Reactive cysteine in the structural Zn(2+) site of the C1B domain from PKCα

doi:10.1021/bi300750w

.2012年9月18日；51(37):7263-77.

doi:10.1021/bi300750w。 Epub 2012年9月5日。

PKCαC1B结构域Zn（2+）位点的活性半胱氨酸

米凯拉·D·斯图尔特¹, 塔提亚纳一世伊古梅诺娃

附属公司

PMID： 22913772
预防性维修识别码： PMC3645944型
内政部： 10.1021/bi300750w

PKCαC1B结构域Zn（2+）位点的活性半胱氨酸

米凯拉·D·斯图尔特等。生物化学. 2012.

.2012年9月18日；51(37):7263-77.

doi:10.1021/bi300750w。 Epub 2012年9月5日。

作者

米凯拉·D·斯图尔特¹, 塔提亚纳一世伊古梅诺娃

附属

¹德克萨斯农工大学生物化学和生物物理系，美国德克萨斯州大学城，邮编77843-2128。

PMID： 22913772
预防性维修识别码： PMC3645944型
内政部： 10.1021/bi300750w

摘要

稳定蛋白质折叠的富含半胱氨酸的锌（2+）结构位点被认为是不活跃的。在本文中，我们在具有Cys（3）His配位球的三叶锌指中鉴定了一个活性半胱氨酸残基Cys151。所述蛋白质是蛋白激酶Cα（PKCα）的C1B结构域。采用几种C1B变体的半胱氨酸质量标记分析来确定共价修饰的位点特异性。Cys151在C1B中的反应性也体现在Zn（2+）配位球的结构动力学中，其中Cys151的Sγ在Zn-（2+）结合硫代酸盐和游离硫醇状态之间交替。我们使用NMR检测pH滴定、ZZ交换光谱和剩余偶极耦合（RDC）驱动的结构精细化来表征C1B的两种不同锌配位的交换构象。我们的数据表明，Cys151是激活PKCα的活性氧物种在锌（2+）释放过程中的切入点。

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图1
亲本蛋白上下文和锌²⁺-C1Bα的配位残基。（A）调节域与膜对钙结合的反应²⁺二酰基甘油（DAG）通过假底物（PS）区域解除自抑制。除DAG外，PKCα还可被促肿瘤佛波酯（PE）激活。C1Bα以高亲和力结合PE，并负责PE驱动的PKCα与膜的结合。（B）含锌C1Bα的一级结构²⁺-以青色突出显示的协调残基和强调的PE结合环。

图2
H（H）₂O（运行）₂处理含C1B的蛋白质会导致天然C1B结构的丢失。（A） C1Bα50（黑色）、C151G（红色）和C1B-C2（蓝色）中三种C1B残基的代表性数据。（B）分离C2（紫色）和C1B-C2（蓝色）中三个C2残基的代表性数据。实线是C151G和C1B-C2数据的指数拟合；C1Bα50和C2点用线连接，以便于说明。（C）锌的数量²⁺1.25 mM H处理后溶液中每个蛋白质分子释放的离子₂O（运行）₂在25°C下，直到10%的核磁共振峰间强度保持不变（开条），并且具有4 mM H₂O（运行）₂在42°C下放置一小时（阴影条）。

图3
对C1Bα50、C151G和C1B-C2进行质量标记分析。（A）暴露的半胱氨酸残基的巯基与PEG-mal之间的反应。箭头指向C1Bα50和C1B-C2中的单Cys修饰物种。

图4
C1Bα50存在于两种缓慢交换的构象中。（A）覆盖¹⁵N个-¹C1Bα50和C151G变体的H HSQC光谱。插图显示Lys131、Phe104和Val147的扩张。（B）化学位移扰动Δ映射到C1Bα的结构上。坐标由U.Hommel博士提供。（C） Zn（2）的配位几何结构显示四种蛋白质配体。

图5
C1Bα50 HSQC光谱的pH依赖性。（A）扩展¹⁵N个-¹H HSQC光谱显示具有快速和/或缓慢交换行为的残基示例。（B）种群的pH依赖性一和b条使用两种构象中具有清晰峰的所有残基的交叉峰体积计算分数布居。数据点对应于C1Bα50中的不同交换残基。实线表示数据对等式（2）和（3）的全局拟合。

图6
（A） NMR检测到C1Bα50和C151G中对质子化事件作出响应的细胞核/残基的pH滴定曲线，表观pKa为7.1–7.2。L150的低-pH点一和T134一由于峰加宽/重叠而无法获得。（B）北半球_N个（A）中的残基组映射到C1Bα结构。（C） NMR监测pH滴定实验中使用的两种C1Bα结构的主要结构。突变位点以黄色突出显示；Zn（2）-配位残基以青色突出显示；环残基加下划线。

图7
硫代硫酸盐和硫醇形式之间Cys151相互转化的动力学。（A） ZZ交换光谱的扩展显示Cys151交换交叉峰在两个混合时间（70和360 ms）（B）Ξ在pH=5.75时随着混合时间和温度的变化而形成。实线是等式（8）的拟合。（C）前锋的伊林曲线(k个₁)和反转(k个₋₁′）表中总结的动力学速率常数。ΔH^≠，ΔS^≠、和E_一分别是活化焓、熵和能量。

图8
Cys151配体的消除扰乱了C1Bα动力学。（A） ΔR₂，计算为残差特定R之间的差值₂C151G和C1Bα50的值b条根据主结构绘制。残留时间>1s⁻¹R增加₂C151G变体中的值以青色突出显示。（B） ΔR₂对于C151G和C1Bα50b条对映射到C1Bα的三维结构上。残留物，其中ΔR₂值不可用，以白色显示。（C）光谱密度值J（0.87Ω_H（H）)对于C151G和C1Bα50b条C末端区域以灰色突出显示，在亚ns时间尺度上是灵活的。垂直线标记了两个残基，Leu150和Cys151，这两个残基在构建体之间的灵活性差异最为明显。

图9
基于RDC的C1Bα50结构细化一和C1Bα50b条（A）扩展¹⁵N个-¹拉伸凝胶中C1Bα50的H IPAP光谱。Ser149和Cys151在构象中双重分裂的差异一和b条很明显。（B）拉伸（s）和压缩（c）凝胶的计算RDC与观察RDC。（C） C1Bα50叠加正则平均结构的两种观点一和C1Bα50b条N端和C端之间的距离定义为His102和Cys151的Cα原子之间的距离。

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