Probing the determinants of diacylglycerol binding affinity in the C1B domain of protein kinase Cα

doi:10.1016/j.jmb.2011.03.020

.2011年5月20日；408(5):949-70.

doi:10.1016/j.jmb.2011.03.020。 Epub 2011年3月17日。

蛋白激酶CαC1B结构域中二酰甘油结合亲和力的决定因素探讨

米凯拉·D·斯图尔特¹, 布列塔尼·摩根, 弗朗西丝卡·马西, 塔提亚纳一世伊古梅诺娃

附属公司

PMID： 21419781
预防性维修识别码：项目经理3489171
内政部： 2016年10月10日/j.jmb.2011.03.020

蛋白激酶CαC1B结构域中二酰甘油结合亲和力的决定因素探讨

米凯拉·斯图尔特等。分子生物学杂志. 2011.

.2011年5月20日；408(5):949-70.

doi:10.1016/j.jmb.2011.03.020。 Epub 2011年3月17日。

作者

米凯拉·D·斯图尔特¹, 布列塔尼·摩根, 弗朗西丝卡·马西, 塔提亚纳一世伊古梅诺娃

附属

¹德克萨斯农工大学生物化学和生物物理系，美国德克萨斯州大学城奥尔森大道300号，邮编77843。

PMID： 21419781
预防性维修识别码：项目经理3489171
内政部： 2016年10月10日/j.jmb.2011.03.020

摘要

C1结构域是独立折叠的模块，负责将其母蛋白靶向含有二酰甘油（DAG）的脂质膜，DAG是一种普遍存在的第二信使。C1结构域的DAG结合亲和力决定了信号反应传播所需的DAG阈值浓度以及细胞中DAG受体对该反应的选择性。目前C1结构域的结构信息对其差异DAG结合亲和力的分子基础提供了很少的见解。在这项工作中，我们使用溶液核磁共振方法和分子动力学模拟表征了蛋白激酶Cα（C1Bα）的C1B结构域及其诊断突变体Y123W。突变并没有扰乱蛋白质骨架的C1Bα结构或亚纳秒动力学，但导致DAG结合亲和力增加了100倍以上，微秒时间尺度构象动力学发生了实质性变化，如核磁共振旋转帧弛豫扩散方法所量化的那样。野生型和Y123W C1Bα构象交换行为的差异局限于配体结合环的铰链区域。分子动力学模拟揭示了交换构象的身份，并揭示了特定残基（Gln128）在调节配体结合位点几何结构方面的重要性。结合结合研究的结果，我们的发现表明色氨酸侧链在水-脂质界面中的构象动力学和优先分配是调节C1结构域的DAG结合特性的重要因素。

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数字

图1
（a） DAG/PE反应性（1到6）和“非典型”（7和8）C1结构域的初级结构的比较。C1Bα编号用于指示一级结构中的氨基酸位置。DAG/PE响应C1结构域的一致序列（以红色显示）包含参与协调两个结构Zn的残基²⁺离子（以蓝色突出显示）、Pro112、Gly124和Gln128-Gly129图案。C1Bα中强调了DAG结合环β12和β34。KSR-1和Raf-1非典型C1结构域中的环β34有四个氨基酸缺失。^,位置123处的保守Tyr以黄色突出显示。所有C1序列均来自*小家鼠*除了Raf1，它来自智人（b）C1Bα系综平均NMR结构的带状表示。坐标由Ulrich Hommel博士提供。Hommel等人将β2和β3片段鉴定为3-氨基酸β链，并将在本文的其余部分中引用。

图2
NMR检测在DPC/DPS胶束存在下用DOG滴定wt（a）和Y123W C1Bα（b）。在wt和Y123W C1Bα的化学位移时间尺度上，结合过程分别为中-快速和慢-中间。以Leu122为例，插图显示了wt和突变蛋白结合方式的差异。在配体结合与载脂蛋白结合的光谱中观察到大的化学位移扰动。

图3
通过核磁共振和荧光光谱检测wt和Y123W C1Bα的DOG结合曲线。在（a）和（b）中¹H和¹⁵N化学位移变化，Δ¹H和Δ¹⁵N、绘制了几个代表性残留物的DOG浓度函数。使用离解常数K，结合曲线与方程式（1）拟合_天作为全局参数。（c） Y123W C1Bα荧光的归一化变化绘制为DOG浓度的函数。误差条表示三个实验之间的标准偏差。用方程式（8）拟合结合曲线，得到P₀0.23±0.07μM和K_天6.7±16.4 nM。K中的大错误_天表明，在这个蛋白质浓度范围内，结合仍然紧密，我们只能在K上设定0.23μM的上限_天值。

图4
使用化学位移微扰分析和RDC评估wt和Y123W C1Bα之间的结构差异。结构锌²⁺离子在（a）、（c）和（d）中显示为黑色球体。脯氨酸和残基从¹⁵N个-¹H HSQC光谱以灰色显示。在（a）中，计算了Y123W和wt C1Bα的载脂蛋白形式之间的Δ，并进行了彩色编码，映射到C1Bα系综平均NMR结构上。唯一显著的扰动发生在突变位点。（b）比较¹D类_{全日空航空公司}Y123W和wt C1Bα之间的RDC。空圈对应于β12和β34环残基。用线性函数拟合数据会在实验误差范围内产生1.0的斜率，这表明Y123W突变对C1Bα主干施加的扰动最小。在（c）和（d）中，在DOG-结合形式和载脂蛋白形式wt（c）与Y123W C1Bα（d）之间计算Δ。在这两种蛋白质中，与配体相互作用的区域是β12和β34环及其铰链。在（d）中，使用WHATIF将C1Bα的系综平均NMR结构中123位置处的Tyr替换为Trp。

图5
wt（a）和Y123W C1Bα（b）与无配体胶束相互作用表面的映射。与DPC/DPS胶束相互作用的残基的交叉峰与它们在无胶束光谱中的位置相比，要么显著减弱（黄色），要么偏移（橙色）。（a）在wt C1Bα中，包含环β12的残基Tyr123-Gly129和Tyr109的整个环β34参与与胶束的相互作用。（b）在Y123W C1Bα中，β12和β34环以及几个相邻的残基都参与了与胶束的相互作用。在（b）中，使用WHATIF将C1Bα的系综平均NMR结构中123位置处的Tyr替换为Trp。总的来说，突变体中与胶束相互作用的总表面积大于wt C1Bα。

图6
（a）亚ns动力学的比较¹⁵N个-¹wt和Y123W C1Bα中的H主链基团。广义阶参数，*S公司²_{全日空航空公司}*，绘制为主要结构的函数。阴影区域对应于β12和β34环，突变位点用箭头指示。从图中可以明显看出，蛋白质骨架的亚纳秒动力学不受Y123W突变的干扰。（b） R的比较₂^CPMG公司wt和Y123W C1Bα的值。高架R₂^CPMG公司数值表明在μs-ms时间尺度上存在构象交换。在wt C1Bα中，最动态的区域是环β34的C末端铰链，而在Y123W突变体中，它既是β34的铰链，又是β12的C末端铰。

图7
wt和Y123W C1Bα构象动力学的比较。（a）单个残留物在wt（实心圆）和Y123W C1Bα（空心圆）中的弛豫-弥散曲线的比较。为清楚起见，仅显示了14.1特斯拉数据。实线对应于全局拟合，参数汇总在表1中。残留组定义见表1。（b）稳定β12和β34的内部和内部氢键。由于C1Bα核磁共振系综中的环区定义不明确，我们使用了基于C1Bδ（1PTQ）结构的C1Bα同源模型。在wt或突变体C1Bα、Thr113、Leu122、Gly124、Gln128和Gly129中显示可量化色散幅度的五个残基与这些氢键有关。（c） β12和β34环铰链的构象动力学。在wt和突变体中具有可量化分散性的残基被强调。在wt或突变体中具有可量化分散性的残基分别以规则字体和粗体字体显示。

图8
C1Bα中开环和闭环构象的分布。（a）在MD轨迹的2到10 ns间隔期间观察到的wt（黄色条）和Y123W C1Bα（空条）的环路尖端之间的距离直方图。每200 fs测量一次线圈尖端之间的距离。Wt C1Bα显示出广泛的双峰分布，分别以12.5°和9.5°为中心。Y123W C1Bα有两种首选构象：开构象和闭构象，其中心位于12.5°和5°。（b）绑定环打开后，在10至18 ns的轨迹间隔期间观察到的Y123W C1Bα（空棒）的环尖之间的距离直方图。环路尖端之间的距离每200 fs测量一次。为了进行比较，使用wt C1Bα的三个原始8 ns长轨迹生成的直方图显示在同一图上（黄色条）。wt和Y123W C1Bα样品均为开放或部分开放构象，呈双峰分布。沿轨迹观察到开放构象和部分开放构象之间的频繁转换。具有闭环和开环构象的结构的快照分别显示在（c）和（d）中。循环区域以紫色高亮显示。

图9
χ₂wt C1Bα中Gln128侧链的跃迁和氢键。（a） χ₂Gln128的二面角显示为wt C1Bα轨迹之一的时间函数。（b） Gln128形成的氢键轨迹相同。轨迹中任何时间点上给定氢键的存在都用一条垂直线表示。斜体显示的残基具有参与氢键形成的侧链原子。粗体显示的残基参与了氢键的形成。χ₂在4.4和6.5毫微秒时发生的跃迁与Gln128的氢键网络的重排有关。

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