Protein kinase Cθ C2 domain is a phosphotyrosine binding module that plays a key role in its activation

doi:10.1074/jbc.M112.391557

.2012年8月31日；287(36):30518-28.

doi:10.1074/jbc。M112.391557。 Epub 2012年7月11日。

蛋白激酶CθC2结构域是一个磷酸酪氨酸结合模块，在其激活中起关键作用

罗伯特·V·斯塔林¹, Kok-Fai Kong公司, 苏米塔·拉哈, 文田, 希瑟·R·梅洛维奇, 凯瑟琳·沃德, 戴安娜·默里, 阿姆诺·阿特曼, Wonhwa Cho公司

附属公司

PMID： 22787157
预防性维修识别码： PMC3436300型
内政部： 10.1074/jbc。M112.391557号

蛋白激酶CθC2结构域是一个磷酸酪氨酸结合模块，在其激活中起关键作用

罗伯特·V·斯塔林等。生物化学杂志. 2012.

.2012年8月31日；287(36):30518-28.

doi:10.1074/jbc。M112.391557。 Epub 2012年7月11日。

作者

罗伯特·V·斯塔林¹, Kok-Fai Kong公司, 苏米塔·拉哈, 文田, 希瑟·R·梅洛维奇, 凯瑟琳·沃德, 戴安娜·默里, 阿姆诺·阿特曼, Wonhwa Cho公司

附属

¹伊利诺伊大学化学系，芝加哥，美国伊利诺伊州60607。rstaheli@iupui.edu

PMID： 22787157
预防性维修识别码： PMC3436300型
内政部： 10.1074/jbc。M112.391557美元

摘要

蛋白激酶Cθ（PKCθ）是一种新型的PKC，在T淋巴细胞活化中起关键作用。为了了解PKCθ在T细胞中是如何调节的，我们研究了其作为自身抑制结构域的N末端C2结构域的性质。我们的测量表明，来自CDCP1的含Tyr（P）的肽以高亲和力结合PKCθ的C2结构域，并激活完整蛋白质的酶活性。Tyr（P）肽也与PKCδ的C2结构域紧密结合，但未观察到PKCδ激活酶。参与Tyr（P）结合的PKCθ-C2残基的突变消除了酶的激活以及PKCθ与Tyr磷酸化全长CDCP1的结合，并严重抑制了T细胞受体/CD28介导的PKCβ依赖报告基因在T细胞中的激活。总之，这些研究将PKCθ的C2结构域确定为Tyr（P）结合结构域，并表明该结构域可能通过其Tyr。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**PKCθ和PKCδC2结构域的序列比对和结构。** *A、，*在T-Coffee（48）中进行的大鼠PKCδ和人PKCθC2域C2域的序列比对显示52%的序列一致性。相同的残留物如所示红色，高度相似的残留物蓝色，类似残留物绿色和未经处理的残留物黑色.被认为对Tyr（P）肽结合重要的残基标记为*蓝色箭头*和Tyr⁹⁰PKCθ中磷酸化的标记为*星号。B类*，PKCδ-C2-CDCP1肽复合物的晶体结构（PDB条目1YRK）（18）。蛋白质显示在*表面表示法*使用PyMOL蓝色和红色定性地表示表面正静电势和负静电势。结合的Tyr（P）肽如*木棍表示法*注意，阳离子槽与中所示的Tyr（P）部分相互作用*红色.C*，a带状图PKCδ-C2模型的分子取向与图1相同B类。参与PKCδ-C2的Tyr（P）结合的残基侧链在*填充空间表示*和*标记。D类*以PKCδC2结构域为模板建立了PKCθC2结构域的同源模型。表面表示显示阳离子槽的存在，其与PKCδ-C2的Tyr（P）-结合口袋相当。E类,*带状图*PKCθ-C2模型的分子取向与图1相同D类参与PKCθ-C2的Tyr（P）结合的残基的侧链在*填充空间表示*和标记.

**图2。**
**平衡SPR分析测定PKCθ-C2-肽结合。** A类，显示了35、75、150、400和1000 n时PKCδ-C2的SPR绑定传感器图米为了测试非特异性结合，对照表面使用非磷酸化肽，该肽从Tyr（P）肽结合反应中减去，以校正折射率变化并产生显示的感测图。B类，饱和响应(*R（右）*_等式)PKCδ-C2在各个蛋白质浓度下的结合(对₀)在A类绘制了与[PKCδ-C2]拟合结合等温线的非线性最小二乘分析(*R（右）*_等式=*R（右）*_最大值/(1 +*K（K）_d日*/对₀)以确定*K（K）_d日*（见表1）。C类，显示了25、45、110、275和650 n时PKCθ-C2的SPR结合传感器图米减去非磷酸化肽控制表面进行折射率校正的Tyr（P）涂层表面。D类，如中所示B类，饱和响应(*R（右）*_等式)PKCθ-C2在每个蛋白浓度下的结合(对₀)在C类绘制以确定*K（K）_d日*对于PKCδ-C2和PKCθ-C2，在给定PKC浓度下，来自非磷酸化肽的结合信号通常小于来自Tyr（P）肽的信号的5%。

**图3。**
**PKCθ与CDCP1的关联。**如图所示，Jurkat-TAg T细胞与FLAG标记的CDCP1表达载体以及编码GFP标记的野生型或C2-突变的PKCθ载体（或空载体）的载体共同转染。用钠刺激细胞_三VO（旁白）₄（1米米)10分钟后溶解。抗-GFP免疫沉淀物(*IP（IP）*)或全部裂解产物通过SDS-PAGE溶解，转移到硝化纤维素中，并进行免疫印迹(*IB公司*)具有所指示的抗体。

**图4。**
**在Tyr（P）肽存在下PKCθ和PKCδ的酶活性。**30 n的激酶活性米在20min内存在不同浓度的Tyr（P）肽的情况下测量PKC米HEPES，pH 7.4，含0.16米KCl，5米米氯化镁₂和髓磷脂碱性蛋白（200μg/ml），但不存在脂质辅因子。每个数据点代表三次测量的平均值。计算相对活性，并与250μ米肽（0.02μmol/min/mg）。请注意，PKCδ显示肽的激活程度比PKCθ低得多。因为在200μ的存在下，PKCδ的活性高于PKCθ米POPC/POPS/DiC₁₈在我们的分析条件下（59:40:1）囊泡（见图5，A类和B类)，这种差异不是由于PKCδ的固有酶活性低所致。也，第页PKCθ和第页PKCδ在0至100μ之间时<0.33米泰尔（P）(*对酪氨酸*)表明PKCδ的活化度为100μ米Tyr（P）在统计学上没有意义。*误差线*、S.D。

**图5。**
**PKCδ、PKCθ和PKCσ突变体的PS和Tyr（P）依赖性活性。**30 n的激酶活性米PKCδ(A类)或PKCθ(B类)测量单位为20米米HEPES缓冲液，pH 7.4，含0.16米KCl，5米米氯化镁₂、髓磷脂碱性蛋白（200μg/ml）和200μ米POPC/POPS/DiC₁₈((89 −x个):x个：1）囊泡，有无5μ米肽。对于PKCθ突变体，酶测定在相同的条件下进行，除了固定浓度的PS(即POPC/POPS/DiC₁₈=89:10:1(C类)或POPC/POPS/DiC₁₈= 59:40:1 (D类))用于囊泡中。每个酒吧表示三次测量的平均值。计算相对活性，并与POPC/POPS/DiC获得的WT-PKCθ最大活性（0.08μmol/min/mg）进行比较₁₈（59:40:1）囊泡和250μ米肽。*白色条*，在没有Tyr（P）的情况下测得的激酶活性；*阴影条*，用5μ测量激酶活性米Tyr（P）肽。当PKCθ被250μ激活时米仅肽（0.07μmol/min/mg），添加200μ米POPC/POPS/DiC₁₈（59:40:1）囊泡适度增加了活性（0.08μmol/min/mg）。注意，在POPC/POPS/DiC存在下，PKCδ的固有活性（0.067μmol/min/mg）高于PKCθ（0.039μmol/min/mg）₁₈（59:40:1），但不含Tyr（P）肽。在POPC/POPS/DiC存在下PKCθ突变体的比活性（μmol/min/mg）₁₈（59:40:1）M52A、H63A和R68A的囊泡分别为0.038、0.037和0.037，表明这些突变不会改变脂质依赖性活性。*误差线*、S.D。

**图6。**
**PKCθ的Tyr（P）结合位点突变对其T细胞调节活性的影响。** A类Jurkat-TAg T细胞与编码GFP标记的野生型或C2突变PKCθ载体（或空载体）的载体以及RE/AP-Luc和β-gal报告基因共同转染。保持细胞未受刺激或用抗CD3和抗CD28单克隆抗体刺激6小时。将荧光素酶活性归一化为β-半乳糖活性测定三倍。*RLU（RLU）*，相对荧光素酶单位。B类流式细胞术分析转染GFP-PKCθ蛋白的表达，显示所有蛋白的表达水平相似。*误差线*、S.D。

**图7。**
**PKCθ的域结构示意图(A类)以及提出的PKCθ的膜结合和活化机制(B类).** A类，PKCθ的结构域组织示意性地显示为Tyr（P）的位置(*对酪氨酸*)C2域中的绑定口袋由*红色箭头。B类*，在PKCθ的静止状态下，Tyr⁹⁰未磷酸化，C2或C1B结构域均未完全暴露以实现最佳膜相互作用。在经典的激活机制中，Tyr的磷酸化⁹⁰诱导构象变化，通过脂质结合促进PKCθ的膜募集。C2域与PS的绑定(*黄色的*)以及随后的膜渗透和DAG(红色)C1B结构域的结合将假底物区域从活性部位拉出来，导致酶激活。不考虑Tyr⁹⁰磷酸化，C2结构域可以结合膜结合蛋白的Tyr（P），从而通过构象变化激活PKCθ，这也导致从活性位点去除假底物。PS和DAG结合可进一步激活蛋白质或延长其膜滞留和/或活化。

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