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.2013年6月7日；288(23):16905-16915.
doi:10.1074/jbc。M113.467456。 Epub 2013年4月15日。

静电和疏水相互作用差异调节蛋白激酶CαC2结构域的膜结合动力学

安吉拉·斯科特 1, Corina E Antal公司 1, 亚历山大·牛顿 2
附属公司

静电和疏水相互作用差异调节蛋白激酶CαC2结构域的膜结合动力学

安吉拉·斯科特等。 生物化学杂志. .

摘要

常规蛋白激酶C（PKC）同工酶的细胞激活是通过其C2结构域与膜的结合来启动的，以响应细胞内Ca（2+）的升高。继C2结构域介导的膜募集之后，C1结构域结合其膜包埋配体二酰甘油，从而激活PKC。在这里，我们探讨了C2结构域控制PKC激活初始步骤的分子机制。利用停流荧光光谱法测量缔合和解离速率常数，我们表明疏水相互作用是C2结构域与阴离子膜结合的主要驱动力，而静电相互作用在膜保留中占主导地位。具体来说，Ca（2+）结合环中选择疏水性或选择碱性残基的突变通过不同的机制降低膜亲和力；疏水残基的突变主要影响缔合速率常数，而带电残基的变异则影响解离速率常数。活细胞成像显示，将这些突变引入全长PKCα中不仅减少了Ca（2+）依赖性向质膜的易位，而且通过削弱C2结构域的质膜传感作用，导致佛波酯触发的PKCα重新分布到其他膜，如高尔基体。这些数据强调了C2结构域在将传统PKC同工酶驱动到质膜上的关键作用，并揭示了通过改变该模块对膜的亲和力，不仅可以调节传统PKC信号的振幅，还可以调节其亚细胞位置。

关键词：C2域；钙；钙信号；钙结合蛋白；膜移位；蛋白激酶C（PKC）；信号转导。

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数字

图1。
图1。
PKCαC2结构域的结构。A类丝带PKCα的C2结构域图（基于Gómez-Fernández及其同事（22）的结构）显示了本研究中突变的残基。碱性残留物如所示蓝色（Ca上的Arg-216、Arg-249和Arg-2522+-结合环和位于远端的Lys-268）和疏水残基如所示红色（Ca上的Leu-191、Trp-247和Trp-2452+-结合环和远端Trp-274）。
图2。
图2。
C2结构域上的碱性或疏水性到中性突变影响其在脂质泡上的补充和保留。 A类用FRET缔合停流荧光光谱法测定纯化C2结构域（野生型、R216A、R249A、R252A、K268A、W245A、W247A、L191A或W274A）与阴离子磷脂囊泡的结合。C2域蛋白（0.2–0.5μ米)在200μ米钙2+和150米米NaCl，如“实验程序”所述。丹磺酰基排放量随时间变化而测量k个光突发事件采用单相拟合确定。这个k个在根据线性图的斜率计算k个光突发事件 与囊泡浓度。数据表示加权平均值±S.E(误差线)3-7个独立实验。B类用FRET解离停流分析测定纯化C2结构域（野生型、R216A、R249A、R252A、K268A、W245A、W247A、L191A或W274A）与阴离子磷脂囊泡的结合。C2域蛋白（0.2–0.5μ米)用丹磺酰标记的磷脂囊泡（PS/PC/dPE，35:60:5摩尔比）孵育至少15分钟。然后，在200μ米钙2+和150米米氯化钠。丹磺酰的排放量是作为时间的函数进行测量的k个远离的采用单相拟合确定。数据表示3-7个独立实验的加权平均值±S.E。
图3。
图3。
C2域突变体膜结合动力学的离子强度敏感性。 A类，纯化C2结构域（野生型、R216A、R249A、R252A、W245A、W2.47A或L191A）与阴离子磷脂囊泡的结合通过FRET关联停流分析测定，如图2图例所示A类。除所示NaCl浓度增加外，其他条件均相同。数据表示加权平均值±S.E(误差线)3-7个独立实验。B类，纯化的C2结构域（野生型、R216A、R249A、R252A、K268A、W245A、W247A、L191A或W274A）与阴离子磷脂囊泡的结合通过FRET离解阻止流分析测定，如图2所示B类。除所示NaCl浓度增加外，其他条件均相同。数据表示3-7个独立实验的加权平均值±S.E。C类，的K（K）d日计算值是从k个在和k个远离的从FRET关联和解离实验中获得A类和B类数据表示3-7个独立实验的加权平均值±S.E。
图4。
图4。
C2结构域上的双电荷对中性残基突变影响其在脂质囊泡的募集和滞留。纯化的C2结构域（野生型、R216A/R249A、R216A/R252A或R249A/R252A）与阴离子磷脂囊泡的结合通过FRET缔合停流分析进行测量k个在如图2图例所示确定A类数据表示加权平均值±S.E(误差线)3-7个独立实验。B类用FRET离解阻止流分析法测定纯化C2结构域（野生型R216A/R249A、R216A/R252A或R249A/R252A）与阴离子磷脂囊泡的结合，并用荧光定量分析法测定C2结构域与阴离子磷脂的结合k个远离的如图2图例所示确定B类数据表示3-7个独立实验的加权平均值±S.E。
图5。
图5。
增加Ca2+影响C2结构域在脂质囊泡的募集和滞留。 A类在20μ米（低）或200μ米（高）Ca2+通过FRET关联停流分析进行测量，并且k个在如图2图例所示确定A类数据表示3-7个独立实验的加权平均值±S.E。B类在20或200μ米钙2+通过FRET离解阻止流分析测量，并且k个远离的如图2图例所示进行测量B类.加权平均值是根据三个或四个独立实验计算得出的。C类，的数据k个在在中获得A类和k个远离的在中获得B类用于计算K（K）d日计算.
图6。
图6。
碱性和疏水性至中性残基突变对细胞中PKCα易位的影响。表达YFP标记PKCα-WT的COS7细胞中PKC易位(红色痕迹)，PKCα-W247A(绿色痕迹)或PKCα-R249A(蓝色痕迹)通过测量PKC转位到靶向质膜的CFP引起的FRET变化来监测(A类)和高尔基(B类). 在指定时间添加Thapsigargin以提高细胞内Ca2+PDBu被添加到最大易位PKC中。按照“实验程序”对痕迹进行分析；数据表示平均值±S.E(误差线)至少三个独立实验。
图7。
图7。
显示PKC由C2域进行空间调控的模型。在激动剂刺激下，Ca的结合2+(灰色圆圈)至PIP2-传感C2域(黄色的)导致传统PKC与PIP的相关性2-富集质膜；这种依赖C2的膜结合主要由疏水相互作用驱动，而保留主要由静电相互作用驱动。一旦在膜上，C1结构域(橙色)找到它的膜包埋配体，二酰甘油(DAG公司)产生高亲和力的膜相互作用，释放自抑制假底物片段(绿色矩形)来自激酶结构域(青色圆圈)从而激活(右上角PKC物种）。破坏C2结构域的膜结合特性会导致传统PKC失去质膜识别能力，并通过现在占主导地位的C1结构域，在更丰富的高尔基体膜表面重新定向为二酰基甘油/佛波酯(右下角PKC的种类）；这种结合模式模仿了新型PKC同工酶的结合模式，这种同工酶没有Ca2+-绑定C2域。值得注意的是，新型PKC同工酶的C1b结构域与二酰甘油结合的亲和力比传统PKC同功酶的C1b结构域高2个数量级，因此，新同工酶对激动剂诱发的二酰甘油增加没有必要预先靶向膜。尽管受损的PKC C2结构域突变体被重定向到高尔基体，但它们对二酰基甘油（而不是佛波酯）的亲和力可能太低，无法在激动剂刺激后显著激活。
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