Interfacial partitioning of a loop hinge residue contributes to diacylglycerol affinity of conserved region 1 domains

doi:10.1074/jbc.M114.585570

.2014年10月3日；289(40):27653-64.

doi:10.1074/jbc。M114.585570。 Epub 2014年8月14日。

环铰链残基的界面分配有助于保守区1结构域的二酰甘油亲和力

米凯拉·D·斯图尔特¹, 泰勒·R·科尔¹, 塔提亚纳一世伊古梅诺娃²

附属公司

¹来自德克萨斯州农工大学生物化学和生物物理系，德克萨斯州大学城，邮编77843。
²来自德克萨斯州农工大学生物化学和生物物理系，德克萨斯州大学城77843tigumenova@tamu.edu。

PMID： 25124034
预防性维修识别码：项目经理4183803
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环铰链残基的界面分配有助于保守区1结构域的二酰甘油亲和力

米凯拉·D·斯图尔特等。生物化学杂志. 2014.

.2014年10月3日；289（40）：27653-64。

doi:10.1074/jbc。M114.585570。 Epub 2014年8月14日。

作者

米凯拉·D·斯图尔特¹, 泰勒·R·科尔¹, 塔提亚纳一世伊古梅诺娃²

附属公司

¹来自德克萨斯州农工大学生物化学和生物物理系，德克萨斯州大学城，邮编77843。
²来自德克萨斯州农工大学生物化学和生物物理系，德克萨斯州大学城77843tigumenova@tamu.edu。

PMID： 25124034
预防性维修识别码：项目经理4183803
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摘要

传统和新型PKC同工酶通过与C1调节域的相互作用被膜包埋的第二信使二酰甘油（DAG）激活。C1结构域对DAG的亲和力在PKCs之间有很大差异。为了深入了解差异DAG亲和力的起源，我们对PKCδ（C1Bδ）及其W252Y变体的C1B结构域进行了高分辨率核磁共振研究。W252Y突变先前被证明使C1Bδ对DAG的反应性降低（Dries，D.R.、Gallegos，L.L.和Newton，A.C.（2007）C1结构域中的一个单一残基使新型蛋白激酶C亚型对细胞内二酰甘油的产生敏感。生物学杂志。化学。282826-830），从而模拟在等效位置具有保守Tyr的传统PKC中C1B结构域的行为。我们的数据表明，W252Y突变并没有扰乱C1Bδ在溶液中的构象，但显著降低了其在没有DAG的情况下分裂成膜模拟环境的倾向。使用掺有顺磁性脂质的洗涤剂胶束，我们确定252位的残基同一性和与二酰甘油的络合都会影响C1Bδ-胶束相互作用的几何结构。此外，我们确定C1Bδ的C末端螺旋α1是与磷脂酰丝氨酸（PKCδ的已知激活剂）头部基团的相互作用位点。总之，我们的研究（i）揭示了与模拟膜环境、DAG和磷脂酰丝氨酸相互作用的C1Bδ残基的身份，以及与每个事件相关的亲和力，（ii）表明C1B结构域的初始配体依赖性膜募集，Trp-252的界面分配极大地促进了DAG亲和力的差异，至少在一定程度上是DAG亲和性差异的原因。

关键词：C1域；二酰甘油；脂质信号；核磁共振；磷脂酰丝氨酸；蛋白激酶C（PKC）；蛋白质-脂质相互作用。

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数字

**图1。**
A类C1Bδ的结构与水溶性佛波酯佛波-13醋酸盐络合（蛋白质数据库代码1PTR（19））。环区β12（残基237–242）和β34（残基252–257）在绿色α1是一个短的α-螺旋，包含270–275个残基。双结构锌²⁺离子显示为*灰色球体。B类*，C1Bδ配体结合位点的扩张显示了佛波醇-13醋酸盐之间的氢键(*P13A页*)和C1Bδ的主链原子。Trp-252的侧链不参与与配体的直接相互作用。CC1Bδ与Trp-252和Zn的一级结构²⁺-协调突出显示的残留物橙色和*黄色的*分别是。β12和β34环为*下划线的*并用突出显示*绿色。N项*，N终点；*C术语*，C末端。

**图2。**
**W252Y突变不会显著干扰溶液中C1Bδ的构象。**覆盖¹⁵N个-¹wtC1Bδ的H HSQC光谱(黑色)和W252Y(红色)，共振分配显示在相应的交叉峰旁边。在wtC1Bδ谱中交换变宽的峰值出现在W252Y谱中*黑体字*和*下划线的*Asn-237和Lys-271共振，用*X（X）*符号低于轮廓级别阈值。Aliased Arg侧链峰值标记为*星号。插入*CSP值Δ绘制为一级结构的函数。突变位点用箭头.交换型残留物和Pro-241标记为星号.

**图3。**
**W252Y变异体结合DOG的亲和力低于wtC1Bδ。**The expansions of the¹⁵N个-¹对于100μ米重量C1Bδ(A类)和W252Y(B类)在10m处米DPS/DPC。在没有胶束的情况下，载脂蛋白的光谱*黑色。C*，通过荧光检测滴定实验获得C1Bδ的DOG结合曲线。这个实线是视觉引导眼睛。D类，根据NMR检测的滴定数据构建W252Y变体的典型DOG结合曲线。这个实线是方程2的全局拟合。

**图4。**
**wtC1Bδ与胶束的配体依赖性相互作用。** A类，apo和DPC结合态对的CSP分析。根据方程式1计算残留物特定Δ值；平均值和（平均值+S.D）Δ值用蓝色和红线分别是。B类表示经过交换的残留物，因此无法进行比较；Pro-241标有星号Δ超过平均值和平均±S.D.值的残数映射到蓝色和红色，而无数据的残基和Pro-241显示在*黑色。B类*，wtC1Bδ结合曲线，通过绘制CSP值Δ与胶束总浓度的关系来构建。实线代表所有DPC-响应残基的全局拟合。C，对apo和DPS/DPC结合的C1Bδ态对的CSP分析。D类与混合胶束相互作用后，在wtC1Bδ中观察到两种类型的结合位点。实线代表特定组内所有胶束反应残基的全局拟合。E类，wtC1Bδ与混合胶束相互作用的模型。文本中描述了事件1-3。

**图5。**
**三元C1Bδ-DOG胶束络合物中的α1残基受PtdSer的影响。** A类，覆盖¹⁵N个-¹在100μ米U型-¹⁵三种状态下富氮C1Bδ：apo(绿色)，DOG-在仅含DPC的胶束中络合(蓝色)，和DOG在混合DPS/DPC胶束中络合(红色). C1Bδ、DOG和洗涤剂的总浓度为100μ米, 500 μ米和10米米分别是。交叉峰的位移用表示箭头：从apo-到DOG/DPC绑定状态(*实心箭头*)以及从DOG/DPC-绑定到DOG/DPS/DPC-约束状态(*虚线箭头*). Trp-252、Gln-257和Gly-258（标记为星号)在apo C1Bδ中进行了交换。残基Lys-271、His-270和Glu-274的化学位移受DPS影响，但不受DPC影响*粗体字体。B类*，计算了一对DOG/DPS/DPC-束缚和DOG/DPC-绑定C1Bδ态的化学位移微扰Δ。0.05和0.14的平均值和平均值±S.D.Δ值标记为蓝色和红线分别是。

**图6。**
**W252Y突变降低了C1Bδ对混合胶束的亲和力。** A类，对apo和DPS/DPC结合的W252Y态的CSP分析。根据方程式1计算残留物特定Δ值；平均值和平均值+S.D.Δ值表示为蓝色和红线分别是。B类表示W252Y中被交换的残留物，因此无法进行比较；Pro-241和光谱未解析的Tyr-238标记有星号Δ超过平均值和平均±S.D.值的残数映射到蓝色和红色，而无数据的残基和Pro-241显示在*黑色。B类*和C与混合胶束相互作用后，在W252Y中观察到两种具有不同亲和力的结合位点。实线代表特定组内所有胶束反应残基的全局拟合。D类，两种C1Bδ变体测定的表观离解常数总结。

**图7。**
**252位的残基同一性以及与DOG的相互作用影响C1Bδ插入胶束环境的深度。**强度比我_对位/我_迪亚wtC1Bδ的N-H共振(A类)和W252Y(B类)，与DPS/DPC混合胶束的顺磁性和反磁性制剂络合，不存在(*黑色条*)和存在(*绿色条*)狗。胶束结合态展宽与PRE无关的残基标记为B类对于每个蛋白质样品，比率均归一化为Gly-281，即C末端残基最多的蛋白。总浓度为：150μ米蛋白质，100米米总洗涤剂，0.5 m米狗，1.3米米14-doxyl PC输入B类, Δ(我_对位/我_迪亚)两者的区别是我_对位/我_直径DOG-结合和仅胶束W252Y之间的比率。C，W252Y的强度比作为颜色梯度映射到apo C1Bδ的结构上。无可用数据的残留物显示在*深灰色*在没有和存在DOG的情况下，具有显著不同插入深度的残留物*黑体字*和*下划线的。D类*，C1Bδ变异体主干N-H组PRE值的相关性。标记wtC1Bδ及其W252Y变体中PRE值显著不同的残留物。除His-270外，其余均属于环铰区域。

**图8。**
**凯特·杜立特(*杜兰特*)使用ExPASy生物信息学资源门户的ProtScale工具生成的α、β和δPKC同工酶C1B结构域的亲水性图褐鼠.**残留物编号对应于PKCδ。α1的一级结构（残基270–275）在插入。位置273–274会导致水疗值的差异，突出显示为灰色与PtdSer相互作用中涉及的残留物标记为星号.

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