生物化学。作者手稿；PMC 2013年1月17日提供。
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PICK1 PDZ结构域中的丝氨酸77是一个受脂质膜结合调节的蛋白激酶Cα磷酸化位点
丹麦哥本哈根大学帕努姆研究所神经科学与药理学系伦德贝克基金会纳米医学生物膜中心分子神经药理学实验室，2200哥本哈根N
摘要
PICK1（与C激酶1相互作用的蛋白质）包含一个N端蛋白质结合PDZ结构域和一个C端脂质结合BAR结构域。PICK1在包括突触可塑性在内的几个生理过程中起着关键作用。然而，关于PICK1自身活性的细胞机制知之甚少。这里我们表明PICK1是一种基底在体外如前所示，PKCα（蛋白激酶Cα）和CaMKIIα（钙2+-钙调素依赖性蛋白激酶IIα）。通过预测的磷酸化位点突变，我们确定PDZ结构域中的Ser77是PKCα的主要磷酸化位点。Ser77突变使PKCα介导的磷酸化降低约50%，而其他7个预测位点突变后未观察到降低。添加脂质小泡使Ser77~10倍的磷酸化增加，表明脂质结合对最佳磷酸化至关重要。磷酸化不需要PKCα与PICK1-PDZ结构域的结合，但PDZ结构区肽配体可减少约30%的总磷酸化。磷模拟物S77D降低了COS7细胞中eYFP-PICK1的细胞溶质聚集，从而可以想象其脂质结合和/或聚合能力。我们认为，当PICK1与膜泡结合时，PKCα优先在Ser77处磷酸化PICK1，这种磷酸化反过来调节其细胞分布。
关键词：PICK1、PDZ结构域、磷酸化、BAR结构域蛋白、脂质结合
PICK1（Protein Interacting with C Kinase 1）是一种支架蛋白，首次被鉴定为PKCα（蛋白激酶Cα）的相互作用伙伴(1). 功能研究表明，PICK1在突触可塑性的分子机制中起着关键作用(2). 此外，PICK1与精神分裂症等多种病理生理过程有关(三,4)、神经病理性疼痛(5,6)，可卡因上瘾(7)，上瘾复发(8)，脑缺血(9,10)，乳腺癌(11)和精子发生缺陷(12,13).
PICK1包含N-末端蛋白结合PDZ（PSD-95/Discs-large/ZO-1）结构域和C-末端脂质结合BAR（Bin/aphephysin/Rvs）结构域(14). 据报道，PICK1的PDZ结构域除了与PKCα相互作用外，还与40多种蛋白质相互作用(15,16). 大多数已知配体是不同膜蛋白的C末端，例如AMPA（α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸）型离子型谷氨酸受体的GluA2/A3亚基(17)，代谢型谷氨酸受体mGluR7(18)，kainate型离子型谷氨酸受体(19)、ASIC（酸性感应离子通道）I和II(20)以及各种神经递质转运体，包括多巴胺转运体（DAT）(21,22)和GLT1b谷氨酸转运体(23).
BAR结构域代表二聚体α-螺旋模，具有感知和施加膜曲率的独特能力(24-26). 因此，PICK1可能通过曲率依赖性的脂膜相互作用发挥其与几个PDZ结合伙伴的功能。有趣的是，PDZ结构域本身被牵涉到介导脂质膜结合(27). 也有强有力的证据表明，PICK1 BAR结构域的脂质结合能力是自动抑制的，这种抑制的释放需要配体结合到PDZ结构域并结合PICK1的膜募集(28,29). PICK1BAR结构域进一步介导PICK1的二聚体化，从而使蛋白质能够将两个PDZ结构域结合伙伴靠近(16),
越来越多的研究对PICK1各种功能的细胞机制提供了越来越多的见解。在突触可塑性中，PICK1被认为介导含有AMPA受体的突触后GluA2的表面表达降低，这是LTD（长期抑郁）的关键过程(30,31). PICK1也被认为介导mGluR7突触前聚集(32)通过PKCα促进mGluR7的磷酸化和表面稳定(33). 与ASIC相关，PICK1似乎对PKCα介导的ASIC电流和血浆膜表达的调节至关重要(34,35). ASIC均参与海马突触可塑性的过程(36)以及痛觉过敏等病理过程(37). 此外，还建议PICK1调节其他相互作用伙伴（如GLT1b和DAT）的表面表达(21,23).
尽管PICK1参与多种不同的细胞功能，但对控制PICK1活性的调控机制知之甚少。PICK1已被证明是PKCα的底物(1)并建议在钙激活后磷酸化2+/钙调素依赖性激酶IIα（CaMKIIα），尽管未显示直接磷酸化(38). 这里我们证明PICK1确实是PKCα和CaMKIIα的直接底物。通过应用系统性定点突变策略，我们将PICK1 PDZ域中的Ser77定位为在体外PKCα位点。我们发现，脂质小泡的存在显著增加了PKCα介导的PICK1磷酸化，而肽配体与PDZ结构域的结合降低了PICK1的磷酸化。最后，我们发现通过将残基突变为天冬氨酸（S77D）来模拟Ser77的磷酸化状态显著减少转染COS7细胞中eYFP（增强黄色荧光蛋白）-PICK1的自发聚集，与脂质结合和/或聚合可能受损一致。总之，数据确定了PICK1中的PKCα磷酸化位点，该位点影响PICK1分子的细胞分布，从而调节PDZ结合伙伴的功能。
材料和方法
分子生物学
Quick Change®方法（Stratagene，La Jolla，CA，USA）用于单氨基酸替换。我们使用pET41质粒（Stratagene）作为模板，编码GST（谷胱甘肽-S-转移酶）偶联大鼠PICK1（GST-PICK1），如前所述(39)或编码eYFP-PICK1的peYFP-C1质粒（Clontech）(28). GST-PICK1（136-416）与GST-PICK1类似，是通过从pciNEO载体中扩增大鼠PICK1的残基136-416而产生的（Kumlesh Dev博士的馈赠）。引物引入了一个N端MunI和一个C端AvrII位点，用于将片段克隆到pET41载体中。所有引物均来自丹麦奥胡斯的DNA技术A/S。所有突变序列均通过限制性内切酶图谱和DNA测序验证，并转化为BL21 DE3 pLysS（Novagen）。
蛋白质纯化
如前所述纯化GST-PICK1野生型（WT）或突变体和GST-PICK1（136-416）(39)简单地说，用含有34μg/mL氯霉素（MP Biomedicals）和50μg/mL卡那霉素（Invitrogen）的50 mL LB培养基接种大肠杆菌BL21 DE3 pLys S包含编码适当PICK1序列的pET41载体。将细菌在37°C下培养过夜，然后稀释到1 L含有34μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，并在30°C下生长。当获得正确的OD（600 nm时为0.6-1.0）时，通过添加最终浓度为0.5 mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷（Sigma-Aldrich）来诱导蛋白质表达。在30°C下诱导3小时后，将细菌以8000×g的浓度造粒12分钟。将颗粒重新悬浮在25 mL冰冷裂解缓冲液（50 mM Tris碱pH 7.4（安格斯化学公司）、125 mM NaCl（默克公司）、1%Triton X-100（Sigma-Aldrich）、20μg/mL DNAse 1（Sigma-Aldrich）和1 mM二硫崔醇（DTT）（Sigma Aldrich公司））中的冰上。将裂解液在−80°C下冷冻40分钟，然后在4°C水浴中再次解冻，以实现细菌的适当溶解。随后将细胞碎片以47000×g的浓度造粒30分钟，并将上清液转移到新试管中。对于每批，在洗涤缓冲液（50mM Tris、125mM NaCl、0.01%Triton X-100和1mM DTT）中洗涤0.75mL谷胱甘肽琼脂糖™4B珠（Amersham Bioscience）3次，然后加入上清液中。GST偶联蛋白可以在4°C下连续旋转培养90分钟，从而与谷胱甘肽珠结合。接下来，以3000×g的速度造粒珠子5分钟，并用洗涤缓冲液洗涤三次。在洗涤缓冲液中使用0.1%的Triton X-100，而不是用于荧光偏振测定的纯化蛋白质的0.01%。为了从GST结构域和偶联珠中分离蛋白质，将珠重新悬浮在含有0.3 U凝血酶（Novagen）的0.5 mL洗涤缓冲液中，转移到Bio-Spin®一次性色谱柱（Bio-Read）中，并在4°C下旋转培养过夜。
体外磷酸化-PKCα
对于每个反应，将约3μg纯化蛋白在蛋白洗涤缓冲液中稀释至最终体积10μL，然后与10μL反应缓冲液（120 mM Tris pH 7.5，60 mM MgCl）混合2（默克），6 mM氯化钙2（默克公司），5μL PKC脂质激活剂（Upstate，Frederikssund，丹麦）和10 ng PKCα（Upstate）。最后，2μCiγ-32添加P ATP（Amersham Bioscience，Pb108），并将混合物在30°C下培养30分钟。将混合物置于冰上并添加10μL SDS-PAGE负载缓冲液（200 mM Tris-HCl，pH=6.8，400 mM DTT，8%SDS，0.4%溴酚蓝，40%甘油），停止反应。样品通过10%SDS-PAGE进行分析。随后去除含有所有未结合ATP的凝胶前部，并在蒸馏水中清洗凝胶3次10分钟，然后用GelCode®蓝色染色试剂（Thermo Scientific）染色。凝胶最终用塑料包裹，放在带存储荧光屏的盒式磁带中（Amersham Bioscience），放置一夜。用分子成像仪FX（BioRad）扫描屏幕。用Fluor-S™MultiImager（BioRad）扫描考马斯染色凝胶。使用Discovery Series Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.5（BioRad）测定蛋白质带和磷酸化带的密度。计算磷酸化密度和蛋白质密度之间的比率，并将其与PICK1 WT测定的比率（定义为100%）进行比较。
体外磷酸化-CaMKIIα
对于每个反应，将约3μg纯化蛋白在蛋白洗涤缓冲液中稀释至最终体积15μL。反应缓冲液（100 mM Hepes（Sigma-Aldrich），20 mM MgCl2，1 mM氯化钙2混合2 mM DTT、200μg/mL BSA（Sigma-Aldrich）、0.6 mM ATP（Sigma-Aldrich。然后将15μL反应缓冲液与15μL蛋白质混合，然后添加2μCiγ-32P ATP并在30°C下培养10分钟。将混合物置于冰上并添加10μL SDS-PAGE负载缓冲液，停止反应。SDS-PAGE程序与PKCα测定所述相同。除了从PICK1磷酸化的密度中减去CaMKIIα自身磷酸化带的密度外，计算结果与PKCα分析的解释一致。
PKCα磷酸化前与囊泡或肽预孵育
为了研究囊泡结合对PKCα介导的PICK1磷酸化的影响，将该蛋白与3μg由Folch组分I型（SigmaAldrich B1502）制备的囊泡在10μl蛋白洗涤缓冲液中预孵育，并挤出以获得100nm的直径。将混合物在冰上预孵育30分钟，以相同方式处理无小泡的对照样品。为了研究肽结合的影响，在每个样品中添加DAT C13或DAT C13V到D（有关肽的描述，请参见荧光偏振部分），最终浓度为67μM，并在添加反应缓冲液、激酶活化剂、PKCα和2μCiγ之前，在30°C下孵育10分钟-32P ATP（Amersham Bioscience，第108页）。
荧光偏振分析
所有肽均购自Schafer-N（丹麦哥本哈根）。这些肽分别对应于人类DAT、PKCα和GluA2的13个C末端残基。除了DAT WT肽（DAT C13）外，还使用了C末端Val被天冬氨酸取代的突变体（DAT C1 3 V至D）。日期C13:EVRQFTLRHWLKV；数据C13 V至D：EVRQFTLRHWLKD；PKCαC13:NPQFVHPILQSAV；GluA2 C13:EGYNVYGIESVKI。荧光偏振结合实验如所述(39). 简单地说，用DAT C13进行饱和实验，附加N端半胱氨酸残基与荧光团Oregon Green 488（Schafer-N）偶联，称为OrG DAT C13。在96孔微量滴定板（黑色，½面积，非结合表面，康宁）中进行分析。将纯化的蛋白质稀释在100μL TBS（50 mM Tris，pH 7.4，125 mM NaCl）中，得到1/3对数稀释行，每个蛋白质有12个点，跨越40年。将OrG DAT C13添加到每个孔中，使最终浓度为6.7 nM，将平板在冰上培养10分钟，然后在变色龙荧光偏振阅读器（Hidex）中使用488 nM激发滤波器和535 nM长通发射滤波器以FP模式读取读数。根据方程式FP=（I）计算FPv（v）-克*I小时)/（一）v（v）+克*I小时)，我v（v）是垂直面上的强度和I小时水平面上的强度，视在Kd日由方程式决定
根据表观K计算不同PICK1变体的浓度d日从饱和结合实验中获得，因此在每个实验中使用等量的肽结合蛋白。竞争分析使用96 well微量滴定板进行，每个结合曲线使用12个孔。将适当稀释度的45μL蛋白质添加到在45μL TBS中稀释的1/3对数稀释排肽中。最后添加10μL 0.067μM DAT OrG，将平板在冰上培养10分钟，然后读取。在Prism 5.0（GraphPad Software Inc.，San Diego，CA）中通过非线性回归分析分析获得的荧光偏振值，并按所述计算肽的亲和力(39).
囊泡下拉试验
如前所述制备脂质膜(40)从Folch组分I型开始，在300 mM D-山梨醇中再水化，最终浓度为50 mg/ml。通过孔径为100 nm的过滤器对样品进行超声、涡流和挤压15次。对于下拉，将10μM蛋白质与10 mg/ml小泡在150μl TBS（Tris-Buffered Saline pH 7.4）中培养，其中含有1mM DTT，在冰上培养30分钟，并在4°C下以140.000xg的浓度旋转15分钟。将上清液转移到新的试管中，用1 mM DTT将颗粒重新悬浮在150μl TBS中，用10%SDS PAGE分析上清液和颗粒，用GelCode®Blue Stain试剂（Thermo Scientific）染色，并用AlphaEaseFC软件（Alpha Innotech Corporation）定量相对蛋白水平。
细胞培养和转染
COS7细胞在DMEM（Dulbecco改良的Eagle's培养基）1965中生长，含有10%胎牛血清（HyClone，Logan，USA）、2 mmol/L谷氨酰胺和0.01 mg/mL庆大霉素（Invitrogen），37°C，在腐殖化的5%CO中2大气。转染作为反向转染进行，即0.1μg C1-eYFP-PICK1质粒、0.3μl lipo2000（Invitrogen）和47μl OptiMEM（Invit罗gen）的混合物被发现于8孔Lab-Tek室盖玻璃（#155411，Nunc）的孔中，培养20分钟，然后在50μl OptiPEM中添加40000个细胞。5小时后，将培养基更换为正常生长培养基。通过荧光显微镜（卡尔蔡司TM210）分析转染后24-48小时eYFP-PICK1在活细胞中的细胞分布。使用40X油物镜和YFP二向色滤光片（514nm激发）采集图像。使用MetaMorph（Meta Imaging，Universal Imaging，V.4.6）进行图像采集，在整个实验中固定设置。使用ImageJ软件分析图像。手动进行含有簇的细胞计数。簇被定义为一个强度比细胞质中平均强度高1.5倍的区域。至少拍摄了10张照片，并对每个样本中的大约50个细胞进行了计数。
蛋白质印迹
COS7细胞（2×106)将转染C1-eYFP-PICK1质粒的人在1 mL TrisHCl中进行裂解，pH 7.4，含1%（v/v）Triton X-100，5 mM n-乙基-马来酰亚胺和蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnosics）。在4°C下溶解30分钟后，通过在16000 x g下于4°C离心20分钟来除去细胞。测定上清液中的蛋白质浓度，并用上述10%SDS-PAGE分析每个样品中等量的蛋白质。在PVDF膜上进行印迹后，将膜分裂成两个约50kDa的分子，在顶部用1:1000兔抗GFP（Abcam ab 290）检测到eYFP-PICK1，在下部用1:2000兔抗肌动蛋白（Sigma A2066）检测到肌动蛋白，然后用1:5000二级HRP结合抗体（Pierce）检测到。使用ECL试剂盒（Amersham）和FluorChem HD2（Alpha Innotech Corporation）以及AlphaEaseFC软件（Alpha-Inotech公司）对信号进行量化。将eYFP-PICK1的水平归一化为相应的肌动蛋白水平，然后计算eYFP/PICK1 S77D的水平相对于eYFP_PICK1 WT。
结果
PICK1是PKCα和CaMKIIα的体外底物
体外纯化PICK1的磷酸化实验证实PICK1是PKCα的底物()如前所述(1). 磷酸化样品的SDS-PAGE显示[32P] 用BlueGel染色显示与纯化PICK1（MW～50 kDa）洗脱相对应的标记带洗脱().体外磷酸化实验还表明，PICK1至少是CaMKIIα的底物在体外(). CaMKIIα是自磷酸化的，由于CaMKILα和PICK1的分子大小相似，因此不可能通过SDS-PAGE分离这两种蛋白质。因此，在PICK1磷酸化之前，CaMKIIα与未标记的ATP预先孵育，以最小化CaMKIIIα自动磷酸化的背景信号(). 为了最终将信号从PICK1和CaMKIIα磷酸化中分离出来，实验还使用N-末端截短的PICK1（136-416）进行，该PICK1将通过SDS-PAGE从CaMKIIIα中分离出来().共同证明PICK1是CaMKIIα的底物在体外磷酸化至少在一定程度上发生在残基135以外。
PKCα和CaMKIIα对PICK1的体外磷酸化作用图示凝胶来自代表性实验，该实验证明PICK1通过三种激酶特异性磷酸化，（左）Commassie染色凝胶和（右）掺入32通过放射自显影术评估P。(A类)PKCα在体外PICK1 WT的磷酸化，包括不含PICK1的对照，以显示背景磷酸化，n=3(B类)CaMKIIα在体外通过在添加PICK1和32P-标记ATP，右侧凝胶上的右侧车道显示剩余背景，n=3(C类)CaMKIIα在体外PICK1 136-416的磷酸化，n=3
PICK1中PKCα磷酸化位点的鉴定
为了绘制PICK1中PKCα磷酸化位点，我们首先使用NetPhos预测程序确定了推定位点(41). 我们选择分析八个丝氨酸或苏氨酸残基作为磷酸化位点的预测磷酸化概率得分最高（>0.85）。概率分数显示在以及PICK1示意图中潜在磷酸化位点的位置。所有八个残基一次被一个天冬氨酸取代，产生的突变体在大肠杆菌.纯化的突变体通过在体外磷酸化和磷酸化水平通过磷酸化成像分析定量。显示了通过PKCα在3-5个实验中对PICK1突变体的相对磷酸化水平的量化。与PICK1 WT相比，用天冬氨酸替代Ser77显著降低了磷酸化（39%±7.7%，p<0.01，n=4）。将Ser77突变为丙氨酸也可看到类似的降低（47%±7.7%，p<0.05，n=3）(). 其他替代均未导致磷酸化与WT显著不同。这强烈表明PICK1 PDZ结构域中的Ser77是PKCα磷酸化位点。此外，减少的程度表明Ser77至少是最显著的PKCα位点在体外.
通过定点突变筛选磷酸化位点(A类)PICK1示意图显示了潜在磷酸化位点的近似定位，以及显示NetPhos 2.0预测的磷酸化潜能得分的表格。PKCα突变体的检测在体外磷酸化测定(B类)，CaMKIIα在体外磷酸化测定(C类). 上部面板为代表性SDS-PAGE，显示32P掺入和昏迷染色。下部面板显示了相对于WT的定量磷酸化水平。数据是n=3-5的平均值±S.E。S77突变导致PKCα介导的磷酸化水平显著降低（S77A:48%±7.7%，n=3，S77D:39%±7.7%；平均值±SE n=4），*表示P<0.05，**表示P<0.01（单因素方差分析，然后进行Dunnett多重比较测试）。每个n代表一个独特的蛋白质批次。
根据Olsen等人（Olsen et al，2006），我们试图在从转染的HEK293细胞中分离出N末端标记有增强黄色荧光蛋白（eYFP）的PICK1后，通过质谱分析，验证Ser77在细胞环境中也代表PKCα磷酸化位点。然而，由于PICK1一级结构中Ser77周围区域的赖氨酸/精氨酸含量异常高，我们无法分离出含有Ser77的肽，因此无法确定其细胞磷酸化状态（数据未显示）。
上述Ser/Thr突变体以及天冬氨酸取代的Thr289也在CaMKIIα中进行了测试在体外磷酸化测定。Netphos未预测T289，但定位于CaMKIIα共识站点(42). 然而，这些取代都没有降低CaMKIIα在体外磷酸化().
囊泡结合通过PKCα增加PICK1的磷酸化PICK1可以通过其BAR结构域与脂质膜结合(14)并通过PDZ结构域的假定脂质结合贴片(27). 因为PKCα也能与脂质膜结合(43)我们设想，脂质膜的存在可以作为支架，通过将PKCα和PICK1带到膜上，促进磷酸化。此外，已知一些PKC底物的亲和力可以通过脂质诱导的α-螺旋形成来增强(44). 相反，Ser77位于报告的脂质结合贴片（CPC基序）附近，可以被脂质膜结合屏蔽(). 因此，我们决定测试脂质小泡的存在是否会影响PKCα对PICK1的磷酸化。添加囊泡（从总脑脂中制备并挤压得到最大直径为100 nm的囊泡）显著增加了PKCα对PICK1的磷酸化（971%±197%，P<0.01，n=3）(). 此外，在磷模拟物PICK1 S77D中，这种作用几乎被消除。这种减少可能是由于PICK1在带正电的脂质结合贴片附近引入负电荷而导致囊泡结合减少，或者直接去除对囊泡结合敏感的磷酸化位点。为了区分这些可能性，我们还测试了S77A替代物以模拟Ser77的非磷酸化状态。S77A的引入同样减少了磷酸化，使得观察到的PICK WT和S77替代突变体之间的差异不太可能是由突变体的囊泡结合减少引起的。因此，我们得出结论，与小泡孵育增加在体外PKCα对PICK1的磷酸化，这种影响主要是由于Ser77的磷酸化增加所致。
脂质小泡对PKCα介导的PICK1磷酸化的影响(A类)PICK1 PDZ域的结构模型突出了Ser77的位置（红色）。绿色说明了报告的脂质结合贴片中的CPC基序（Pan等人。EMBO J 26（2007）)，淡蓝色表示结合囊7中的GluA2配体。该模型基于PDB数据库中2PKU的坐标（Pan等人。EMBO J 26（2007）). (B类)PKCα介导的纯化PICK1与囊泡预孵育的磷酸化。不含囊泡的PICK1 WT（对照组）的磷酸化水平定义为100%，且含有囊泡的PICK1 WT、PICK1 S77D和PICK1 S77A的磷酸化程度相对于不含囊袋的PICK WT的磷酸化级别。PICK1重量：971%±197%，PICK1 S77D:53.1%±9.1%，PICK1 S77A:60.8%±11.6%（平均值±SE）。**表示P<0.01（单向-ANOVA，然后进行Dunnett多重比较试验，n=3）。误差条代表SE值。
取代Ser77不会影响PICK1-PDZ结构域的肽结合能力
Ser77定位于PICK1 PDZ域，因此是绑定PICK1的许多交互伙伴的极端C末端的域(). 虽然Ser77定位于远离结合沟的地方，但我们想测试该残基的磷酸化是否会影响PDZ结构域的结合能力。为了测试这一点，我们采用了我们之前描述的荧光偏振结合分析，该分析基于检测荧光标记肽配体与溶液中纯化的PICK1的结合(39). 作为荧光标记配体，我们使用了一种相当于多巴胺转运体（OrG DAT C13）13个C末端残基的肽，该肽显示了PICK1 PDZ结构域的最高亲和力(39). 我们使用三种未标记的肽进行了竞争结合分析，这三种肽已知能结合PICK1 PDZ结构域，即分别相当于DAT（DAT C13）、GluA2（GluA2 C13）和PKCα（PKCαC13）的C末端的肽。作为阴性对照，我们使用了一种DAT肽，其中最后一个残基被改变为天冬氨酸（DAT C13 V到D），这中断了与PICK1 PDZ结构域的相互作用(39). 在，Y轴显示荧光偏振（FP）（任意单位，mP），其反映了荧光标记肽在溶液中与PICK1结合时的旋转扩散。随着荧光标记示踪剂从较大的蛋白质中转移，增加未标记肽的浓度会降低FP值，从而增加其旋转扩散。三种肽（DAT C13、GluA2 C13和PKCαC13）在S77D和S77A中均抑制OrG DAT C12的结合，其效力与WT中相同(和). 因此，侧链的去除或Ser 77的模拟磷酸化都不会影响配体与PDZ结构域的结合。
突变Ser77不会影响PICK1-PDZ结构域的配体结合亲和力（A） PICK1-PDZ域的结构模型突出了Ser77相对于PDZ结合囊的位置。蓝色表示GluA2在PDZ装订槽中的C末端，红色表示Ser77，浅紫色表示作为装订袋的一部分并连接到S77的α-螺旋。所提出的模型基于PDB数据库中2PKU的坐标（Pan等人。EMBO J 26（2007）).（B） 、（C）、（D）肽与PICK1-WT、PICK1-S77A和PICK1-S77D结合的荧光偏振竞争结合曲线。将固定浓度的Oregon Green标记的DAT肽（OG DAT C13，~6.7 nM）与纯化的PICK1和对应于PKCα、GluA2或DAT C13的13-C末端残基的指示浓度的未标记肽一起孵育。DAT C13（V至D）代表一种阴性对照肽，其中C末端残基从Val变为Asp。数据显示为相对于最大结合OG DAT C13的结合值（三倍平均值±S.E.），代表n=3
表1
PICK1-WT和PICK1-S77A/D的结合亲和力。
| 数据C13 | 谷氨酸A2 C13 | PKCαC13 | 数据C13 V至D |
|---|
| 重量 | 1.05 [0.987;1.14] | 7.6 [6.4;9.1] | 49 [38;63] | ND（无损检测） |
| S77A系列 | 1.5 [1.4;1.6] | 9.8 [8.0;12] | 28 [27;29] | ND（无损检测） |
| S77D系列 | 1.1 [1.0;1.3] | 8.8 [8.1;9.6] | 29 [25;33] | ND（无损检测） |
PKCα对PICK1的磷酸化不受PKCα与PICK1-PDZ结构域结合的影响
PKCα的C末端是PICK1-PDZ结合囊的配体(15). 因此，我们研究了PKCα与PICK1-PDZ结合囊的可能结合是否是PICK1磷酸化所必需的。在这个实验中，我们使用了一个PICK1突变体（A87L），它不能容纳PDZ结合囊中的肽(39). PICK1 A87L被磷酸化至与PICK1 WT相同的水平（92%±14%，N.S.，N=4）()表明PKCα与PICK1 PDZ结构域的结合对PICK1的磷酸化并不重要。
PKCα对PICK1的磷酸化不需要PKCα与PICK1 PDZ结构域的结合，而与PDZ结构区的肽结合可降低磷酸化（A） PKCα介导在体外PICK1 A87L相对于PICK1 WT的磷酸化。纯化的PICK1 WT或A87L被磷酸化在体外通过PKCα，通过SDS-PAGE和磷酸化进行分析，如材料和方法。数据为平均值±SE；PICK1 A87L:92.4%±14.5%，n=3。误差条代表SE。（B）PKCα介导在体外预先与DAT-LKV肽孵育的PICK1 WT、PICK1 S77D和PICK1 A87L的磷酸化。数据显示为分别与非结合DAT-LKD对照肽预孵育的PICK1 WT、PICK1 S77D和PICK1 A87L的磷酸化水平标准化的磷酸化水平（红色虚线）。PICK1重量：70.5%±9.6%，PICK1 S77D:75.9%±6.4%，PICK1A87L:94.6%±6.9%（平均值±SE，n=3）。*在一个样本t检验中，表示P<0.05。
与PDZ结构域结合的肽通过PKCα降低PICK1的磷酸化
上述实验表明，PICK1磷酸化不需要PKCα与PICK1的结合；然而，该实验并没有说明PDZ结合缝隙的占用情况就其本身而言通过PKCα影响PICK1的磷酸化。为了解决这个问题，我们将纯化的PICK1与高亲和力结合PDZ结构域的DAT C13肽或非结合DAT C13V到D肽进行预培养。与用DAT C13 V至D预孵育相比，用DAT C1 3预孵育时PICK1的磷酸化水平显著降低（70.5%±9.6%，p<0.05，n=3）(). 减少并不是因为混合物中简单存在DAT C13，即当用DAT C12预孵育非结合性A87L突变时，与DAT C13V到D相比，磷酸化水平没有观察到显著差异（95%±6.9%，N.S.，N=5）(). 我们还分析了S77D突变，以评估DAT C13存在时磷酸化降低是否是由于Ser77磷酸化降低所致。令人惊讶的是，与用DAT C13 V至D预孵育的PICK1 S77D相比（75.9%±6.4%，p<0.05，n=3，数据表明，当肽与PICK1 PDZ结构域结合时，PKCα对PICK1的总磷酸化降低；然而，这种效应不是由阻断Ser77的磷酸化引起的。
当在COS7细胞中过度表达时，磷酸化模拟物eYFP-PICK1 S77D显示出降低的聚集趋势
Ser77位于PDZ结构域的脂质结合斑附近()因此，我们想测试模拟其磷酸化是否影响PICK的细胞分布。在实验中，我们使用PICK1，eYFP融合到N端（eYFP-PICK1）。显示了eYFP-PICK1 WT和eYFP/PICK1 S77D在瞬时转染COS7细胞中分布的典型共焦显微镜照片。与以前的报道一致，eYFP-PICK1形成了离散的细胞溶质簇，据报道，这些簇反映了PICK1的膜结合能力(14). 在表达eYFP-PICK1的细胞中，在73%±4%的细胞中观察到至少一个离散的细胞溶质簇，而对于表达eYFP-PICK1-S77D的细胞，在49%±3%的细胞中发现离散簇。因此，与eYFP-PICK1相比，eYFP-PICK1 S77D至少含有簇上的细胞数量显著减少(). 含簇细胞数量的差异可能与两种结构的不同表达水平有关，但转染效率没有明显差异，细胞裂解物的western blot显示两种结构表达相似(）这立即表明拟磷酸突变体eYFP-PICK1 S77D的脂质结合能力降低。我们尝试使用在体外脂质囊泡下拉实验；然而，我们无法重现先前报道的PDZ结构域自身的囊泡结合能力（数据未显示）(27). 相反，我们在相同的实验中测量了全长PICK1的脂质结合能力。与之前的观察结果一致(14)，我们看到脂质小泡强烈地下拉PICK1，但我们无法检测到全长PICK1 WT和S77D的差异(). 这表明Ser77的磷酸化不太可能影响PICK1的整体脂质结合能力在体外此外，数据表明，细胞溶质簇可能不是PICK1脂结合能力的简单读数。
eYFP-PICK1在COS7细胞中的聚集及囊泡结合（A） 代表性图片显示，与瞬时转染COS7细胞中的eYFP-PICK1 S77D相比，eYFP-PICK1的聚集性降低。箭头指向簇。（B） 与S77D相比，WT聚类的量化。通过计算含有至少一个eYFP-PICK1或eYFP/PICK1 S77D胞浆簇的细胞分数来量化聚类。簇被定义为强度为eYFP平均细胞溶质强度1.5倍的区域。数据是从三个独立转染获得的平均值±SE。每个样本中至少拍摄了10张照片，并计数了大约50个细胞*双侧学生t检验P<0.01，n=3，误差条代表SE值。（C） western blot检测表达水平的量化。eYFP-PICK1水平归一化为肌动蛋白，S77D水平计算为平行转染的WT，n=5，其中每个n代表一个独立转染。（D） PICK1 WT（左）和PICK1 S77D（右）脂囊下拉的代表性凝胶。纯化的PICK1 WT或S77D在超速离心之前与脂质囊泡孵育，并通过SDS-PAGE和western blotting分析颗粒（P）和上清液（S）组分。装载所有颗粒和1/5上清液。车辆=囊泡。（E） 脂质结合的定量在体外囊泡下拉试验。数据为囊泡结合分数（平均值±SE，n=3）。囊泡结合分数计算如下.
讨论
众所周知，PICK1可以为其众多交互伙伴提供多种功能；然而，关于调节PICK1活性的细胞机制知之甚少。在本研究中，我们表明PICK1是一个在体外两种重要激酶的底物：PKCα和CaMKIIα。我们确定PICK1 PDZ结构域77位的丝氨酸是主要的PKCα磷酸化位点，至少在体外此外，我们证明，这种磷酸化是由脂质膜结合进行关键调节的，并影响PICK1的细胞分布，这些都可能对相互作用伙伴产生功能性影响。
PICK1之前显示为在体外PKCα的底物(1)然而，应该指出，Staudinger等人在体外PICK1与GST偶联的磷酸化分析，产生与PKCα分子量相似的蛋白质。由于PKCα自身磷酸化，因此不能完全排除报告的磷酸化是由于PKC a自身磷酸化所致。在我们的研究中在体外用未标记的PICK1进行磷酸化分析，通过SDS-PAGE分离两种蛋白质。因此，现在可以得出结论，PICK1确实是一个在体外PKCα的底物。
自身磷酸化也是CaMKIIα的一个问题在体外CaMKIIα自磷酸化后的磷酸化测定(45)、PICK1和CaMKIIα的分子量相似。通过用冷ATP预孵育CaMKIIα，CaMKILα自磷酸化的背景信号降低，并且在添加PICK1后观察到的磷酸化增加很可能归因于PICK1的磷酸化。然而，为了排除观察到的效应是由于PICK1对CaMKIIα自动磷酸化的影响，我们还使用截短版本的PICK1（136-416）进行了检测，因为它可以通过SDS-PAGE从CaMKIIIα中分离出来。PICK1 136-416也被CaMKIIα磷酸化，因此，我们可以首次得出结论，PICK1是一种在体外CaMKIIα底物，磷酸化至少在一定程度上发生在PICK1残基135以外。
PKCα和CaMKIIα的活性对突触可塑性很重要，其中PICK1也起主要作用。因此，我们推测这些激酶对PICK1的磷酸化可以调节PICK的功能。在本研究中，我们重点研究了PKCα对PICK1的磷酸化作用，通过定点突变，我们确定Ser77至少是一个主要的磷酸化位点在体外不幸的是，由于Ser77周围区域的赖氨酸/精氨酸含量较高，我们试图在细胞环境中将Ser77识别为磷酸化位点的尝试失败，这阻碍了含有Ser77的肽的分离和随后的质谱鉴定。因此，我们仍然只能推测Ser77是磷酸化位点体内虽然我们发现它很可能是由于高水平的磷酸化在体外根据NetPhos预测程序，该网站获得了高分(41).
为了更好地了解PICK1的PKCα磷酸化如何在细胞系统中调节，我们测试了脂质结合对PKCα介导的PICK1磷酸化的影响。在存在脂质小泡的情况下进行磷酸化检测导致PICK1的磷酸化水平增加约10倍。此外，小泡诱导的磷酸化增加被Ser77突变所消除，这强烈表明观察到的效果是由于Ser77磷酸化增加所致。因此，PICK1向膜的募集可能是促进Ser77磷酸化的关键因素。有趣的是，由于脂质小泡选择性地影响Ser77的磷酸化，观察到的增加更可能反映了PICK1在脂质结合时的构象变化，而不是PICK1和PKCα在脂质小泡上的支架作用。
值得注意的是，PKCα对PICK1的磷酸化不依赖于PICK1 PDZ结构域和PKCαC末端的相互作用，即PDZ结合缺陷突变体PICK A87L的磷酸化水平与WT相同。这可能反映了PKCα在磷酸化PICK1时不在PDZ结构域结合沟中结合。然而，我们观察到，肽配体的结合，以及与PICK1的另一种假定的细胞相互作用伙伴，降低了PICK1磷酸化。值得注意的是，当Ser77突变时，肽配体还降低了PICK1的磷酸化，这表明肽或PICK1构象变化屏蔽了Ser77以外的另一个磷酸化位点，而PICK1不利于Ser77以外另一个位点的磷酸化。
Ser77位于PICK1-PDZ结构域，靠近PDZ结构区中报道的脂质结合斑(27)如所示该贴片被认为增加了BAR结构域的脂质结合能力，因此对PICK1在突触可塑性中的作用很重要(27). 小泡诱导的磷酸化增加强烈表明Ser77不直接停靠在膜上；然而，Ser77的磷酸化可以降低PICK1-PDZ结构域与带负电荷的脂质膜的结合能力。与这一预测一致，我们观察到磷酸模拟物S77D损害了COS7细胞中eYFP-PICK1的聚集趋势。以前的研究表明，这种聚集趋势代表了PICK1的脂质结合能力的测量(14). 然而，我们无法重现PICK1-PDZ结构域的脂质结合(27)英寸一囊泡下拉试验和磷酸模拟物S77D没有降低全长PICK1的脂质结合能力。然而，重要的是要强调PDZ结构域的脂质结合能力确实可能参与PICK1的细胞定位，尽管我们不能用简化的在体外分析，尤其是因为BAR结构域的脂质结合在全长PICK1中被显示为自动抑制(28). 此外，PICK1的聚集也可以反映蛋白质的齐聚/聚合，就像其他BAR域蛋白质一样(46)这可能对PICK1及其相互作用伙伴的亚细胞定位很重要。因此，我们推测磷酸化除了可能降低脂质结合能力外，还会降低PICK1的聚合作用。
综上所述，本研究确定PICK1是一种受PKCα和CaMKIIα等主要激酶磷酸化作用的磷酸蛋白。此外，我们的数据表明，PKCα介导的磷酸化是由PICK1的细胞定位和PDZ结合囊的占据之间的相互作用动态控制的（总结如下). 在几个可能的位点中，我们确定Ser77是PKCα介导的磷酸化的主要位点，并展示了脂质结合如何增强该位点的磷酸化，以及这种磷酸化反过来可能如何影响其细胞再分配。未来的研究应进一步阐明磷酸化在调节PICK1的多种细胞功能中的复杂作用。
PICK1蛋白激酶Cα磷酸化的调控模型我们的数据表明，PKCα介导的磷酸化是由PICK1的细胞定位和PDZ结合囊的占用之间的相互作用动态控制的。当PICK1不与膜结合，并且肽配体结合在PDZ结构域时，PICK1的磷酸化水平很低。当PICK1既不与膜结合，也没有PDZ配体与PDZ结合囊结合时，PICK1的磷酸化水平较低。当蛋白与膜结合，而没有肽配体与PDZ结合囊结合时，PICK1的磷酸化程度最高。磷酸化可能导致PICK1从膜上脱脂，并可能促进其细胞重新分布。
确认
我们感谢纳贝拉·哈迪姆和唐娜·切尔尼提供的技术援助。此外，我们感谢Jesper V.Olsen在质谱分析方面所做的努力。
基金这项工作得到了哥本哈根大学健康科学学院[314000-10-00000-3140103]（IAJ）、哥本哈根大学卓越计划（BioScaRT）（UG）、国家卫生研究院拨款[P01 DA 12408]（UG。
缩写
| AMPA公司 | α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸 |
| 专用集成电路 | 酸性感应离子通道 |
| 酒吧 | Bin/Amphiphysin/Rvs药盒 |
| CaMKIIα | 钙2+-钙调素依赖性蛋白激酶IIα |
| 运输终端交货 | 多巴胺转运体 |
| 电子YFP | 增强黄色荧光蛋白 |
| 有限公司 | 长期抑郁症 |
| 浦东新区 | PSD95/大型光盘/ZO1 |
| PICK1传感器 | 蛋白质与C-激酶的相互作用 |
| PKCα | 蛋白激酶Cα |
脚注
作者贡献Ina Ammendrup Johnsen进行了分子生物学、蛋白质纯化、在体外磷酸化分析和细胞分布分析。Thor S.Thorsen进行了囊泡下拉试验。Kenneth L.Madsen和Ina Ammendrup-Johnsen进行了荧光偏振分析。Ina Ammendrup-Johnsen、Ulrik Gether和Kenneth Madsen设计了这项研究并撰写了手稿。
工具书类
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