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美国化学学会杂志。2014年8月20日；136(33): 11757–11766.
2014年7月30日在线发布。 doi（操作界面）：10.1021/ja505369r
预防性维修识别码：PMC4140453型
PMID：25075641

互动蛋白激酶C-αC1A和带膜的C1B畴：计算和实验相结合书房

李嘉宁,† 布莱恩·齐安巴（Brian P.Ziemba）,‡ 约瑟夫J.福尔克,‡和格雷戈里·沃思*†
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

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蛋白激酶C-α（PKCα）被广泛研究为具有两个C1结构域（C1A和C1B）的传统PKC范式对激酶的调节和功能很重要。然而，在膜结合环境中探索这些领域具有挑战性无论是模拟还是实验。在这项工作中，我们结合建模、仿真和实验来了解PKCαC1A和C1B结构域相互作用的分子基础带有膜。PKCαC1结构域的原子模拟揭示蛋白质与阴离子脂质的动态相互作用，以及保守的氢键和独特的非极性与脂质活化剂形成接触。获得确凿证据根据脂质结合方面的额外模拟和实验和蛋白质扩散。总的来说，我们的研究首次解释了具有PKCαC1A和C1B结构域如何相互作用的原子细节不同的油脂。在分子水平上，信息我们的研究有助于阐明PKCα的调节以及激活机制。计算/实验相结合这项工作中所演示的方法预计将使探索C1结构域在许多信号蛋白中的作用的研究更好地了解它们在正常细胞中的分子机制功能和疾病发展。

介绍

当从细胞溶质到膜，许多信号蛋白质被激活以响应脂质活化剂与它们的膜结合域。1负极3作为膜结合的范例结构域，C1结构域在大量信号蛋白如蛋白激酶C（PKC）、蛋白激酶D（PKD）、二酰甘油激酶（DAGK）和嵌合蛋白。4负极8每个C1域包含约5条短交错链和一条C端螺旋，围绕两个积分Zn组织2+离子（图​（图1A）。1A） ●●●●。按C1的顺序域，一个特征基序，HX10–12CX公司2CX公司9–15CX公司2CX公司4高x2–4CX公司6–8C、 已确定，其中H和C代表保守的组氨酸和半胱氨酸残基与锌配合2+离子，X可以是任何氨基酸。4,9,10据信，疏水性的一半C1结构域，主要由β12和β34组成环，穿透膜的碳氢化合物核心，2,11,12而亲水性的一半锌2+表面的离子和几个离子残留物暴露于胞浆中（图​（图11B–D）。

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（A） 叠合结构PKCαC1A结构域的同源性模型；红色）、PKCαC1B域（PDB代码：2ELI；绿色）和配体结合的PKCδC1B结构域（PDB编码：1PTR；灰色）。C类αPKCαC1A模型之间的RMSD为0.1º和PKCδC1B结构，以及PKCα之间的0.7Å和PKCδC1B结构。（B）的曲面表示PKCαC1A结构域，（C）PKCαC1结构域，以及（D）还显示了配体结合的PKCδC1B结构域。在面板B、C、，D、碱性、酸性和中性极性残基显示为蓝色，红色和绿色。

尽管具有高序列同源性和结构相似性，4,9不同蛋白质的C1结构域表现出广泛的结合对阴离子脂质辅活化剂如1,2的亲和力-锡-磷脂酰-我-丝氨酸（PS）以及中性脂质类似1,2的活化剂-锡-二酰甘油（DAG）和佛波醇-12-氨基乙酸-13-醋酸盐（PMA）。特别是，PKC的许多典型C1域绑定DAG或优先考虑PMA，而其他人则与两者具有类似的亲和力激活器。13也存在非典型既不绑定DAG也不绑定PMA的C1域。4这些在结合亲和力和偏好上的差异具有挑战性以当前可用的有限结构为基础进行解释数据本身。目前仅沉积了13个不同的C1域到蛋白质数据库（PDB），因此没有三维数据90%以上具有已知序列的C1域的（3D）信息。1此外，在复杂结构中只有一个结构用X射线晶体学解决了任何脂质活化剂的问题。11因此，C1域的关键结构细节，例如，与阴离子脂质和DAG以及蛋白质的取向和膜的渗透程度，没有已被充分阐明。考虑到学习的实验挑战膜结合环境中的C1结构域，2,14,15计算机建模与原子模拟为探索详细的相互作用和构象提供了一种有用的方法参与脂质活化剂的膜结合和识别，这可能会增强我们对C1结构域作用的理解用于信号蛋白的功能和调节。

提出了一种计算和实验相结合的研究在里面这项工作的目的是调查PKCα亚型（PKCα）中的C1结构域及其脂质伴侣（PS、DAG和PMA）。牵涉到大量人类疾病16,17包括癌症，18,19心血管疾病，20,21糖尿病和并发症，22,23以及双极混乱，24,25PKCα作为模型被广泛研究对于传统PKC（cPKCs：α、βI、βII和γ异构体），以了解C1结构域如何调节信号蛋白。9与其他cPKC类似，PKCα具有两个串联C1域，26即C1A和C1B，除了C2靶向结构域和C末端激酶域。9证据表明紧致非活性状态下的PKCα通过顺序激活单个结构域与质膜表面的结合。27负极30首先，钙触发C2结构域与阴离子脂质的结合整个PKCα蛋白被导向膜。正在解除关联在激酶结构域中，抑制性C1A和C1B结构域是吸收到膜上结合脂质辅活化物（如PS）和活化剂（如DAG和PMA）。此过程将激活PKCα，催化底物蛋白的磷酸化。9

最近取得了重大进展29,31强调重要性激活机制中的两个C1结构域，以及需要进一步的计算和实验努力才能更好地了解这些结构域的膜相互作用。成长中的身体实验证据表明cPKCs中的两个C1结构域不是等效的，而是这种不等效的分子基础只是部分理解。10例如，尽管两个C1结构域都被认为与膜相互作用证据表明，两个cPKC C1结构域中只有一个能结合添加到脂质活化剂中。32其他结果表明在PKCα的情况下，这两个域都与激活子结合28,29但却有着相反的亲和力。13,33人们普遍相信PKCαC1A结构域与DAG的亲和力高于C1B结构域，而后者对PMA具有更高的亲和力。14,33,34关于等价物的突变或离子残基，C1A结构域的影响更为显著而在C1B结构域上PKCα膜的结合和活化。35负极37最后，在cPKC激活机制中，最近的工作表明C1A通过结合稳定主要的活化中间体首先是膜，即使在没有激活脂质的情况下。29在这个模型中，C1B向膜的募集激活脂质是激酶激活的关键步骤。29,38进一步阐明C1A和C1B结构域在PKCα中的作用激活，了解其详细的分子是至关重要的与膜的相互作用。因此，我们将计算以及本研究中描述相互作用的实验方法具有不同脂质的PKCαC1A和C1B结构域膜环境。

由于缺乏实验确定的结构以及cPKC C1结构域的膜对接几何，这是一个挑战利用计算机模拟比较膜结合环境中的cPKC相同。而大多数之前的对接以及针对PKCα的C1B结构域和溶液中的PKCδ，37,39负极41在脂质双层中仅模拟了PKCγC1B结构域。42据我们所知对膜中C1A和C1B结构域的研究从未报道过。鉴于我们最近在PKCα方面的计算和实验进展研究，12,29,43现在有了采用组合方法进行揭示和比较变得可行膜中两个PKCαC1结构域的详细信息。如所示在这项工作中，我们建立了原子PKCαC1A和C1B模型在不同的膜结合环境中结合模拟和实验结果的调查。模拟和实验之间的协同作用使我们能够访问结构C1结构域-脂质复合物在不同空间的动力学细节和时间尺度。我们的联合研究旨在帮助理解PKCαC1结构域-脂质相互作用的原子细节并提供有价值的新C1结构域在PKCα调控中的作用和激活。

结果和讨论

中的PKCαC1结构域PC:PS膜

自PS以来脂质是cPKC与细胞膜结合的重要辅活化剂，44我们首先进行了原子分子动力学在3:1 PC:PS中使用单个C1A或C1B域进行的（MD）模拟膜，以检查蛋白质和PS之间的相互作用。在这两种情况下，CαRMSD在前20–26年上升ns，然后在剩下的时间内稳定在1.5到2.0°之间模拟结果证明了我们膜结合的结构稳定性蛋白质模型。与基准PKCα的主要偏差溶液中的C1B结构（PDB代码：2ELI），是指β12和β34环路尖端，定义为CαC1A域或S111和L125中Q46和F60之间的距离在C1B域中。37增加的循环分离导致激活剂结合槽的打开，尽管在这两个域中的不同程度（请参见支持信息（SI），图S1A). C1B域显示环尖端距离从11.5Å略微增加到平均值为12.2Ω，分布范围从9到16 Å. 在我们的模拟中采样的构象非常一致观察到的开环构象（～12.5°）在早期的模拟研究中使用相同的C1B域。37

与C1B域相比，C1A域似乎具有更宽的激活剂结合槽，可能是由于存在更灵活的β12和β34环。这个相比之下，环距通常要长2–3奥到C1B域的相应距离，具有分布中心位于15.3Å(图S1A（SI）). 总的来说，在缺少活化剂的情况下，分离度增加循环尖端以及由此产生的开放激活器绑定槽在PKCαC1结构域中，表明与PC:PS的相互作用膜稳定开环构象并可能促进激活剂相互作用。

与PC:PS膜诱导构象的C1结构域的改变，蛋白质也形成了局部PS分布。PS头部组的横向分布如图所示​图2，2揭示了两者的异同C1A和C1B域之间的相互作用PS脂类。一方面，由于在蛋白质中没有检测到密度区域，PS头组仅在C1结构域，不包括在激活剂结合凹槽中在这两种情况下。很可能，在他们作为共同激活者的角色中，阴离子脂质（如PS）几乎不干扰活化剂结合。另一方面，如不同的高密度区域所示，PS脂质在非常不同的位置与两个C1结构域相互作用。PKCαC1A结构域具有许多基本残基（即R42，K45、K62、K76和R77），对应于半环形PS密度高的区域。与低密度相邻的另一面该区域主要由几个芳香族残基（即F49、，F56、W58和F72）和酸性残留物D55。相反，PKCαC1B结构域仅在两个基本残基K105附近具有高PS密度和K141。C1B结构域周围的大部分膜区显示PS密度远低于C1A域外围观察到的PS密度。这一现象不能简单地归因于基础知识少而基础知识多PKCαC1B域中的酸性残基比C1A域中的酸残基多。我们对离子残基的进一步分析揭示了一个稳定的盐桥C1B域中的网络，这导致以下解释：两组持续相互作用的带电残基K103-D133-K105和K131-D136，在C1B域中形成盐桥网络（图​（图3）。3). 这样的盐桥网络（i）减少了数量和（ii）削弱蛋白质与PS的接触，因此C1B结构域吸引PS脂质的能力较差。相比之下，在C1A域中未观察到类似的网络：残留物K76-E80-R77之间的静电接触不同，但基本残留物仍然可以结合PS脂质（图​（图33和​和4）。4). 因此，我们的模拟表明不同的静电详细相互作用观察到PKCαC1A和C1B的不同结合含有PS脂质的结构域。

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PKCα的PS头组密度图C1A域（左侧面板）和C1B域（右侧面板）。蓝色轮廓显示表面PS脂类头部群密度以下膜小叶为主在300ns模拟中。从底部观察模拟框中，蛋白质主干显示为色带Cα离子残留物的原子成珠状。

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（A） 分子内盐桥的时间演化300毫微秒PKCαC1A（顶部面板）和C1B域（底部面板）的模拟面板）。对原始数据和平滑数据进行了说明分别为细线和粗线。（B） 结构表示在载脂蛋白C1A模拟的290 ns处盐桥网络（粉红色主干）和载脂蛋白C1B模拟293 ns处（绿色主干）。锌2+离子显示为银球。为了说明薄膜插入，用阴影框指示薄膜作为眼睛的向导。配体结合位点在两者中都是开放的构象。

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事件图与PS相关的关键基本残基脂质。事件图中的每一行表示含有结合PS脂质的碱性残渣。不同位置的模拟快照以时间间隔表示多价结合。

即使是短暂的在我们的模拟中，PKCαC1A结构域可以结合多达4–5个PS脂质，而PKCαC1B该结构域可以结合多达2–3个PS脂质（图​（图4），4)，PS结合化学计量比（时间平均值）仅为1.2分别为±1.0和0.3±0.6。巨大的不确定性这些值突出了C1域-PS关联的动态性质。

在这些MD研究之后，进一步的证据与…一致C1A结构域的较高正电荷和PS化学计量比相对于C1B结构域，通过单分子TIRF显微镜（SM-TIRFM）研究。如图所示​图5，5这些实验表明C1A结构域的结合亲和力对PS更敏感密度高于C1B结构域。正如预期的那样，这两种蛋白质都结合双层当PS脂质存在。有趣的是，我们的SM-TIRFM实验发现结构域对含PS的膜具有明显更高的亲和力而不是C1B结构域，这一发现遵循了其相对MD模拟建议的PS结合化学计量。

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依赖磷脂酰丝氨酸上的C1A和C1B双层结合（PS）密度。通过SM-TIRFM定量蛋白质的膜密度如前所述。29C1A或C1B浓度固定在5 pM，并添加到支撑磷脂酰胆碱（PC）中含有（A）增加PS脂质量或（B）增加的双层膜PS脂质总量，其中阴离子脂质总量保持在40%，使用磷脂酰甘油（PG）脂质。短暂孵化后，确保荧光膜结合蛋白的稳态结合密度从三个单独的框架中测量了5个暂时隔离的框架电影流在三个单独的滴定实验中。为了去除PG脂质引起的纯静电结合去除了0~40%PS脂质的结合信号。产生的结果因此，结合是由于与PS的特定蛋白质相互作用，因为非特异性静电征募已被消除。

更详细地检查中的PS绑定事件我们的模拟表明没有一个已识别的相互作用位点持续存在绑定到PS（图​（图4）。4). 例如，每个PKCαC1A结构域中的残基R42、K45、K62和K7626-30%的时间与PS脂质相关17%的时间使用R77，而K105和K141位于C1B域仅约10%和18%与PS脂质相关时间。这些结果表明C1域-PS关联不饱和，因此亲和力不高。然而，如图所示通过我们模拟的快照（图​（图4），4)，至少一些PS结合位点提供多个头组联络。给定PKCαC1结构域中的基本残基PS对映体（1,2-锡-磷脂酰-我-丝氨酸）似乎非常适合结合多个基本残基，可能是由于两个分离的带负电的中心以及立体化学。我们估计在我们的模拟中，C1-PS多价触点更好地通过以下方式实现生理对映体1,2-锡-磷脂酰-我-丝氨酸比非生理对映体2,3-锡-磷脂酰-d日-丝氨酸。这与牛顿及其同事的发现表明对映体2,3-锡-磷脂酰-d日-丝氨酸对PKC的亲和力显著降低。45此外，我们的模拟也提供了结构证据支持早期实验45,46他们发现了cPKC对PS的亲和力高于其他脂质（如PC、PA、，和PE）。因此，尽管没有高亲和力的PS结合位点在PKCαC1结构域中观察到多价C1-PS相互作用可以解释所观察到的C1对PS对映体的立体特异性。

总之，我们的MD模拟和SM-TIRFM的发现实验表明，正合作性的一个简单机制在实验C1结构域结合测量中观察到PS密度不同，并保持固定的双层负电荷（图​（图5）。5). 在这个模型中，C1域首先通过与单个PS分子相互作用与双层结合，然后与一个或多个附加PS分子相互作用。在这样的系统中，初始PS关联将增加亲和力导致积极合作。

PC:PS膜中含有DAG/PMA活化剂的PKCαC1结构域

为了探索C1域激活子的详细相互作用，我们模拟了PC:PS膜中活化剂结合的C1复合物未绑定的激活器。在缺乏配体结合的结构信息的情况下PKCαC1结构域，我们测试了不同的激活物结合姿势和每个复合体只获得一个姿势，整个复合体都是稳定的300 ns膜结合模拟，主要使用蛋白CαRMSD波动范围为1.0至2.6º。与无激活剂相比例，DAG结合诱导的平均1.8和1.6μC1A和C1B分别在环距中，而PMA绑定在所有配体结合的情况下，诱导的3.0和0.5 Au分别降低产生更窄分布的状态（参见图S1（SI）). 这些观察结果表明激活剂结合导致凹槽闭合，蛋白质含量更高刚性。

PS与PKCαC1结构域的关联不是改变了的在我们的模拟中，脂肪活化剂的存在显著。据估计带DAG的C1A和C1B域分别为1.0±1.0和0.2±0.4PMA为0.9±1.0和0.4±0.6，表明C1结构域和PS的相互作用仍然是高度动态的。专业PS相互作用的位点与无激活物的情况相同：C1A域中的R42、K45、K62、K76和R77，以及中的K105和K141C1B域。这些结果再次支持绑定的概念C1结构域对脂质活化剂的直接影响很小它们与PS脂质的关系。

为了进一步检查为什么PKCαC1A和C1B结构域可能具有与结合DAG和PMA相反的亲和力，33我们比较了氢键和非极性接触所有四个复合物。令人惊讶的是，一个高度保守的氢键观察到了模式，尽管此模式似乎不够解释两人对激活脂质的不同偏好域名。保守残基的主干，包括T48、I57和C1A域的G59和C1B域的T113、L122和G124，与DAG和PMA形成一致的氢键（图​（图6）。6). DAG的1-羟基或PMA的20-羟基，用于作为氢键的供体和受体，连接着主链C1A结构域中的I57和T48的原子或C1B结构域中的L122和T113的原子域（图​（图6C1、C2）。6C1、C2）。I57/L22主干NH向T48/T113主链羰基提供氢键，因此桥接β12和β34环（图​（图6C1、C2）。6C1、C2）。这个氢键三角形可能决定了激活器在装订槽中的方向。此外，DAG和PMA还与G59和G124的主链原子形成氢键进一步锚定复杂构象。在没有水的情况下，这种氢键网络对激活剂的访问起着关键作用结合槽，以及稳定其C1结构域膜结合态。值得注意的是，Raf-1 C1域，47与DAG缺乏结合的非典型C1结构域，由于短得多，不能形成这些氢键β34环（参见图S2（SI）)，其中强调了这些特殊氢键的重要性。

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（A1）叠加DAG-bound C1A和C1B构象。构象是从代表处获得的最可能的复杂星团。卡通插图（A2,3）DAG和C1A结构域之间的氢键，以及（A4,5）氢DAG和C1B结构域之间的键。（B1）结构表示叠加PMA结合的C1A和C1B构象。（B2,3）氢PMA与C1A和C1B结构域之间的键。（C1,2）插图激活剂和蛋白质之间的氢键。（D）非极性接触的比较。

而涉及蛋白质骨架的氢键网络似乎在PKCαC1和PKCδC1B之间保守域，11侧链极性接触显示为DAG和PMA之间的明显差异。在我们的模拟中，C1A结构域Q63和C1B结构域Q128的侧链氢键不仅与β12和β34环，但也有DAG（图​（图6A3、A5）。6A3、A5）。然而，在Q63/Q128和PMA，因为在这种情况下谷氨酰胺侧链的拉伸较小无法提供联系人。我们的结果进一步表明，支持关于Q128的早期发现的一般证据PKCαC1B结构域，37这表明这种保守的谷氨酰胺残基在调节活化剂结合槽的形状和接触。

虽然守恒的氢键网络仍然不能解释PKCαC1A和C1B域，我们对非极性接触的分析确实提供了一个可信的对这种差异的解释。在图中​图6D，这个6D、，激活器和C1之间的非极性接触数量根据定义中不断增加的截止值绘制域接触距离。DAG总是有更多的非极性接触与C1B域相比，C1A域不考虑截止值雇佣。对于PMA观察到相反的行为，它总是与C1B结构域有更多非极性接触。从更改时DAG到PMA，C1A的非极性触点数量减少，但C1B增加。PISA界面能估算48表明C1A-DAG复合物更稳定C1A-PMA络合物比C1A-PMA-络合物高2.1 kcal/mol，而C1B-PMA络合物比C1B-DAG复合物仅稳定0.8千卡/摩尔。这些结果因此，为绑定偏好提供了半定性证据C1域。33此外，我们的模拟还能够识别最相关的残留物（2个以上平均激活器触点），包括F43、P47、W58、F60、，绑定到DAG时C1A域中的L63，以及P112、Y123、L125，当绑定到PMA时，C1B域中的Q128。这些发现是一致的之前的诱变实验，35哪一个表明其中一些残留物（尤其是W58和F60）对于DAG激活器绑定至关重要。

除DAG/PMA外交互，我们还监视未绑定的每个模拟中的配体（请参见图S3（SI）). 即使未结合的DAG或PMA分子足够接近在我们的起始构象中C1域，它们不驻留靠近蛋白质。在300毫微秒模拟结束时，所有数据均未绑定DAG和PMA配体远离蛋白质，表现出分离距离最近的蛋白质重原子超过10μl。符合之前的实验观察，12我们的模拟没有显示DAG的C1域中的次要站点或PMA结合，表明活化剂的结合化学计量比为1:1结合到每个PKCαC1结构域。

PKCα的运动膜中的C1结构域

我们未观察到膜结合蛋白激酶CαC1的明显倾斜模拟中的域，如小值和窄值所示蛋白质最长主成分之间夹角的分布轴和Z轴-轴。这些角度为17±8对于C1A域和16±8度的C1B域PC:PS膜，C1A达到16±8PC:PS+DAG膜中C1B结构域为12±7度以及PC:PS+PMA中的14±8（C1A）和13±9（C1B）度。这些结果表明PKCαC1结构域的取向一致插入膜中，再次确认整体稳定性在我们的模拟中使用的模型。

此外，我们检查了PKCαC1结构域的膜透性。我们的模拟表明这两个结构域在膜中没有固定。已定义作为域重心到DOPC N平面的距离，C1A和C1B结构域的膜插入深度可以连续变化从深部状态（～−2º）到浅部状态（～10º），分布如图S4（SI）.在深层状态下，疏水性的一半C1结构域嵌入膜中，而处于浅层状态线圈的尖端几乎不接触薄膜。这些结果证实，在分子水平上，膜结合PKCα的两种状态我们早期实验中发现的C1结构域，29虽然MD模拟可能不够长，无法完全定义在深层和浅层状态中花费的时间比率。这个所有薄膜的平均插入深度为3.9–4.0º我们的构造，但PMA-bound C1B域除外，该域具有平均值4.4º的值（参见图S4（SI）). 建议DAG或PMA绑定通常不会修改C1结构域的膜渗透，除了PMA诱导C1B域移动到更浅的位置。

除了定向和膜渗透，我们有还通过模拟测量了蛋白质扩散系数如通过实验。虽然在膜中进行此类计算非常困难我们注意到，为了收敛，应该谨慎看待其结果我们的原子模拟与早期相比相当好独立脂质双层中的粗颗粒膜蛋白。15,49虽然原子论的绝对扩散系数模拟值比实验值大大约一个数量级值，我们在模拟和实验之间实现了定性一致（表1). 尽管膜不同构造（用独立双层模拟与实验模拟和实验都同意PKCαC1结构域具有非常相似的扩散系数(D类L（左）)在含有或不含活化剂的膜中，除了PMA结合的C1B域具有更高的D类L（左）而不是其他组件。正如之前工作中建议的那样，12,29膜透性是膜蛋白的重要决定因素周边扩散。很可能浅插入深度在我们的模拟中观察到的PMA-bound C1B域与在两个模拟中测量的增加的扩散系数和实验。PMA-C1B模拟的独特发现复杂的是，通过150至300毫微秒，约2.8欧姆。事实上插入深度小于4.4º的构象增加仅PMA-bound C1B结构域每50 ns约20%，而其他结构未见明显增加。此外，PMA-bound C1B域独有的激活器尾对尾触点到PC或PS的脂质从～200到300毫微秒减少50%在我们的长模拟中。因此，我们假设联合效应与PS头组的弱相互作用和接触减少到膜疏水核心导致更高的浅层状态，可能导致PMA结合的C1B结构域的快速扩散。相对较大的PMA对C1B实验扩散系数的影响可能源于扩散的时间尺度和空间维度较长测量。

表1

外围扩散系数D类L（左）从独立式MD仿真中获得双层膜和支撑双层膜的实验（单位：μm2/s）一
 PKCαC1A公司
PKCαC1B
 模拟实验模拟实验
个人电脑：PS12.8±1.80.7 ± 0.115.1 ± 1.40.5 ± 0.1
个人电脑：PS+DAG14.6 ± 2.20.7 ± 0.115.6 ± 2.10.6 ± 0.2
个人电脑：PS+PMA12.3 ± 1.80.7 ± 0.120.3 ± 3.01.2 ± 0.1
一的误差条仿真数据根据相同结构的2条轨迹计算。误差线的实验数据是从5个相同的实验中计算出来的构造，每个构造包含至少300条轨迹。

详细的膜相互作用机制PKCαC1域

将我们系统组合的证据联系起来研究中，我们提出了可能的详细膜结合机制PKCαC1结构域。与PKCαC2结构域相比，我们之前的工作已经研究过了，43我们发现PS与C1的相互作用弱于与C2.与先前提出的激活机制一致，29C2域而不是C1域可能将PKCα导向膜。对于后续活化步骤，尽管这两个C1结构域的溶剂暴露在全长PKC可能不同的情况下，我们的研究支持这一观点C1A结构域在C1B结构域之前被膜吸收因为它与阴离子PS脂质的相互作用更强。一次它与膜结合，C1A或C1B结构域可能经历构象变化打开激活物结合槽，而同时，整个区域在浅层之间波动以及膜插入的深层状态。深层膜插入增强开口槽构象的稳定性，这可能与激活器的搜索机制。当PKCαC1结构域绑定激活器，激活器绑定槽可能会关闭，整个领域变得更加僵化。保守氢键对激活物识别和结合方向很重要膜结合环境。然而，它是非极性接触C1域和导致相反结果的激活子之间activator绑定首选项。最后，PMA绑定似乎有利于C1B结构域的浅结合状态，如MD中观察到的模拟和实验扩散系数建议。PKCαC1B和PMA，膜和C1B-PMA复合物之间的接触减少，PMA结合的C1B结构域的异常快速扩散可能与此有关PMA等诱导肿瘤发生的分子机制佛波酯。

结论

我们有组合建模，模拟和实验研究PKCα在细胞膜中的C1A和C1B结构域是一项艰巨的任务只有一种方法。我们以前的发现12,29,43目前的工作表明以下涉及C1A和C1B结构域的详细机制PKCα激活：在整个PKCα与膜，两个C1结构域都可以在活化期间与膜结合。C1A结构域首先通过与脂质的强相互作用被募集共激活子PS和激活子DAG，C1B结构域被招募稍后，首选绑定激活器PMA。两个PKCαC1域在其序列中编码以发挥不同的作用，通过与助凝剂的不同表面静电接触以及与激活剂的非极性接触。我们的研究提供了支持C1B通过活化脂质可能是PKCα活化的关键步骤模型。

此外，确凿证据来自模拟以及脂质结合和蛋白质扩散方面的实验。仿真实验相辅相成，使我们能够联系证据C1域相互作用的多个时空尺度带有膜。我们的组合方法将有助于探索C1结构域在许多信号蛋白中的作用，甚至在缺乏详细的结构信息，有助于进一步了解它们在正常细胞功能和疾病中的分子机制发展。考虑到这里使用的原子论MD模拟方法，重要的是要意识到我们的模拟之间的差异以及时间和长度尺度的实验。未来的努力将是开发精确的粗颗粒脂质和蛋白质模型在实验时间尺度上解释和预测蛋白质动力学。为了获得关于PKCα激活的更多信息，我们还利用所获得的知识模拟了一个全长模型来自我们PKCα研究中的各个领域12,29,43以及这项工作。

材料和方法

膜结合模型构建

我们已经建模并模拟了膜和缓冲液中的单个C1A和C1B区域模拟实验条件。在许多实验中C1结构域与～300-残留麦芽糖结合蛋白融合（MBP），其用于增强C1结构域的溶解度。29如所示支持的问询处，我们确认MBP和肽连接器对C1之间的相互作用影响可以忽略不计域和膜（参见图S5（SI）). 因此，只对单个C1域建模是合理的为了了解详细的蛋白质-脂质相互作用。

最初，建立了膜模型和蛋白质模型独立地。3:1 PC:PS对称双层模型，包含120个DOPC和40种DOPS脂质，使用CHARMM-GUI膜构建器进行设置50并在水箱（包含150 mM NaCl溶液），使用CHARMM36力场和Desmond 3.0仿真包。51这个然后将膜模型与X（X）–Y（Y）平面，垂直于Z轴-轴。这个PKCαC1B模型（残差102–151）基于坐标残基18-67的溶液结构（PDB代码：2ELI）。PKCαC1A模型（剩余37–86，图​图1）是1)由同源建模服务器SWISS-MODEL生成，52与模板（PDB）具有42%的序列一致性代码：1PTR）。为了检测离子残基的质子化状态，蛋白质Maestro（9.3版，Schrödinger，LLC，2012年）。每个锌2+离子被三个硫代形式的半胱氨酸残基和一个组氨酸残基在我们开始的蛋白质构象中，质子化在δ-氮原子上。

然后将PKCαC1A和C1B模型与PC:PS相结合膜。对每个C1A或C1B结构进行对齐、旋转和移动在膜模型下方，因此蛋白质的长轴是几乎与Z轴-轴和尖端β12和β34环可以指向下叶膜的厚度。根据初步实验数据，12,29蛋白质中心位于DOPC的N平面以下6°以将蛋白质模型插入到膜模型中。几乎一半的C1A/C1B结构域位于下叶，但确实如此不能够到上面的传单。使用Maestro中的System Builder在每个构造中创建包含140 mM NaCl和10 mM KCl的盒子，其边界与最近的蛋白质或Z方向的脂原子。因为在C1之间存水域和膜通常是不利的，11水分子被排除在蛋白质膜附近接口。

将DAG和PMA分子插入膜中，为了在激活剂存在的情况下对C1结构域进行建模。PMA绑定根据配体结合PKCδ的排列建立模型C1B结构（PDB代码：1PTR）到上述模型中的蛋白质结构，然后将佛波酯配体改性为PMA。自已发现DAG与PMA竞争相同的结合位点，53我们将DAG的选定氧原子与晶体结构中的佛波醇化合物，因此在我们的搜索中构建并测试了DAG-bound C1A和C1B构造用于稳定络合物。除了结合活化剂，还有两个DAG或将PMA分子插入蛋白质附近进行检测任何二级结合或相互作用位点。

简言之，三膜成分（PC:PS，PC:PS+DAG，PC:PS+PMA）对于PKC，使用αC1A和C1B结构域构建6个结构体。每个构造包含大约52个 a～85中有000个原子周期性边界的Φ×85Φ×85Ω盒条件。

原子MD模拟

我们申请了工具Viparr在Desmond中指定全原子力场参数。蛋白质参数是从CHARMM27 cmap力场获得的，除了硫代参数采用了先前的报告。54CHARMM36参数用于DOPC和DOPS以及用于DAG和PMA的CHARMM通用力场。55TIP3P模型用于显式水分子。参数分配后，启动模型被最小化以消除空间位阻冲突并使用中的标准协议放松Maestro-Desmond套餐。我们在包中使用了一个脚本M-SHAKE算法约束涉及的所有键的键长氢原子，以及所有水分子的角度。我们的产品用Desmond 3.0进行了模拟，时间步长为2 fs。每一步都会更新绑定和近距离交互，而far交互每三步更新一次。这些半同位素模拟是在恒定温度（296 K）和恒定温度下进行的压力（1巴）。Nosé–Hoover链恒温器方法与Martyna–Tobias–Klein一起受雇气压调节器。计算库仑和伦纳德-琼斯的短程截止值相互作用为9.0℃。长程库仑相互作用采用光滑粒子网格Ewald方法进行处理。两个副本对每个构造进行了模拟：一个短构造为150ns长300纳秒。短期和长期模拟的一致性表明我们的模拟时间范围足以消除启动构象偏差。

仿真数据分析

构象的分析是使用VMD执行56和Pymol（Schrödinger，有限责任公司）。在这项工作中，蛋白质的根平方偏差（RMSDs）构象在C上计算α原子对与参考PKCαC1B结构对齐（残基18-67，PDB代码：2ELI）。盐桥或带电接触是指两个极性原子相反电荷在4.0°以内。定义了结合脂质与最接近蛋白质的重原子在4.0度以内带有相反电荷的重原子。定义了疏水接触当两个非极性原子（部分电荷<0.3单位）位于截止距离。测量膜中的蛋白质取向作为蛋白质最长主轴与这个Z轴-轴。

外围扩散系数(D类L（左）)PKCαC1结构域的根据随时间变化的均方位移（MSD）计算至eq1:

方程式图像
1

哪里第页是重心C1A或C1B域的向量。计算平均值分割模拟中的块。下部的整体漂移从蛋白质扩散中去除传单，57而在我们的MSD计算。MSD与时间的关系图如所示图S6（SI）.

最长的蛋白质主轴和Z轴-轴已测量检查蛋白质的取向膜。为了量化膜渗透，膜插入PKCαC1结构域的深度定义为蛋白质的质心到最近的氮平面DOPC脂质。

实验

试剂和实验协议是与之前描述的工作一致12,15,29并且将对其进行简要描述。

细菌人PKCαC1A和C1B调节域的表达结构通过插入编码C1A结构域的DNA序列（残基26-100）和C1B结构域（90-165）转化为pMAL-c2G表达矢量。针对每种蛋白质，设计引物以结合Sfp磷酸-对噻吩基转移酶的N-末端11-氨基酸识别序列利用CoA-连接荧光团实现序列特异性酶标记。

C1A和C1B结构域在大肠杆菌Rosetta 2（DE3）细胞（Novagen）。20°C下过夜表达然后在直链淀粉树脂（NEB）上纯化，并用过量的麦芽糖。纯化蛋白≥总洗脱蛋白的90%蛋白质。N末端Sfp标签被共价修饰通过Sfp酶合成Alexa Fluor 555-CoA，过量荧光团使用Vivaspin集中器（Sartorius Stedim，哥廷根，德国）。

要生成支持的双层，需要使用声波单层囊泡（SUV）由合成二油醇磷脂PC（磷脂酰胆碱；1,2-二油酰-锡-甘油-3-磷酸胆碱）、PS（磷脂酰丝氨酸；1,2-二油酰-锡-甘油-3-磷酸-我-丝氨酸），DAG（二酰甘油；1,2-二油酰基-锡-甘油），PG（1,2-二油酰基-锡-甘油-3-磷酸-（1′-rac公司-甘油）[均来自Avanti Polar Lipids（雪花石膏，AL）]和PMA（佛波醇-12-吡啶-13-醋酸盐）[来自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）]被放置在食人鱼清洁的玻璃基板上。

TIRF显微镜测量在22°C±如前所述，在自制客观仪器上为0.5°C描述。12,15,29在添加生理缓冲液（140 mM KCl、15 mM NaCl、0.5 mM MgCl、26μM氯化钙2，20μM EGTA，减少5 mM我-谷胱甘肽，25 mM HEPES，pH 7.4）和BSA阻断步骤荧光污染物通常很少。5分钟后与蛋白质孵育min，样品在高激光功率下漂白将不动荧光粒子的贡献降到最低恢复60秒。对于每个样本，采集了多个电影流帧速率为20帧/s，空间分辨率为4.2像素/μm。使用ImageJ进行粒子跟踪分析和拟合，GraphPad Prism 5和Mathematica。

致谢

本研究得到支持美国国立卫生研究院授予R01 GM-063796（给G.A.V.）和R01 GM-0.63235（给J.J.F.）。这个这项工作使用了极限科学与工程探索环境（XSEDE），由美国国家科学基金会（National Science Foundation Grant Number）资助OCI-1053575。计算资源由XSEDE Kraken提供以及芝加哥大学的研究计算中心（RCC）。我们感谢Anand Srivastava博士和Severin T.Schneebeli博士的帮助讨论。

资金筹措表

美国国立卫生研究院

可用的支持信息

环距分布用原子论MD模拟（图S1）测量叠加结构不典型C1结构域和PKCαC1结构域的DAG-bound模型（图S2），未结合活化剂的横向扩散路径（图S3）、膜插入深度的比较（图S4）和分析MBP-C1A-C1B仿真的最终快照（图S5）。均方根位移与时间曲线（图S6）。此材料可用通过互联网免费访问http://pubs.acs.org.

笔记

这个作者声明否相互竞争的财务利益。

补充材料

ja505369r_si_001.pdf（250万，pdf）

工具书类

文章来自美国化学学会杂志由以下人员提供美国化学学会