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.2012年1月17日；51(2):586-96.
doi:10.1021/bi2014689。 Epub 2012年1月6日。

PICK1 PDZ结构域中的丝氨酸77是一个受脂质膜结合调节的蛋白激酶Cα磷酸化位点

伊娜·阿曼德鲁普·约翰森 1, 托尔·S·托森, 乌里克·盖瑟, 肯尼思·马德森
附属公司

PICK1 PDZ结构域中的丝氨酸77是一个受脂质膜结合调节的蛋白激酶Cα磷酸化位点

伊娜·阿曼德鲁普·约翰森等。 生物化学. .

摘要

PICK1（与C激酶1相互作用的蛋白质）包含一个N端蛋白质结合PDZ结构域和一个C端脂质结合BAR结构域。PICK1在包括突触可塑性在内的几个生理过程中起着关键作用。然而，关于PICK1自身活性的细胞机制知之甚少。在这里，我们表明PICK1是PKCα（蛋白激酶Cα）和CaMKIIα（Ca（2+）-钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα）的体外底物。通过预测的磷酸化位点突变，我们确定PDZ结构域中的Ser77是PKCα的主要磷酸化位点。Ser77突变使PKCα介导的磷酸化水平降低约50%，而其他7个预测位点突变后未观察到降低。添加脂质小泡使Ser77的磷酸化水平增加了10倍，表明脂质结合对最佳磷酸化至关重要。磷酸化不需要PKCα与PICK1-PDZ结构域的结合，但PDZ结构区肽配体可降低磷酸化的总体水平约30%。磷模拟物S77D降低了eYFP-PICK1在COS7细胞中的细胞溶质聚集程度，从而降低了其脂质结合和/或聚合能力。我们认为，当PICK1与膜泡结合时，PKCα优先在Ser77处磷酸化PICK1，这种磷酸化反过来调节其细胞分布。

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数字

图1
图1。PKCα和CaMKIIα体外磷酸化PICK1
所示凝胶来自代表性实验，证明了三种激酶对PICK1的特异性磷酸化，（左）Commassie染色凝胶和（右）掺入32通过放射自显影术评估P。(A类)PKCα在体外PICK1 WT的磷酸化，包括不含PICK1的对照，以显示背景磷酸化，n=3(B类)CaMKIIα在体外通过在添加PICK1和32P-标记ATP，右侧凝胶上的右侧车道显示剩余背景，n=3(C类)CaMKIIα在体外PICK1 136-416的磷酸化，n=3
图2
图2。通过定点突变筛选磷酸化位点
(A类)PICK1示意图显示了潜在磷酸化位点的近似定位，以及显示NetPhos 2.0预测的磷酸化潜能得分的表格。PKCα突变体的检测在体外磷酸化测定(B类)，CaMKIIα在体外磷酸化测定(C类)。上图为代表性SDS-PAGE，显示32P掺入和昏迷染色。下部面板显示了相对于WT的定量磷酸化水平。数据是n=3-5的平均值±S.E。S77突变导致PKCα介导的磷酸化水平显著降低（S77A:48%±7.7%，n=3，S77D:39%±7.7%；平均值±SE n=4），*表示P<0.05，**表示P<0.01（单因素方差分析，然后进行Dunnett多重比较测试）。每个n代表一个独特的蛋白质批次。
图3
图3。脂质小泡对PKCα介导的PICK1磷酸化的影响
(A类)PICK1 PDZ域的结构模型突出了Ser77的位置（红色）。绿色说明了报告的脂质结合贴片中的CPC基序（Pan等人。EMBO J 26（2007）)，淡蓝色表示结合囊7中的GluA2配体。该模型基于PDB数据库中2PKU的坐标（Pan等人。EMBO J 26（2007）)。(B类)PKCα介导的纯化PICK1与囊泡预孵育的磷酸化。不含囊泡的PICK1 WT（对照组）的磷酸化水平定义为100%，且含有囊泡的PICK1 WT、PICK1 S77D和PICK1 S77A的磷酸化程度相对于不含囊袋的PICK WT的磷酸化级别。PICK1重量：971%±197%，PICK1 S77D:53.1%±9.1%，PICK1 S77A:60.8%±11.6%（平均值±SE）。**表示P<0.01（单向-ANOVA，然后进行Dunnett多重比较试验，n=3）。误差条代表SE值。
图4
图4。突变Ser77不会影响PICK1-PDZ结构域的配体结合亲和力
（A） PICK1-PDZ域的结构模型突出了Ser77相对于PDZ结合囊的位置。蓝色表示GluA2在PDZ装订槽中的C末端，红色表示Ser77，浅紫色表示作为装订袋的一部分并连接到S77的α-螺旋。该模型基于PDB数据库中2PKU的坐标（Pan等人。EMBO J 26（2007）).（B） 、（C）、（D）肽与PICK1-WT、PICK1-S77A和PICK1-S77D结合的荧光偏振竞争结合曲线。将固定浓度的俄勒冈州绿标记DAT肽（OG DAT C13，~6.7 nM）与纯化的PICK1一起孵育，并显示对应于PKCα、GluA2或DAT C12的13-C末端残基的未标记肽浓度。DAT C13（V至D）代表一种阴性对照肽，其中C末端残基从Val变为Asp。数据显示为相对于最大结合OG DAT C13的结合值（三倍平均值±S.E.），代表n=3
图5
图5。PKCα对PICK1的磷酸化不需要PKCα与PICK1 PDZ结构域的结合，而与PDZ结构区的肽结合可降低磷酸化
（A） PKCα介导在体外PICK1 A87L相对于PICK1 WT的磷酸化。纯化的PICK1 WT或A87L被磷酸化在体外通过PKCα，通过SDS-PAGE和磷酸化进行分析，如材料和方法。数据为平均值±SE；PICK1 A87L:92.4%±14.5%，n=3。误差条代表SE。（B）PKCα介导的在体外预先与DAT-LKV肽孵育的PICK1 WT、PICK1 S77D和PICK1 A87L的磷酸化。数据显示为分别与非结合DAT-LKD控制肽（红色虚线）预培养的PICK1 WT、PICK1 S77D和PICK1 A87L的磷酸化水平标准化。PICK1重量：70.5%±9.6%，PICK1 S77D:75.9%±6.4%，PICK1A87L:94.6%±6.9%（平均值±SE，n=3）。*在一个样本t检验中，表示P<0.05。
图6
图6。eYFP-PICK1在COS7细胞中的聚集及囊泡结合
（A） 代表性图片显示，与瞬时转染COS7细胞中的eYFP-PICK1 S77D相比，eYFP-PICK1的聚集性降低。箭头指向簇。（B） 与S77D相比，WT聚类的量化。通过计算含有至少一个eYFP-PICK1或eYFP/PICK1 S77D胞浆簇的细胞分数来量化聚类。簇被定义为强度为eYFP平均细胞溶质强度1.5倍的区域。数据是从三个独立转染获得的平均值±SE。每个样本中至少拍摄了10张照片，并计数了大约50个细胞*双侧学生t检验P<0.01，n=3，误差条代表SE值。（C） western blot检测表达水平的量化。eYFP-PICK1水平归一化为肌动蛋白，S77D水平计算为平行转染的WT，n=5，其中每个n代表一个独立转染。（D） PICK1 WT（左）和PICK1 S77D（右）脂囊下拉的代表性凝胶。在超速离心和通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析沉淀（P）和上清液（S）级分之前，将纯化的PICK1 WT或S77D与脂质囊泡孵育。装载所有颗粒和1/5上清液。容器=小泡。（E） 脂质结合的定量在体外囊泡下拉试验。数据为囊泡结合分数（平均值±SE，n=3）。囊泡结合分数计算如下(弹丸+车辆)秒总蛋白质+车辆负极(弹丸负极车辆)秒总蛋白质负极车辆.
图7
图7。PICK1蛋白激酶Cα磷酸化的调控模型
我们的数据表明，PKCα介导的磷酸化是由PICK1的细胞定位和PDZ结合袋占据之间的相互作用动态控制的。当PICK1不与膜结合，并且肽配体结合在PDZ结构域时，PICK1的磷酸化水平很低。当PICK1既不与膜结合，也没有PDZ配体与PDZ结合囊结合时，PICK1的磷酸化水平较低。当蛋白与膜结合，而没有肽配体与PDZ结合囊结合时，PICK1的磷酸化程度最高。磷酸化可能导致PICK1从膜上脱脂，并可能促进其细胞重新分布。
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