Identification of the activator-binding residues in the second cysteine-rich regulatory domain of protein kinase Cθ (PKCθ)

doi:10.1042/BJ20121307

.2013年4月1日；451(1):33-44.

doi:10.1042/BJ20121307。

蛋白激酶Cθ（PKCθ）第二个富含半胱氨酸调节域激活物结合残基的鉴定

加齐·拉赫曼¹, Sreejesh Shanker先生, 南希·勒温, 诺埃米·凯迪, 科林·希尔, B V文卡塔兰·普拉萨德, 彼得·布隆伯格, Joydip Das公司

附属机构

PMID： 23289588
预防性维修识别码： PMC6988732型
DOI（操作界面）： 10.1042/BJ20121307

蛋白激酶Cθ（PKCθ）第二个富含半胱氨酸调节域激活物结合残基的鉴定

加齐·拉赫曼等。生物化学杂志. 2013.

.2013年4月1日；451（1）：33-44。

doi:10.1042/BJ20121307。

作者

加齐·拉赫曼¹, Sreejesh Shanker先生, 南希·勒温, 诺埃米·凯迪, 科林·希尔, B V文卡塔兰·普拉萨德, 彼得·布隆伯格, Joydip Das公司

隶属关系

¹美国德克萨斯州休斯顿市休斯顿大学药学院药理学与药学系，邮编77204。

PMID： 23289588
预防性维修识别码： PMC6988732型
DOI（操作界面）： 10.1042/BJ20121307

勘误表in

《生物化学杂志》2013年7月1日；453(1):153

摘要

PKC（蛋白激酶C）θ主要在T细胞中表达，并与免疫密切相关。设计PKCθ选择性分子以靶向其激活物结合C1结构域来管理自身免疫性疾病需要了解其结构和激活物结合残基。C1结构域由孪生C1结构域C1A和C1B组成，其中C1B在PKCθ的膜转位和活化中起关键作用。在本研究中，我们测定了PKCθC1B的晶体结构，分辨率为1.63？（1？=0.1 nm），这表明活化剂结合囊边缘的Trp（253）朝向膜，而在PKCδC1B中，同源色氨酸残基远离膜。Trp（253）的这种特殊取向影响激活物结合囊的大小和膜亲和力。为了进一步探讨激活物结合的结构约束，对激活物结合位点的5个残基进行了突变（Y239A、T243A、W253G、L255G和Q258G），并测量了PKCθC1B突变体的结合亲和力。这些突变体显示出对佛波酯[PDBu（佛波12,13-二丁酸酯）]和二酰基甘油[DOG（sn-1,2-二辛酰基甘油），SAG（sn-1-硬脂酰基-2-花生酰甘油）]的结合亲和力降低。与野生型相比，所有五个全长PKCθ突变体都表现出减少了佛波酯诱导的膜移位。这些结果提供了对PKCθ激活物结合域的深入了解，这将有助于未来PKCθ-选择性分子的设计。

PubMed免责声明

数字

**图1。PKC结构θC1B级**
(A类)电子密度图（2如果₀−如果₀)PKC的θ显示Trp向上方向的C1B子域²⁵³朝向薄膜。适用于Trp的电子密度的扩展视图²⁵³如左上角所示。(B类)PKC的带状结构θC1B叠加在轮廓表面上。轮廓表面上的蓝色区域代表极性残基，而白色到橙色代表最疏水的残基。添加到N端和C端的额外残留物形成β-板材结构。

**图2。PKC的结构和序列比较δC1B和PKCθC1B用于识别活化剂结合残基**
PKC晶体结构的叠加δC1B（蓝色）与佛波-13结合-*O（运行）*-醋酸盐和PKCθC1B（粉红色）表示它们是重叠的。福尔波-13-*O（运行）*-乙酸在PKC活化剂结合槽中形成五个氢键δC1B；与Gly的两个键²⁵³，与Thr的两个键²⁴²和与Leu的一个键²⁵¹（用红色虚线表示）。PKC公司θC1B由相同的同源激活物结合残基组成，表明可能与佛波醇-13有类似的结合-*O（运行）*-共结晶后的醋酸盐。PKC中下划线的残留物δC1B序列构成活化剂结合区域，红色残基是共结晶结构中报告的直接活化剂结合残基（PDB代码1PTR）。PKC中标有箭头的残留物θC1B是突变的残基。图中只显示了C1B域的激活剂绑定部分。

**图3。确定*K（K）*_d日和*K（K）*_我**
(A类和B类)确定*K（K）*_d日.用于绑定的饱和图[^三H] PDBu至(A类)PKC公司θC1B和(B类)PKC公司θC1B L255G。(C类和D类)确定*K（K）*_我.竞争性抑制结合的图[^三H] 狗PDBu至(C类)PKC公司θC1B和(D类)PKC公司θC1B L255G。结果是单个实验中三个重复点的平均S.E.M。如果错误条不可见，则它们小于符号。所示实验是三次重复实验的代表。的平均值*K（K）*_d日和*K（K）*_我如表2所示。

**图4。PS对佛波酯结合的影响**
PDBu绑定到PKCθC1B及其突变体被确定为PS/PC磷脂混合物中PS百分比的函数，并相对于100%PS的结合进行表达。结果是三个独立实验的平均值±S.E.M。

**图5。突变对PKC膜转运特性的影响θ及其C1B结构域突变体**
PKC胞浆和膜之间的分布θ及其突变体在用(A类)50 nM PMA，以及(B类)250 nM狗。全长蛋白在HEK-293细胞中表达。用PMA或DOG处理细胞，收获并分离。通过Western blotting分析细胞溶质（C）和膜（M）组分。每个数据点代表三次测量的平均值±S.D**P（P）*< 0.05.

**图6。GFP标记PKC的易位模式θPMA处理后LNCaP活细胞中的野生型及其突变体**
表达野生型或突变型GFP–PKC的细胞θ构造物用1000nM处理(A类)或100 nM(B类)项目管理局。通过共焦显微镜检查移位模式随时间的变化。每个面板代表三到四个独立实验的典型图像。

**图7。C1结构域的序列比较**
Trp公司²⁵³在PKC中θ并将其在其他C1结构域中的同源残基装箱。

**图8。PKC中色氨酸残基的定位δC1B、PKCθC1B和Munc 13.1 C1**
(A类)Trp的方向²⁵²PKC的δC1B（蓝色），Trp²⁵³PKC的θC1B（绿色）和Trp⁵⁸⁸Munc13.1C1（红色），位于PKC叠加结构的一致位置22δC1B（PDB代码1PTQ），PKCθC1B（PDB代码4FKD）和Munc 13-1 C1-域（PDB码1Y8F）。Trp公司²⁵²朝向远离膜，而Trp²⁵³朝向薄膜。Trp公司⁵⁸⁸Munc 13-1 C1结构域被投射到激活物结合囊中。(B类)可能πTrp之间的堆垛相互作用²⁵²和他的²⁶⁹和阳离子–πTrp之间的相互作用²⁵²和Lys²⁷¹在PKC中δC1B和(C类)可能的阳离子-π他的互动²⁷⁰和Arg²⁷²在PKC中θC1B类。

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