H基团的亚纳秒动力学，我们测量了三个弛豫参数：¹⁵N横向和纵向松弛速率常数，以及{¹高}-¹⁵N核过热增强。使用Lipari-Sabo公式解释这些弛豫参数产生了一组特定于残差的序参数S²_{全日空航空公司}这些参数描述了蛋白质N-H载体的空间限制，1表示总刚度，0表示无限制运动。S系列²_{全日空航空公司}数据显示，与蛋白质的其他区域相比，配体结合环的灵活性总体上有所增加，其中最具活力的残基是β12的Ser111，其S²_{全日空航空公司}0.73，β34的Tyr123带有S²_{全日空航空公司}为0.65。

位于123位或同等位置的C1B残基具有重要的功能作用：其身份，Trp或Tyr，将结构域亲和力切换到DAG。正如牛顿实验室所证明的那样，⁵³在该位置具有天然或突变的Tyr（Trp）的C1结构域对DAG的亲和力降低（增加）。使用¹⁵N旋转框架弛豫-弥散核磁共振实验，我们表征了野生型载脂蛋白C1Bα及其Y123W变体中N-H主链基团的动力学。我们发现环铰链在微秒级进行化学交换(图7A).¹⁰⁷由于Tyr→Trp突变，即以正向和反向速率常数之和的形式进行的交换动力学显著改变，表明突变扰乱了载脂蛋白C1Bα的构象平衡。在另一对C1结构域中，即含有Trp的野生型C1Bδ及其W252Y变异体（M.Stewart和T.Igumenova，正在制备中），观察到残基鉴定、DAG亲和力和化学交换行为之间存在相同类型的相关性。

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图7

C1环动力学及其与混合胶束的相互作用。（A）使用L122、Y123、Q128和G129的N-H主链基团的弛豫-弥散曲线说明wt（实心圆）和Y123W C1Bα（空心圆）的μs时间尺度动力学差异。（B）稳定β12和β34环的内部和内部氢键（顶部）以及环铰链的构象动力学总结（底部）。强调了在wt和突变体中具有可量化分散的残基；在wt或突变体中具有可量化分散的残基分别以规则字体和粗体字体显示（改编自¹⁰⁷).（C）利用PRE探索C1Bδ插入胶束环境的深度。强度比I_对位/我_迪亚W252Y C1Bδ的N-H共振与DPS/DPC混合胶束的顺磁性和反磁性制剂络合，绘制为氨基酸序列的函数。无狗和有狗时的数据分别以黑色和绿色条显示。胶束结合态展宽与PRE无关的残基标记为“B”。将比率归一化为G281，即C末端残基最多的残基。Δ（I_对位/我_迪亚)我的区别是_对位/我_直径结合DOG和仅胶束的W252Y之间的比率（改编自⁷⁵).

我们的核磁共振和计算结果¹⁰⁷表明，对于wt和Y123W C1Bα，具有开放配体结合环的构象可能代表溶液中载脂蛋白的主要构象。我们推测（i）C1在开环构象和部分闭环构象之间交替，后者与DAG的亲和力更高，以及（ii）Tyr→Trp突变通过Trp在界面膜区域的优先分配以及可能通过将载脂蛋白C1的构象平衡转移到部分闭环状态来促进DAG亲和力。这与Falke小组最近的结果一致，⁹²他对脂质双层中PKCα的C1A和C1B结构域进行了广泛的分子动力学模拟。他们观察到载脂蛋白C1结构域中β12和β34环尖端之间的距离分布广泛，C1A的平均沟更宽。在脂质双层存在的情况下，平均环顶端距离增加，而与配体，特别是DAG的相互作用导致其减少。此外，距离的分布变得更窄，这表明配体结合使C1结构域变硬。随后我们定量地证明了wtC1Bδ/W252Y对的β34 Trp优先分配到疏水环境中(参见下文).⁷⁵

总之，C1结构域在其配体结合环区域具有高度的构象可塑性。通过环动力学对结合位点几何形状的调节是C1结构域适应不同化学配体的特性，这是合理的。脂质配体稳定或预选给定的构象可能有助于结合亲和力和配体特异性。

结构锌的动力学²⁺网站

除了环动力学之外，我们还检测并表征了C1Bα50分子结构中Zn（2）配位球的结构动力学。¹⁰⁸这个动态过程的本质是Cys151的Sγ，这是该结构域的最后一个Cys残基，在Zn之间交替²⁺-结合硫醇和游离硫醇状态。这一发现令人惊讶，因为富含结构半胱氨酸的锌²⁺稳定蛋白质折叠的位点被认为是不活跃的。我们使用核磁共振方法确定了锌配位不同的C1B的两个交换构象的结构，并证明了Cys151在较长的含C1B的结构体（如C1B-C2）中的化学反应性。我们的数据表明，Cys151是活性氧物种的切入点，已知活性氧物种在涉及锌的过程中激活PKCα²⁺释放。¹⁰⁹

与膜模拟物和脂质配体的相互作用

与Ca相比²⁺-依赖于C2结构域，在原子水平上对C1与膜的相互作用知之甚少。对全长PKC同工酶的广泛生物物理和生物化学研究为其各自C1结构域的性质提供了有价值的信息；这与新的PKC同工酶特别相关，其中C1负责大多数活化形式的膜相互作用。通过囊泡沉降、酶活性测定和SPR方法证明，PKCα和PKCδ对PtdSer、，^106,110而PKCε的特异性较低，其他阴离子脂质，如POPG，促进膜结合。¹¹⁰在所有参考研究中，诱变用于评估单个PKC残基在膜结合和酶相关激活中的作用。基于荧光检测的停流实验为PKCβII中含有Trp的C1B变体的膜结合过程的动力学提供了深入的见解。这些数据导致了一个包含初始膜预结合步骤的模型，这随后有助于寻找膜嵌入DAG。¹¹¹

PKC与膜的相互作用程度通过一系列脂质单层渗透实验来表征，其中脂质单层的表面压力变化是在注射蛋白质溶液后测量的。传统的PKC同工酶，PKCα和PKCγ，¹⁰¹被发现比新型同工酶PKCε具有更高的膜穿透力¹¹⁰和PKCδ。¹⁰⁶对分离的C1和C2结构域进行的相同类型的实验表明，C1A-C1B与单层脂质的相互作用程度与全长PKCα相当，并且大于分离的C2结构域。¹¹²这一观察结果表明C1结构域在驱动PKC膜相互作用中起着关键作用。

我们使用顺磁弛豫增强（PRE）在单个残基的水平上探测C1Bδ结构域插入膜模拟胶束的深度。⁷⁵在不存在或存在短链二酰基甘油、1,2-二辛醇-sn-甘油（DOG）的情况下，将顺磁性剂（doxyl-labed lipid）并入DPS/DPC混合胶束。基于PRE的实验的原理是，由于未配对电子引起的有效弛豫，穿透胶束疏水核心的蛋白质残基的交叉峰将变宽。胶束顺磁性和反磁性制备物的峰值强度比依赖性表明，β12和β34环都显著插入胶束核心(图7C，顶部图表）。添加DOG导致C1Bδ-胶束相互作用几何结构的改变，如（I_对位/我_迪亚)比率(图7C，下图）。基于仅与DPC和DPC/DPS胶束结合的C1Bδ的CSP分析，我们得出结论，C末端螺旋α1可能参与与PtdSer头部基团的相互作用。通过NMR检测结合实验，我们证明：（i）PtdSer的存在提高了C1Bδ对胶束的亲和力2倍；和（ii）DAG致敏Trp252（相当于传统PKC同工酶中的123位）在没有配体的情况下增强了结构域对胶束的亲和力。我们的数据与牛顿的模型一致¹¹¹和福克⁴⁹这包括C1结构域在脂质双层中的初始配体依赖性分配，并指出123/252位芳香残基在促进这一过程中的关键作用。基于NMR的约束，如CSP数据和PRE比率，可以用作模糊约束，以驱动蛋白质-细胞对接，并获得蛋白质-细胞相互作用的几何结构，如Dancea等人所述。⁷⁶