持续抑制PKCα可减少乳腺癌转移过程中的灌注和肺部播散体内小鼠模型

抗体

对于Western blot分析，从Santa Cruz Biotechnology，Inc.（加利福尼亚州圣克鲁斯）购买针对PKC同工酶和Gαi-3（C-10）的兔抗体、抗GAPDH抗体、Advanced Immunochemical（加利福尼亚州长滩）的克隆6C5、Cell Signaling（马萨诸塞州丹弗斯）的磷酸化iκBα和iκBα抗体，来自BioLegend（加利福尼亚州圣地亚哥）的抗CXCR4抗体和用于疗效研究的多克隆抗大鼠CXCR4中和抗体来自Torrey Pines Biolabs（新泽西州东奥兰治）。

肽合成和给药

PKCα选择性易位抑制剂（αV5-3）来源于PKCαV5区域（[QLVIAN]），PKCα的642-647氨基酸位于V5结构域，与βI和βII肽的位置同源(斯特宾斯和莫奇利·罗森，2001年). 如前所述，合成肽，并将其与膜透性TAT蛋白衍生载体肽（残基47–57，[YGRKKRRQRRR]）结合用于细胞内递送(贝格利等., 2004；陈等., 2001). TAT载体肽或生理盐水作为阴性对照。提供了肽体内如前所述，使用Alzet渗透微型泵（Alzet型号2001）(殷纳加奇等., 2005). 将肽溶解在盐水中，并以恒定速率（0.5µl/hr）给药，对应于24 mg/kg/天（30mM TAT）和36 mg/kg/日（30mMαV5-3-TAT共轭物或简称αV5-3）。在一些实验中，吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC，Sigma，P-8765，50 mg/kg/天）或抗CXCR4抗体（10mg/ml）也被输送到这些Alzet渗透泵中。每2周更换一次泵，这与泵中肽的稳定性相对应(殷纳加奇等., 2005). MMP-2/9抑制剂（SB-3CT第页MS，Calbiochem，#444285）在10µM下使用在体外.

动物肿瘤模型

所有动物实验均按照斯坦福大学动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。

从Charles River实验室（马萨诸塞州威尔明顿）购买6周大的雌性BALB/c小鼠，该实验室位于斯坦福大学医学中心（加利福尼亚州斯坦福）的动物护理设施内，并在标准温度、湿度和定时照明条件下保存，提供鼠食和水随意将4T1-luc、JC-luc或MDA-MB-231-luc肿瘤细胞直接注入0.1mL无菌DMEM（100000或2500000个细胞/只动物）中的小鼠乳腺脂肪垫。当肿瘤平均大小达到100毫米时，开始肽治疗^三，除非另有说明，大约1周后发生。在肺部接种研究中，在无菌PBS中注射100000个4T1-Luc细胞通过尾静脉。用如上所述在渗透泵中递送的PBS、肽抑制剂、PDTC或抗CXCR4抗体处理动物。

生物发光成像

小鼠接受荧光素（300 mg/kg，成像前10分钟），并在IVIS100成像系统中进行麻醉和成像（Xenogen，Caliper Life Sciences的一部分）。使用Living Image软件（卡钳生命科学公司的Xenogen）对图像进行分析。生物发光通量（光子/sec/sr²/厘米²)确定肺部和胸腔（感兴趣的上腹部区域）或原发肿瘤。

免疫印迹分析

按照之前的描述处理肿瘤(基姆等., 2008). 如前所述，PKCα、βII和ɛ的易位是通过测定肿瘤样品中细胞溶质和颗粒组分的水平来测量的(贝格利等., 2004；殷纳加奇等., 2005).

RNA干扰

从Santa Cruz Biotech（小鼠，sc-36244，加州圣克鲁斯）获得靶向PKCα的小干扰RNA（siRNA）双工体。该siRNA产品由三个靶向特异性19-25核苷酸siRNA组成，用于减少PKCα基因表达（参见补充材料). 根据制造商的说明，使用来自Gene Silencer（加利福尼亚州圣地亚哥）和Lipofectamine（加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen）的转染试剂，用对照siRNA和PKCαsiRNA转染约95%合流的细胞。转染48小时后收集细胞和培养基。

体外静脉滴注试验

原代人内皮细胞（HUVEC）细胞（Lonza）或小鼠肿瘤内皮细胞（2H-11，ATCC）生长在24孔板中组织培养插入物中的Matrigel塞顶部。如前所述进行了血管内分析(基姆等2000年).

体外侵入试验

根据制造商的说明（Becton Dickinson 354483）进行分析。使用相同数量的无基质凝胶涂层的对照插入物（Becton Dickinson 354578）评估细胞的迁移。

免疫组织化学

将新获得的肺部固定在4%多聚甲醛中，24小时后转移到70%乙醇中。然后将肺部包埋在石蜡中，切割成5µm的切片，并安装在玻璃载玻片上。将载玻片中的组织切片用二甲苯脱蜡，用稀释的酒精系列水化，浸泡在3%H中₂O（运行）₂在蒸馏水中浸泡15分钟以熄灭内源过氧化物酶活性并用苏木精染色。

流式细胞术

细胞取自组织培养板或肿瘤的机械分离（通过细胞过滤器）。抗体染色后，在FACScaliber（BD Pharmigen）上分析细胞。

抑制PKCα减少肿瘤转移，体内

确定PKCα是否在4T1-luc细胞的转移中起作用体内，我们用对照的载体肽（TAT）治疗小鼠_47–57; 24mg/kg/天），或等摩尔浓度的αV5-3-TAT_47–57（αV5-3；一种与细胞通透性TAT结合的PKCα抑制肽_47–57用于细胞内递送；35mg/kg/天），为期四周，从乳腺脂肪垫原位肿瘤细胞植入一周后开始(图2A). 之所以选择这个时间点，是因为我们在癌细胞植入后7-10天在肺部发现了4T1-luc细胞(图1A). 用αV5-3治疗4周，几乎完全阻止了向肺部的转移，并显著减少了向胸腔的转移(图2B，顶部和底部），两个主要的转移部位(史密斯等., 2004). 这些数据表明PKCα在该模型的转移中起主要作用。

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图2

抑制PKCα减少肿瘤转移

（A） 实验方案：将4T1-luc肿瘤细胞（100000/0.1mL）注射到BALB/c雌性小鼠（n=6-12）的乳腺脂肪垫中。细胞注射一周后，使用Alzet微型泵开始肽治疗4周，随后处死小鼠。αV5-3治疗4周后，肺（B，顶部）和胸腔（B，底部*；p<0.05，未配对吨测试）。（C） 通过易位分析测定，αV5-3治疗降低了肿瘤中PKCα的活性水平。GAPDH和Gαi分别用作细胞溶质（C）和颗粒（P）组分的负荷控制。（D） αV5-3治疗对易位分析测定的PKCβII活性水平没有影响(图2D，n=4个，*；p<0.05，未配对吨测试）。相同的装载控制用于图2C和D.

我们通过测定经αV5-3治疗的小鼠原发性肿瘤裂解物中PKC同工酶的亚细胞分布，证实了同工酶特异性抑制。虽然PKCβII的激活不受影响，但与对照组小鼠相比，αV5-3治疗小鼠肿瘤中PKCα的活性水平低约65%(图2C和D). 相同的装载控制用于图2C和D（另请注意，αV5-3处理不会影响这些同工酶的总细胞水平；请参阅图2C和D). 总之，这些结果表明4T1-Luc肿瘤的转移需要PKCα活性，而αV5-3特异性地抑制这种活性。

PKCα的抑制抑制血管内转移

转移是一个多步骤的过程，可能不同的细胞过程对这些不同阶段很重要。因此，我们着手确定PKCα调节的步骤。我们大致将转移过程分为两个阶段：肿瘤细胞从原发肿瘤中逃逸和二次器官移植。我们首先使用在体外化验。该分析测量肿瘤细胞通过内皮细胞层的运动，从而模拟肿瘤细胞离开原发肿瘤进入循环的运动，即.输精管内。我们用TAT或αV5-3处理4T1-luc细胞，并测量其通过小鼠内皮细胞层并进入基质凝胶塞(图3A). 与对照组相比，αV5-3治疗使4T1细胞穿越内皮细胞屏障的能力降低了75%以上(图3A).

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图3

PKCα的抑制抑制血管内转移

（A） 使用生物发光成像技术（IVIS50，Xenogen，Caliper Life Science的一部分，n=4）测量4T1-luc细胞通过小鼠内皮细胞层进入基质凝胶层的渗透。小鼠肿瘤内皮细胞（2H-11，ATCC）在24孔板中的组织培养插入物中的Matrigel插塞的顶部上生长，直到它们形成融合的单层。然后在内皮细胞层上方添加表达荧光素酶的乳腺癌细胞（1000000个细胞/孔），并按照指示添加肽，最终浓度为10µM。每2小时重复应用肽10小时，然后再培养细胞14小时（总共24小时）。最后，抽吸细胞培养基，用棉签去除内皮细胞层。添加荧光素后，对基质凝胶塞进行成像（IVIS50；Xenogen，Caliper Life Sciences的一部分）。产生的生物发光用于量化穿过内皮细胞层并进入基质凝胶塞的标记肿瘤细胞的数量。（B） 重复实验，观察人MDA-MB-231-luc乳腺癌细胞对原代人内皮HUVEC细胞的侵袭（透明条中的TAT治疗和蓝色条中的αV5-3治疗，n=4）。（C） 通过凝胶内酶谱法测定原发性肿瘤中MMP-9的活性，该酶谱法是在按照图2显示了MMP-9前体和活性形式的分子量。（D） 用载体（DMSO，对照）和SB-3CT（MMP-9抑制剂，DMSO中10µM）处理的4T1-luc细胞培养物，测量分泌型MMP-9的活性（n=3）。细胞处理24小时，收集培养基并分析MMP-9活性。此外，用对照（ctrl）siRNA和PKCαsiRNA处理48小时后再培养2天，在培养基中测量MMP-9活性。

我们还测定了αV5-3对人乳腺癌细胞MDA-MB-231-luc的影响及其通过HUVEC单层的能力(图3B). 这既是为了验证用小鼠细胞系获得的数据与人类疾病相关，也是为了确保效果不受使用转化内皮细胞系的影响。我们发现，与TAT治疗相比，αV5-3治疗减少了高转移性MDA-MB-231细胞的灌注约55%(图3B). 基于这些在体外经检测，PKCα的激活似乎是肿瘤细胞从原发肿瘤向血管移动所必需的。

接下来，我们研究了PKCα抑制所产生的这种保护作用的分子机制。基质金属蛋白酶（MMPs）通过降解基质蛋白而被认为是血管内灌注的主要调节因子(诺埃尔等., 2008；扎克等2000年)蛋白酶MMP-2和-9以及丝氨酸蛋白酶尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）被报道调节乳腺癌转移(查克拉博蒂等2003年；Ke（克）等., 2006；惯性矩等., 2006；测试人员等2000年). 因此，我们测定了TAT或αV5-3治疗动物肺部原发肿瘤和转移肿瘤中MMP-2、-9和uPA的活性；uPA在原发性或转移性肿瘤中均无明显影响（数据未显示），但αV5-3治疗使原发性肿瘤中MMP-9的活性降低约40%(图3C). 这些数据表明，αV5-3抑制MMP活性可能导致乳腺癌细胞的灌注减少。

然后，我们用MMP-9抑制剂（SB-3CT）处理4T1-luc细胞，并将其MMP-9活性与转染PKCαsiRNA的细胞进行比较。我们发现SB-3CT使MMP-9活性降低60±6%(图3D而转染PKCαsiRNA的细胞MMP-9活性降低50±3%(图3D，n=4）。综上所述，这些数据表明PKCα通过MMP-9活性调节原发性肿瘤中癌细胞的灌注。

PKCα的抑制可防止4T1癌细胞植入肺部

接下来，我们确定PKCα是否调节次级器官中细胞的接种。我们使用了“肺部接种”分析体内(史密斯等., 2004)静脉注射肿瘤细胞会导致细胞在肺部生长。该试验旨在模拟肿瘤细胞注入循环后发生的迁移、粘附靶器官血管和存活情况。

在肿瘤细胞注射前2天，用渗透泵将TAT和αV5-3肽持续注射在小鼠侧腹。通过尾静脉注射荧光素酶标记的4T1肿瘤细胞，5天后对动物进行成像。第5天测定，用αV5-3治疗显著减少了肺中癌细胞的存在(图4A). 细胞注射后第5天，肺部肿瘤负担减轻了45%，这是令人鼓舞的，因为这可能意味着组织粘附和/或对转移部位的侵袭和/或该部位肿瘤细胞的存活率降低，所有这些都会降低肺部肿瘤负担。

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图4

PKCα的抑制对癌细胞肺部播散的保护作用

（A） 注射4T1-luc肿瘤细胞通过尾静脉（100000个细胞/0.1mL PBS，n=9-10个）。在肿瘤细胞注射前2天开始通过渗透泵给肽。然后在肿瘤细胞注射后第5天对动物进行成像，以测量肺部播散和转移的程度。（B） 本研究的肺部在治疗后14天恢复，用苏木精染色以确定4T1肿瘤结节的数量和大小（n=3个，代表性图像显示为200X；箭头表示肿瘤结节，标尺；10µm）。（C） TAT治疗组和αV5-3治疗组的生存率比较。在注射肿瘤细胞后30天内对动物进行监测，以进行生存分析，如卡普兰-梅耶生存曲线所示（n=4-6，每个）。

为了确定肺部接种后肿瘤负担的减轻是由于肿瘤结节数量减少还是肿瘤结节大小减少，我们对以相同方式治疗的动物的肺组织进行了组织学检查，并在治疗2周后分析了肺组织(图4B). 与TAT治疗组相比，αV5-3治疗大大减少了肺结节的数量（箭头；结节，p<0.05），但单个结节的大小似乎没有受到显著影响(补充图3). 这些数据与PKCα抑制剂对肿瘤细胞增殖率无影响相一致(补充图7A–D)这再次暗示了这种治疗对转移的选择性抑制作用。

我们进一步测定了两个治疗组小鼠在肺部接种后的存活率，发现静脉注射侵袭性4T1肿瘤细胞并用αV5-3治疗的小鼠比用TAT治疗的小鼠存活时间更长(图4Cp=0.027）；70%的经αV5-3处理的动物存活了30天，而经TAT处理的动物当时只有10%存活。这些数据表明，PKCα的抑制也通过减少肿瘤细胞在肺部的播散来提高乳腺肿瘤小鼠的生存率。

我们感谢斯坦福大学Amato Giaccia博士实验室的Erinn Bruno Rankin博士慷慨的技术支持，以及Adrienne Gordon博士对手稿的批判性阅读。这项工作得到了国家癌症研究所（DHHS（J.K.）授予的PHS赠款CA09151号的部分支持。