蛋白激酶Cα向质膜的特异性转运需要两种钙²⁺和PIP₂通过C2域识别^{D类⃞V（V）⃞}

融合蛋白构建体

先前描述了编码人PKCα和PKCαC2结构域（韩国仁川英哈大学J.-W.Soh馈赠）的融合到氰荧光蛋白（CFP）（pCFP-PKCα与pCFP-PKCα_2）的质粒的构建(埃文斯等。，2004)。通过定点突变（Stratagene，La Jolla，CA）产生突变质粒（pCFP-PKCαC2/K209A/K211A和pCFP-PKCα/K209/K211A）。编码人细胞溶质磷脂酶A的质粒₂（cPLA₂)C2域（加入｛“type”：“entrez核苷酸”，“attrs”：｛“text”：“M72393”，“term_id”：“190006”｝M72393型)含有来自PKCαC2（pCFP-cPLA）的CBL 1、2和3₂/PKC_CBLs）或PKCαC2 CBL和β3-4链（pCFP-cPLA₂/PKC_CBLs+β3–4）由pCFP-cPLA扩增获得的重叠PCR片段组装而成₂C2与cPLA₂C2fwd和cPLA₂C2rev引物和包含PKCαC2 CBL序列和β3–4链序列的引物。通过PCR组装片段并克隆到欣国防情报研究所/萨尔ECFP（C3）的位置。cPLA的氨基酸序列₂/含cPLA的PKC_CBLs杂交₂C2序列（S17-V30、D43-H62、P69-D93、T101-M148）因插入PKCαC2回路序列（I184-S192、I215-N220、W247-D254）而中断。cPLA的氨基酸序列₂/含PKC_CBLs+β3–4杂合物的cPLA₂C2序列（S17-V30、P69-D93、T101-M148）因插入PKCαC2环和β3-4链序列（I184-N220、W247-D254）而中断。由于不同的拓扑结构，PKCαC2β3–4链与cPLA同源₂C2β2–3股。

含有与CFP或YFP（黄色荧光蛋白）融合的GAP43 N末端20残基的质粒（分别为mGAP43-CFP和-YFP）购自BD Biosciences Clontech（加利福尼亚州帕洛阿尔托）。TGN38-CFP和TGN38-YFP质粒是K.Simons（德国德累斯顿马普研究所）赠送的礼物。EGFP-PLCδ₁PH域质粒是M.Katan（英国伦敦癌症研究中心细胞和分子生物学）赠送的礼物。

本研究中使用的pYFP质粒是从BD Biosciences Clontech购买的pEYFP中构建的，通过定点突变（Stratagene）引入Q70M突变以提高其质量(格里斯贝克等。，2001)。交换Nhe公司我/英国标准普尔编码荧光蛋白的GI片段产生不同颜色的荧光蛋白质粒。

对于体外脂质结合研究，PKCαC2，cPLA₂/PKC_CBLs和cPLA₂/使用PKCαC2-GSTfwd和PKCαC2-GSTrev引物扩增PKC_CBLs+β3–4序列，用于PKCαCO2和cPLA₂C2 GSTfwd和cPLA₂C2-GSTfwd，用于杂种，并克隆到Eag公司我/生态谷胱甘肽的RI位点S公司-转移酶（GST）融合载体。表达的蛋白质大肠杆菌菌株BL12D在用凝血酶切割和洗脱之前在谷胱甘肽亲和柱上分离。通过SDS-PAGE测定蛋白质纯度(莱姆利，1970年)用酪氨酸差异光谱法测定蛋白质浓度(科普兰，1994年)。所有结构均经DNA测序证实。

细胞培养

将从美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）获得的Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞以1×10的密度涂布在35-mm玻璃底培养皿（马萨诸塞州阿什兰MatTek）上⁴细胞/厘米²在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.292 mg/ml谷氨酰胺的DMEM中培养₂37°C时。第二天，使用FuGENE-6（Roche Diagnostics，Indianapolis，IN）或Lipofectamine 2000（Invitrogen）在含有0.2%BSA、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.292 mg/ml谷氨酰胺的DMEM中，按照制造商的方案，用1–2.5μg每种相关质粒转染细胞。

荧光蛋白显微镜

共同转染的MDCK细胞用Hanks的平衡盐溶液清洗，并在额外缓冲25 mM HEPES，pH 7.4（HH-BSS）的盐溶液中培养。使用配备60×1.25 NA油浸物镜的奥林巴斯倒置显微镜（纽约梅尔维尔）、Sutter滤光片轮中的CFP和YFP发射滤光片（Chroma Technology，Brattleboro，VT）、CFP/YFP二色镜和TILL Imago CCD相机（德国格拉夫芬TILL Photonics公司）对细胞进行成像。使用多色IV单色仪（TILL Photonics）分别为CFP和YFP提供430 nm和510 nm的激发光。图形中的图像​图3三和​和44使用配备60×1.4 NA油浸物镜的尼康倒置显微镜（纽约州梅尔维尔）、CFP/YFP/RFP二向色镜和相应的单波段激发和发射滤波器（色度技术）以及CoolSNAP ES相机（光度学，亚利桑那州图森市）进行采集。激发灯由水银灯提供。在所有实验中，在采集第一组和第二组CFP/YFP图像集之间，用10μM离子霉素刺激细胞。图像集之间的间隔为5-10秒。使用TILLvisION软件进行图像采集和分析。最终图像是使用Adobe Photoshop（Adobe，San Jose，CA）和ImageJ（NIH，网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/)。使用ImageJ制作了曲面图和视频。

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图3。

PKCαC2域与PLCδ共定位₁易位后不同焦平面的PH结构域和mGAP43。共存（A）YFP-PKCαC2（左）和CFP-PLCδ的细胞图像₁在每个细胞的顶端（顶部）、内侧（中部）和基底（底部）平面用离子霉素处理后PH（右）。同一个细胞在给定的焦平面上成像。插图，所示单元格区域的放大视图。CFP-PLCδ的细胞内分布₁离子霉素治疗前后PH值无明显变化。（B） 用离子霉素处理后，在每个细胞的顶端（顶部）、内侧（中部）和基底（底部）平面共表达YFP-PKCαC2（左）和mGAP43-CFP（右）的三个细胞的图像。插图，所示单元格区域的放大图。同一个细胞在给定的焦平面上成像。mGAP43-CFP的核周靶向高尔基体由星号表示（右图）。所有结果均代表至少五个实验。

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图4。

mGAP43和PLCδ的彩色化₁具有DiD的PH结构域。（A） 表达mGAP43-YFP的细胞顶面（左）用亲脂膜染料DiD染色（右）。细胞在37°C下与25μM DiD孵育5分钟，用冰镇HHBSS冲洗，并在冰上保存直至成像，以防止染料污染内膜。焦点位于心尖表面。插图，白框区域。mGAP43（左）和DiD（右）插图中区域的曲面图（底部）。比例尺反映了荧光强度随着周围暗淡膜的强度设置为1而增加的倍数。（B） 表达mGAP-YFP的细胞基底表面（左），DiD染色（右）。mGAP43（左）和DiD（右）插图中区域的曲面图（底部）。比例尺反映荧光强度的倍数增加。（C） 表达CFP-PLCδ的细胞的顶（顶）面和底（底）面₁PH（左）用亲脂膜染料FM4-64染色（右）。细胞与5μg/ml FM4-64在冰镇HHBSS中孵育5分钟，冲洗，并放在冰上直到成像，以防止染料污染内膜。

脂质结合研究

使用的脂质为1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸胆碱（磷脂酰胆碱，PC），1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸丝氨酸（磷脂酰丝氨酸，PS）和L-α-磷脂酰肌醇-4,5，-二磷酸（PIP₂)来自Avanti Polar Lipids（Alabaster，AL）。使用的氟是N个-[5-二甲氨基-萘-1-磺酰基]-1,2-二十六烷基-锡-分子探针中的甘油-3-磷酸乙醇胺（dansyl-PE，dPE）。将脂质溶解在氯仿/甲醇/水（1/2/0.8）中，得到71.25:23.75:5PC:PS:dPE或66.75:22.25:6:5PC:PS：PIP的比率₂：dPE，在45°C的真空下干燥，直到去除所有溶剂，然后用缓冲液A（25 mM）水合N个-（2-羟乙基）哌嗪-N个pH 7.4的′-2-乙基磺酸（HEPES），含KOH、140 mM KCl和15 mM NaCl以及1 mM MgCl₂)通过快速涡流。通过使用Misonix XL2020探针声波仪（Misonix，Farmingdale，NY）对水合脂质进行超声波处理以澄清，制备了声波小单层囊泡（SUV）。超声处理后，通过离心分离去除不溶性物质。

为了测量与脂质结合的蛋白质，在Photon Technology International QM-2000–6SE荧光光谱仪（新泽西州劳伦斯维尔）上进行了平衡荧光实验，实验温度为25°C，缓冲液a基本上如所述(纳列夫斯基等。，1997)。对于所有的平衡荧光实验，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度分别为2和8 nm。在蛋白质中的供体固有色氨酸和由PC/PS/dPE或PC:PS:PIP组成的SUV之间测量FRET₂：含有受体的dPE，丹酰PE。CaCl₂在缓冲液A中的野生型或杂交C2结构域（1μM）和SUV（总脂质浓度100μM）的混合物中滴定，通过使用λ_前任=284 nm和λ_{相对长度单位}分别=520 nm。从蛋白质数据中减去dPE直接激发产生的荧光。图中给出了三个实验的平均值±SD。曲线通过使用KaleidaGraph软件（Synergy software，Reading，PA）的Hill方程表示数据的最佳拟合。

天然PKCαC2结构域与膜结合PIP的体外结合₂

以前的研究表明PS和PIP₂作为PKCαC2结构域与人工膜对接的调节因子(科尔巴兰·加西亚等。，2003；斯塔赫林等。，2003；Marin-Vicente公司等。，2005)。如上所述，PLC的膜结合目标δ₁PH域，PIP₂在质膜的内叶中特别富集(罗斯，2004)而PS是所有细胞膜的组成部分(van Meer，1998年)。许多独立的荧光研究观察到PLCδ的专属靶向性₁PH域到质膜，表明其他细胞膜不含可检测水平的PIP₂(罗斯，2004)。因此，PKCαC2结构域和质膜PIP之间的特异性相互作用₂可以解释所观察到的血浆膜靶向特异性。为了验证这一假设，我们使用了一种已建立的蛋白-膜FRET分析来量化PIP的影响₂关于Ca²⁺-磷脂囊泡的体外依赖性结合(纳列夫斯基等。，1997)。具体而言，在PKCαC2域的四个固有色氨酸供体和含有3:1 PC:PS和5 mol%丹酰-PE的磷脂囊泡之间监测FRET，后者作为FRET受体。囊泡也含有或缺乏6 mol%的PIP₂.PIP的存在₂显著改变Ca²⁺-C2结构域对接对囊泡的依赖性，使[Ca减少18倍²⁺]_1/2相对于缺乏PIP的囊泡，C2结构域对接的亲和力增加了18倍₂(图5A)。相反，PIP₂对钙没有影响²⁺-胞浆磷脂酶A C2结构域的依赖性膜对接₂α（cPLA₂αC2；图5B)。这些发现共同表明PIP₂显著提高钙²⁺-钙介导PKCαC2结构域向膜表面的募集²⁺发出信号并建议PIP₂结合驱动质膜靶向。

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图5。

项目实施计划₂增加PKCαC2结构域对磷脂囊泡的结合亲和力。（A）PKCαC2结构域和（B）cPLA的蛋白膜FRET分析₂αC2结构域与磷脂囊泡结合，磷脂囊泡含有3:1的PC:PS和5 mol%的丹酰PE，带（•）或不带(○) 6摩尔百分比PIP₂样品含有1μM C2结构域、100μM总脂质、1 mM MgCl₂，140 mM KCl，15 mM NaCl，25 mM HEPES，pH 7.4，25°C。数据点表示三个独立实验的平均±SD。使用希尔方程（实线）进行的最佳拟合分析得出[Ca²⁺]_1/2值为2.9±0.05μM（+PIP₂)和51±1.5μM（–PIP₂)对于PKCαC2和15±0.28μM（+PIP₂)和13±0.29μM（–PIP₂)对于cPLA₂αC2.希尔系数在1.5到1.9之间，因为每个C2结构域被多个Ca激活²⁺离子(科胡特等。，2002).

含PKCαC2-Ca的杂交C2结构域的细胞内靶向和脂质结合²⁺-绑定循环

我们的下一个目标是确定特定质膜靶向下C2结构域的结构元素。一种可能性是CBL控制靶向特异性。例如，我们早期的工作表明，来自cPLA的相关C2域的CBL₂足以促进C2结构域的天然细胞内靶向性，该结构域在体内与高尔基体和内质网膜对接(埃文斯等。，2004)。此外，其他研究表明，位于PKCαC2结构域CBL中的残基在将分离的C2结构域靶向质膜方面很重要(科内萨·扎莫拉等。，2001；斯塔赫林等。，2003；Marin-Vicente公司等。，2005)，和PKCαC2对接的生物物理研究表明，CBL直接接触膜表面(科胡特等。，2003；图1A).

评估PKCαC2 CBL在靶向和PIP中的作用₂识别后，我们将PKCαC2 CBL融合到cPLA上₂αC2域支架产生混合域（cPLA₂/PKC_CBLs；图1，A和B)。因为cPLA的晶体结构₂已知αC2和PKCαC2(佩里西奇等。，1998；维达格尔等。，1999)，可以对齐同源结构以产生杂种(图1B)。直接比较cPLA之间的目标₂/PKC-_CBLs杂交融合到CFP（CFP-cPLA₂/PKC_CBLs）和YFP-PKCα²⁺-杂种从细胞质到近核位置的依赖性易位，其中一些与质膜结合仍可以检测到(图6A和补充图6视频）。通过成像CFP-PKCαC2_CBLs和TGN38-YFP，TGN的标记物(图姆等。，1999)，我们建立TGN膜作为近核结合的靶点(图4B)。相比之下，含有PKCαC2 CBL 1或CBL 1和3的类似杂种融合到cPLA₂αC2结构域支架对Ca的反应未能向任何膜移位²⁺动员（未公布的数据）。这些发现表明，分离的PKCαC2结构域CBL可以直接调控Ca²⁺-依赖性靶向一组有限的阴离子细胞膜，但不足以使PKCαC2样靶向质膜。总的来说，这些发现表明，PKCαC2结构域的天然质膜靶向特异性所需的另一个结构元件必须位于CBL之外。

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图6。

PKCαC2β链3和4是质膜靶向和Ca所必需的²⁺-依赖于PIP的绑定₂-含有磷脂小泡。CFP和YFP共存细胞图像对（A）CFP-cPLA₂/PKC_CBLs和YFP-PKCαC2，（B）CFP-cPLA₂/PKC_CBLs和TGN38-YFP，或（C）CFP-cPLA₂/刺激细胞质钙后1–2.5分钟PKC_CBLs+β3–4和YFP-PKCαC2²⁺用离子霉素处理信号。白色方框区域的插图、放大图和合并显示在每个面板的右侧。比例尺，10μm。结果代表了至少五个实验。（D）cPLA的蛋白质-膜FRET分析₂/PKC_CBLs和（E）cPLA₂/PKC_CBLs+β3–4蛋白与磷脂囊泡结合（m）或不与（l）6%PIP结合₂（请参见图5图例了解详细信息）。使用希尔方程（实线）进行的最佳拟合分析得出[Ca²⁺]_1/2647±11 mM（+PIP₂)和620±5.5μM（–PIP₂)对于cPLA₂/PKC_CBLs和值91.6±1.1 mM（+PIP₂)和459±12 mM（–PIP₂)对于PKCαC2_CBLs+β3–4。

还检测了具有三个PKCαC2 CBL的杂交C2结构域识别PIP的能力₂体外蛋白膜FRET分析。即使没有PIP₂，杂种需要较高的钙²⁺与野生型PKCαC2结构域相比，驱动膜对接的水平（比较图​图5A第5页和​和6D），第6天)，很可能是因为钙的次优取向²⁺与之前建议的其他C2域杂种的配位残基相同(格伯等。，2001)。值得注意的是，PIP₂对钙没有影响²⁺-这种混合C2结构域对膜对接的依赖性，表明单用CBL不足以进行PIP₂识别并提示涉及PKCαC2结构域的另一个区域。

含PKCαC2-Ca的杂交C2结构域的细胞内靶向性和脂质结合²⁺-结合环和β3–4发夹

由β链3和4形成的β发夹中的赖氨酸残基形成的基本区域被假定为与PS或PIP协调₂在膜中(奥乔亚等。，2002；科尔巴兰·加西亚等。，2003；罗德里格斯-阿尔法罗等。，2004；Marin-Vicente公司等。，2005)电子顺磁共振研究表明，β3–4发夹位于膜表面附近(科胡特等。，2003)。为了研究β3-4发夹对特异性质膜靶向的作用，我们构建了另一个包含PKCαC2 CBL和β3-4发夹与cPLA融合的杂交C2结构域₂C2脚手架并连接至CFP（CFP-cPLA₂/PKC_CBLs+β3–4；图1A)。对钙的反应²⁺增加CFP-cPLA₂/PKC_CBLs+β3–4从胞质溶胶中移出，并与YFP-PKCαC2在根尖点完全共定位(图6C和补充图6C视频）。对CFP-cPLA的移位进行成像₂/PKC-_CBLs+β3–4和YFP-cPLA₂/同一细胞中的PKC_CBLs杂交结构域清楚地揭示了β3–4发夹对质膜特异性靶向的重要作用（补充图S2和补充图S2video）。这些结果表明，PKCαC2结构域的β3–4发夹驱动了天然结构域的质膜靶向特异性。

直接测试β3–4发夹在PIP中的作用₂我们评估了cPLA的体外结合₂/PKC_CBLs+β3–4杂交蛋白与带有或不带有PIP的囊泡₂在蛋白膜FRET分析中。与cPLA相比₂/PKC_CBLs杂交蛋白，其中PIP₂对钙没有影响²⁺-依赖膜结合(图6D)、PIP₂显著改变了Ca²⁺-cPLA的依赖性结合₂/PKC_CBLs+β3–4蛋白转化为磷脂小泡，使[Ca减少五倍²⁺]_1/2与缺乏PIP的囊泡结合₂(图6E)。总之，这里提供的数据支持Ca的观点²⁺PKCα向PIP的依赖性易位₂-富集的质膜由PKCαC2结构域的两个膜相互作用区域控制：CBL区域，该区域特异性结合Ca²⁺并驱动仅具有有限特异性的膜结合，以及β3–4发夹，这是完全膜特异性和PIP所必需的₂认可。

PKCα和分离的PKCαC2结构域对点滴和补丁的靶向性

我们最初的PKCα易位研究显示，明显的局部靶向是根尖点和基底斑块。因为许多报告也观察到带有GFP标记的PLCδ的根尖点和基底斑₁PH域并将其解释为PIP的局部聚集₂（如上所述），我们进一步探讨了这些地区的起源。使用两种化学性质不同的染料对质膜进行均匀染色，我们发现点状和斑块是膜表面积增加的区域（褶皱和微绒毛），这与其他两份报告一致(2002年科拉鲁索和春天；van Rheenen和Jalink，2002年)并且不是PIP的站点₂和/或脂筏富集。然而，我们的观察结果可能是特定于细胞类型的，因为其他使用类似膜染料的小组得出结论，PLCδ₁质膜局部区域的PH域和mGAP43积聚不是由局部增加的膜面积引起的，而是由筏引起的(黄等。，2004；Golub和Caroni，2005年)。最近，PKCα被证明与Ca中不溶于洗涤剂的组分有关²⁺-筏式约束的依赖方式(鲁奇等。，2005)。然而，细胞中的脂筏与来源于细胞的洗涤剂不溶性组分之间的相关性仍然受到质疑(范·莱恩等。，2005)。尽管本文使用传统的筏形标记物观察到的质膜点状和斑块显然不是筏形，但我们不能排除膜不均匀性的存在，如筏形，其可能太小而无法通过光学显微镜分辨。

CBL在靶向细胞膜中的作用

钙²⁺长期以来，由PKCαC2结构域的三个CBL定义的囊袋中的结合被认为是PKCα和分离的PKCαC22结构域向细胞质膜移位以及体外脂质双层结合的关键(梅德科娃和乔，1998年；科尔巴兰·加西亚等。，1999；维达格尔等。，1999；Conesa萨莫拉等。，2001；Stahelin和Cho，2001年; 科胡特等。， 2002,2003；Murray和Honig，2002年)。在体外，也可能在体内，这种易位涉及钙的结合²⁺-将蛋白质负载到膜表面的阴离子PS头基(维达格尔等。，1999; (埃文斯等。，2004)。这里的结果进一步证明，融合到另一个C2结构域的PKCαC2 CBL对Ca足够²⁺-依赖性转运到阴离子细胞膜和磷脂小泡。然而，尽管先前的研究已经得出结论，CBL负责独特的质膜靶向(斯塔赫林等。，2003；Marin-Vicente公司等。，2005)本研究结果表明，PKCαC2 CBL单独介导的细胞内靶向性与天然C2结构域的质膜靶向性不同，且特异性较低。因此，在没有β3–4发夹的情况下，CBL主要针对TGN，与质膜的轻微结合仍然可以检测到。因此，单用CBL不足以实现特定的质膜靶向。这与另一个C2域，即cPLA的靶向机制形成了巨大对比₂α、 移植的CBL足以赋予cPLA的天然膜靶向特异性₂混合结构域上的α（高尔基和内质网膜）(埃文斯等。，2004).

虽然PKCαC2 CBL本身不足以赋予杂交C2结构域质膜特异性，但应该强调的是，该杂交结构域确实表现出Ca²⁺-依赖性膜结合，并在体内转移到有限的膜靶点。因此，这种杂交结构域的CBL保留其功能性Ca²⁺-活性结构及其与阴离子膜的结合。杂交结构域的TGN和质膜靶点都含有高水平的PS，因为TGN细胞质小叶是质膜细胞质小片的前体。对于观察到的杂交结构域靶向这些膜的最简单解释是，移植的CBL保留其与膜结合的PS头组的天然相互作用，从而确保主要转移到具有高PS密度的细胞膜。然而，很明显，这种减弱的特异性不足以确保向质膜的排他性移位。

β3–4发夹中碱性区在靶向细胞膜中的作用

生物物理研究表明，PKCαC2结构域的β链3和4形成的β发夹靠近质膜，因为该结构域相对于质膜的方向几乎平行(科胡特等。，2003)与早期预测类似(维达格尔等。，1999)。PKCαC2与Ca络合的进一步结构研究²⁺可溶性PS在β3–4发夹中显示了一个由四个赖氨酸残基组成的基本区域，该区域具有强大的正电荷(奥乔亚等。，2002)。在晶体结构中观察到K209和K211与可溶性PS之间的特定相互作用(奥乔亚等。，2002)。此外，K209和K211也参与了PIP的研究₂绑定(科尔巴兰·加西亚等。，2003)，而PS-和PIP₂-碱性区赖氨酸的突变降低了依赖性酶的激活(科尔巴兰·加西亚等。，2003；罗德里格斯-阿尔法罗等。，2004)。这些研究指出，β3–4发夹的基本区域是区别于CBL的第二个功能性脂质结合位点。本文提供的成像实验直接证明，β3-4发夹及其与PIP的相互作用₂对靶向质膜至关重要。因此，在cPLA中添加PKCαβ3–4发夹₂/PKC_CBLs杂交产生天然PKCαC2样靶向PIP₂-富含质膜的内叶。此外，蛋白-膜FRET研究最终证明，β3–4发夹对识别PIP至关重要₂通过混合域。第二个膜相互作用位点在质膜靶向和PIP中的重要性₂我们的实验进一步证实了这一认识，碱性区K209和K211的两个赖氨酸残基的突变促进了靶向主要是TGN而不是质膜。值得注意的是，PKCαC2结构域的β3–4发夹中的基本区域突变产生了与杂交C2结构域相同的易位模式，该结构域具有PKCαC2-CBLs，但缺乏β3–4.发夹。此外，我们的体外FRET研究表明PIP₂β3或β4链中赖氨酸的突变对结合有很大影响。总的来说，结果清楚地表明，β3–4发夹中的基本区域是正确靶向质膜和识别PIP所必需的第二个位点₂.

我们感谢J.-W.Soh提供的人类PKCα，M.Katan EGFP-PLCδ₁PH域和K.Simons用于TGN38-CFP和TGN38-YFP。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款GM063235（J.J.F.）、GM066147（D.M.）、HL061378和HL034303（C.C.L.）的支持。