C2 domains of protein kinase C isoforms alpha, beta, and gamma: activation parameters and calcium stoichiometries of the membrane-bound state

doi:10.1021/bi026041k

.2002年9月24日；41(38):11411-24.

doi:10.1021/bi026041k。

蛋白激酶C亚型α、β和γ的C2结构域：膜结合状态的活化参数和钙化学计量

苏西·科霍特¹, 塞内娜·科尔巴兰-加西亚, 亚历杭德罗·托雷西拉斯, 胡安·戈梅斯·费尔南德斯, 约瑟夫·福克

附属公司

PMID： 12234184
预防性维修识别码：项目经理3640336
内政部： 10.1021/bi026041k

蛋白激酶C亚型α、β和γ的C2结构域：膜结合状态的激活参数和钙化学计量学

苏西·科霍特等。生物化学. 2002.

.2002年9月24日；41(38):11411-24.

doi:10.1021/bi026041k。

作者

苏西·科霍特¹, 塞内娜·科尔巴兰-加西亚, 亚历杭德罗·托雷西拉斯, 胡安·戈梅斯·费尔南德斯, 约瑟夫·福克

附属

¹美国科罗拉多州博尔德科罗拉多大学化学与生物化学系，邮编80309-0215。

PMID： 12234184
预防性维修识别码：项目经理3640336
内政部： 10.1021/bi026041k

摘要

独立折叠的C2结构域基序在大量Ca（2+）信号通路中充当Ca（2+）依赖性膜对接触发器。对来自传统蛋白激酶C亚家族（cPKC、亚型α、β和γ）的三个密切相关的C2结构域进行了比较。结果表明，这些C2结构域亚型表现出一些相似性，但在重要方面具有特殊性，包括不同的Ca（2+）化学计量。在没有膜的情况下，分离C2结构域的Ca（2+）亲和力相似（2倍差异），而Hill系数揭示了PKC-βC2结构域而非PKC-α或PKC-γC2结构域中的协同Ca（2+）结合（PKC-贝塔的H=2.3+/-0.1，PKC-阿尔法的H=0.9+/-0.1和PKC-伽马的H=0.8+/-0.1）。当存在磷脂酰丝氨酸膜时，Ca（2+）亲和力范围从亚微摩尔到微摩尔（7倍差异）（[Ca（2+）]（1/2）=0.7+/-0.1微米PKC-γ，1.4+/-0.1微M PKC-α，5.0+/-0.2微M PKCβ），以及协同Ca（2+）所有三个C2域均观察到结合（PKCβ的希尔系数等于1.8+/-0.1，PKCα的希尔系数为1.3+/-0.1以及PKCγ的希尔系数是1.4+/-0.1）。膜的巨大作用与耦合Ca（2+）和膜结合平衡相一致，并与磷脂在稳定结合Ca（2+）中的直接作用相一致。磷脂的净负电荷对膜亲和力比其头基结构更重要，尽管与其他阴离子磷脂相比，观察到对磷脂酰丝氨酸的轻微偏好。膜结合C2结构域的Ca（2+）化学计量学可检测到不同。PKC-β和PKC-γ分别以膜相关状态结合三个Ca（2+）离子；膜结合的PKCα结合两个Ca（2+）离子，第三个结合较弱或在生理条件下根本不结合。总的来说，结果表明，传统的PKC C2结构域首先结合溶液中最终Ca（2+）离子的子集，然后与膜弱结合并结合额外的Ca（2+）离子，以在完全组装的三元络合物中产生更强的膜相互作用。Ca（2+）离子的完全补充是与膜紧密结合所必需的。因此，尽管三个C2结构域有64%的相同性，但观察到Ca（2+）亲和力、化学计量学和协同性的差异，表明这些密切相关的C2结构域因其各自的功能和上下文而特殊化。

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数字

图1
PKCα、PKCβ和PKCγ的分离C2结构域的一级氨基酸序列比对。环和β片根据PKCα和PKCβ晶体结构的名称进行分配（16，17）。浅灰色方框表示同源残基；开盒表示相同的残基，并强调了PKCα和PKCβ晶体结构的配位残基。

图2
可用的X射线晶体结构。（A） PKCα（17）和（B）PKCβ（16）分离出C2结构域。PKCα结构在短链脂肪1,2-二己酰基存在下共结晶-锡-磷脂酰-我-丝氨酸（DCPS）以绿色显示。来自DCPS的配位磷氧以红色显示。Ca²⁺离子显示为黄色。

图3
游离钙的尿素变性²⁺-释放C2域。将尿素滴定到含有0.5µM PKCα的溶液中(●），PKCβ(▲), 或PKCγ(■）和1 mM EDTA。监测内在色氨酸荧光的变化。数据通过等式1进行拟合。实验条件：25°C、20 mM HEPES（pH 7.4）、100 mM KCl和5 mM DTT。

图4
钙²⁺PKC C2结构域的亲和力。钙²⁺滴定到含有0.5µM PKCα的溶液中(●），PKCβ(▲），或PKCγ(■）PC/PS/dPE（47.5%：47.5%：5%摩尔百分比）囊泡缺失（A）或存在（B）时的C2结构域。钙²⁺通过固有Trp荧光监测与分离C2结构域的结合。通过监测蛋白-膜FRET引起的固有Trp猝灭来评估膜对接。游离钙²⁺用荧光螯合剂镁绿（eq2）监测膜存在时的浓度。实线表示归一化FRET信号与希尔方程（等式4）的最佳拟合。实验条件：25°C、20 mM HEPES（pH 7.4）、100 mM KCl、5 mM DTT和250µM磷脂。

图5
C2结构域的磷脂头部组特异性。将磷脂滴定到含有0.5µM PKCα（A）、PKCβ（B）或PKCγ（C）C2结构域的溶液中。囊泡由3:1 PC/PX/dPE混合物组成（72.5%：22.5%：5%摩尔百分比），其中PX为PS(●），PG公司(■), PI公司(◆），聚乙烯(□), 或单独使用PC(○). 最佳外观*K（K）*_D类测定了与含有PS、PG和PI的膜的结合值（但不包括PE或PC，因为亲和力不足）。这些明显的*K（K）*_D类PKCαC2结构域的值分别为3±1、13±2和11±3，PKCβC2结构域为4±1、14±2和17±3，与PS、PG和PI膜结合的PKCγC2结构域分别为2±1、5±1和4±1。（D） PKCα、PKCβ和PKCγC2结构域与PC/PS/dPE膜对接的比较（47.5%：47.5%：5%摩尔百分比）。蛋白质对接通过蛋白-膜FRET进行评估，利用受体荧光定量FRET。实线表示产生的归一化FRET信号与独立单点拟合的最佳拟合（等式3）。在所有实验中，通过将总脂质浓度除以系数2得到指示的脂质浓度，从而得出小泡可接触外叶产生的脂质浓度。实验条件：25°C，1 mM游离钙²⁺100 mM KCl、20 mM HEPES（pH 7.4）和5 mM DTT。

图6
C2结构域对接的磷脂酰丝氨酸依赖性。将PC/PS/dPE混合物中增加的PS百分比滴定到含有C2结构域的溶液中。随着PS浓度的变化，蛋白-膜FRET的变化符合独立位点模型（等式3）。绘制了产生的解离常数与PKCα的PS增加百分比的关系(●），PKCβ(▲), 和PKCγ(■）C2域。蛋白质对接通过蛋白-膜FRET进行评估，利用受体荧光定量FRET。解离常数计算使用总PS浓度除以2，以关注囊泡可接触外叶中的脂质。实验条件：25°C，1 mM游离钙²⁺100 mM KCl、20 mM HEPES（pH 7.4）和5 mM DTT。

图7
膜对接的离子强度依赖性。（A）将NaCl滴定到PKCα溶液中(●），PKCβ(▲), PKCγ(■), 或胞浆磷脂酶A2(▲）的情况下，也含有1 mM游离钙²⁺PC/PS/dPE（47.5%：47.5%：5%摩尔百分比）囊泡。蛋白质对接通过蛋白-膜FRET进行评估，利用受体荧光定量FRET。在没有添加NaCl的情况下，FRET信号被归一化为初始FRET信号。添加EDTA以证明任何剩余的蛋白质-膜相互作用已被完全破坏。（B）所示C2结构域和PC/PS/dPE（47.5%：47.5%：5%摩尔百分比）囊泡与1.9M Na孵育₂SO公司₄和5 mM EDTA（黑色条）或2 mM CaCl₂和1 mM EDTA（白色条）。生成的FRET信号被归一化为Ca²⁺-触发FRET信号。细胞质磷脂酶A2数据来自Nalefski等人（4）。实验条件：25°C、250µM脂质、100 mM KCl、20 mM HEPES（pH 7.4）和5 mM DTT。

图8
C2结构域活化和解离动力学。（A–C）钙²⁺-C2结构域与膜的触发对接是通过停止流动混合所示的C2结构域（或与Ca预混合）来启动的²⁺（绿色）或不（黑色），具有相等体积的PC/PS/dPE（47.5%:47.5%:5%摩尔百分比，250µM）囊泡和1mM游离Ca²⁺。面板B和C的插图显示了记录道的前4毫秒。（D）通过混合含有所示C2结构域和1 mM游离Ca的溶液，在三个结构域的并行比较中重复上述实验²⁺具有等体积PC/PS/dPE（47.5%：47.5%：5%摩尔百分比，500µM）囊泡。（E）通过与等量EDTA（10 mM）混合，从PC/PS/dPE膜（47.5%：47.5%：5%摩尔百分比）上开始C2结构域分离，EDTA螯合游离Ca²⁺从而使膜解离不可逆。使用受体荧光定量蛋白质到膜FRET来评估蛋白质对接和分离。实线在某些情况下隐藏在数据下，表示最适合单指数方程。实验条件：25°C、100 mM KCl、20 mM HEPES（pH 7.4）和5 mM DTT。

图9
钙的测定²⁺膜结合络合物的化学计量。钙²⁺通过停止流动混合含有C2结构域预先形成的复合物Ca的溶液，开始从C2结构域与膜的复合物中释放²⁺（100µM）和PC/PS（50%:50%摩尔百分比，500µM磷脂）囊泡，具有等体积的荧光钙²⁺螯合剂Quin-2（200µM）。钙的缓慢释放²⁺络合物中的离子通过奎因-2发射的增加进行定量。实线表示归一化Quin-2信号与单指数方程的最佳拟合。对于每个实验，使用Quin-2标准曲线校准钙的数量²⁺释放的离子。实验条件：25°C、100 mM KCl、20 mM HEPES（pH 7.4）和5 mM DTT。

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