PKCα表达是乳腺癌侵袭性的标志
,1 ,1 ,1 ,1 ,1和
1 格里·卡尔斯塔德·勒纳
1瑞典马尔默大学医院隆德大学实验医学系分子病理学中心，SE-20502马尔默
路易丝·康马克
1瑞典马尔默大学医院隆德大学实验医学系分子病理学中心，SE-20502马尔默
伊里斯·奥马诺维奇-扎希罗维奇
1瑞典马尔默大学医院隆德大学实验医学系分子病理学中心，SE-20502马尔默
戈兰·兰德伯格
1瑞典马尔默大学医院隆德大学实验医学系分子病理学中心，SE-20502马尔默
卡琳·杰斯特罗姆
1瑞典马尔默大学医院隆德大学实验医学系分子病理学中心，SE-20502马尔默
克里斯特·拉尔森
1瑞典马尔默大学医院隆德大学实验医学系分子病理学中心，SE-20502马尔默
1隆德大学实验医学系分子病理学中心，马尔默大学医院，瑞典马尔默SE-205 02
通讯作者。 收到日期：2009年11月3日；2010年4月14日接受。
版权©2010 Lönne等人；被许可方BioMed Central Ltd。 摘要
背景
蛋白激酶C（PKC）亚型是乳腺癌治疗的潜在靶点。本研究旨在评估哪些PKC亚型可能是不同乳腺癌亚型的最佳靶点。
结果
在两组原发性乳腺癌患者中，PKCα水平与雌激素和孕激素受体阴性、肿瘤分级和增殖活性相关，而PKCδ和PKCε与临床病理参数无关。独立于其他因素，PKCα阳性肿瘤患者的生存率低于PKCα阴性肿瘤患者。细胞系研究表明，PKCα水平在MDA-MB-231中较高，而在增殖较慢的T47D细胞中不存在。此外，PKCα沉默降低了MDA-MB-231细胞的增殖。PKCα抑制或下调也会减少细胞迁移在体外.
结论
PKCα是乳腺癌预后不良的标志物，与乳腺癌进展相关的细胞功能相关并对其重要。
背景
乳腺癌是一种异质性疾病，包括几个具有不同形态、遗传变化和治疗反应的亚组[1,2]. 因此，重要的是要对每个亚组的相关治疗目标有更多的了解，以优化针对个别患者的定制治疗方案。许多细胞内信号蛋白被认为是阻断乳腺癌细胞恶性肿瘤的潜在靶点。蛋白激酶C（PKC）亚型就是这种潜在治疗靶点的例子。
PKC是一个丝氨酸/苏氨酸激酶家族，参与增殖、分化、凋亡和迁移等多种过程。PKC亚型根据调控域的结构分为三个亚组：经典亚型（PKCα、βI、βII和γ）、新型亚型（PKCδ、ε和θ）和非典型亚型（CKCζ和/λ）。经典和新型PKC包含一个二酰甘油（DAG）结合C1结构域，因此通过激活导致DAG生成的途径进行调节。非典型PKC对DAG不敏感，并以不同的方式进行调节[三].
一些研究表明，DAG敏感的经典和新型PKC亚型促进乳腺癌细胞的恶性特征。PKCα与雌激素受体（ER）阴性偶联[4]和培养细胞的雌激素依赖性生长[5,6]与PKCα阳性肿瘤患者相比，PKCα阴性肿瘤患者对内分泌治疗的反应更好[7,8]. 此外，PKCα表达增加导致更具攻击性的表型[4]与MCF-7细胞对细胞抑制药物的耐药性有关[9,10]. PKCα也被评估为乳腺癌的治疗靶点[11]. 然而，与正常乳腺组织相比，乳腺癌中PKCα水平降低[12,13]. 因此，有证据表明PKCα在乳腺癌中起促进和抑制作用。
PKCδ在乳腺癌中的作用尚不明确。与PKCδ阴性肿瘤患者相比，PKCδ阳性肿瘤患者的内分泌反应更好[8]和PKCδ已被证明对紫外线诱导的培养的乳腺癌细胞凋亡至关重要[14]. 然而，一些研究指出PKCδ在乳腺癌中的促肿瘤作用。PKCδ可诱导培养乳腺癌细胞对三苯氧胺和辐射的耐药性[15,16]并且已经证明可以促进两种转移[17-19]和扩散[20]小鼠乳腺癌和上皮细胞。我们最近发现PKCδ的缺失足以促使乳腺癌细胞凋亡[21].
PKCε在乳腺癌中经常被认为具有致癌作用。PKCε的表达水平与乳腺癌患者的肿瘤分级、HER2表达、ER阴性和生存率差有关。此外，在MDA-MB-231乳腺癌细胞中，PKCε的下调降低了小鼠的肿瘤生长和转移能力[22]. 也有证据表明PKCε保护细胞免受凋亡损伤[23-25].
综上所述在体外和体内数据表明，PKCα、PKCδ和PKCε是乳腺癌治疗靶点的未来候选指标，也是疾病预后的标志物。然而，到目前为止，对于不同亚型作为乳腺癌诊断和预后标记物的潜力，人们的认识还很有限。本研究通过分析这些PKC亚型在原发性乳腺癌组织中的表达水平，阐明了这一问题，我们的结果表明PKCα是乳腺癌侵袭性的潜在标志物。
方法
细胞培养
所有细胞系均取自ATCC。将MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌细胞保存在添加了10%胎牛血清（FBS；Invitrogen）、1mM丙酮酸钠（PAA laboratories Gmbh）、100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素（均为Gibco）的RPMI 1640培养基（Sigma）中。T47D细胞在补充有10%FBS、10 mM HEPES（PAA laboratories Gmbh）、100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中生长。MCF-7和T47D细胞培养基中额外添加了0.01 mg/ml胰岛素（诺和诺德A/S）。
转染
对于siRNA转染，细胞接种在35-50%的汇合处，并在不含抗生素的完整培养基中生长24小时。使用4μl/ml Lipofectamine 2000（Invitrogen）和40 nM siRNA（Invit罗gen，表)根据供应商协议，在Optimem（Gibco）中。
表1
| 小核糖核酸 | 寡核苷酸 |
|---|
| 控制 | GACAGUGUGACGUCGAUUGCAUG（加古古古古加古古堡） |
| PKCα#1 | CCGAGUGAAACUCACGGACUUCAAU公司 |
| PKCα#2 | CCAUCGAUUGUUCUUUUCUUCAUAA公司 |
| PKCδ | CCAAGUGUGUAUGUCUGUUCAGUA公司 |
| PKCε | 仙人掌 |
根据供应商的协议，用含有2μl/mL Lipofectamine 2000和2μg/mL DNA的Optimem替换正常培养基，进行质粒转染5小时。先前已经描述了编码与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合的PKC构建体的质粒[26].
肿瘤材料
第一组最初由114名在乌梅大学医院被诊断为乳腺癌的患者的肿瘤组成，并按照地区指南进行治疗。表中描述了队列。由于组织芯片中缺乏肿瘤材料，根据所研究的参数，可以分析42-60个肿瘤。Ki-67分为<20%和>20%阳性细胞两组。
表2
| 队列 | 我 | 二 |
|---|
| 患者人数 | 114 | 512 |
| 诊断年龄，中位数（范围） | 60 (30-80) | 65 (27-96) |
| 肿瘤大小（mm），中位数（范围） | 22 (8-100) | 16 (1-100) |
|
| 节点状态 | | |
| 积极的 | 53 | 168 |
| 否定 | 48 | 298 |
| 缺少 | 13 | 58 |
|
| ER状态 | | |
| 积极的 | 82 | 417 |
| 否定 | 31 | 72 |
| 缺少 | 1 | 35 |
第二组包括1988年至1992年间在马尔默大学医院病理科确诊的512例连续乳腺癌病例。表中描述了队列。由于组织芯片中缺乏肿瘤材料，根据所研究的参数，可以分析223-263个肿瘤。Ki-67分为三组，0-10%、11-25%和26-100%阳性细胞。
队列代表了与常见发病率相对应的所有组织学亚型的混合比例。组织微阵列的构建和队列的临床病理特性已在其他地方详细描述[27-32]. 获得了Lund和UmeáEthical董事会的道德许可。由于缺乏材料而无法评估PKC表达的肿瘤数量在表中表示为未评估。
细胞颗粒阵列
细胞在磷酸盐缓冲液（PBS）中清洗，并在最后5分钟内用梅耶苏木精（5μl/ml）在PBS中的4%多聚甲醛中固定25分钟。将细胞制成颗粒，去除多聚甲醛，然后在70%乙醇中培养过夜，然后使用浓度增加的乙醇进行脱水，最后使用二甲苯。脱水后，将细胞颗粒包埋在石蜡中并排列成细胞线阵列。
免疫组织化学
将石蜡块切片（4μm）干燥、脱蜡、再水化并在1×高pH（DAKO）目标回收溶液中进行微波处理。所有切片均在DAKO Techmate™机器中染色，并使用DAB进行可视化。使用的抗体为PKCα（1:2000）、PKCδ（1:1000）、PKCε（1:400；所有圣克鲁斯生物技术公司，产品编号sc-208、sc-937和sc-214）和Ki-67（1:200；DAKO）。用相同的染色溶液同时对一组患者的所有组织微阵列切片进行染色，确保每个肿瘤的条件相同。PKC染色根据细胞质染色强度进行评分，0表示缺乏染色，1表示低染色，2表示中等染色，3表示强染色。两名研究人员对所有队列进行了独立检查，并对不一致的结果进行了重新评估。对于乳腺癌细胞系的Ki-67分析，Ki-67染色强度被评分为阴性-低染色或中等-强染色。
样品制备和蛋白质印迹
细胞在冰镇PBS中清洗两次，并用RIPA缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.2，160 mM NaCl，1%Triton-X100，1%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠，1 mM EDTA，1 mM-EGTA）在冰上溶解30分钟，并添加40μl/ml完整蛋白酶抑制剂（罗氏应用科学）。通过在14000×克在4°C下保持10分钟。
用SDS-PAGE分离蛋白质并转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore）。用含有0.05%吐温和5%脱脂乳的PBS封闭膜，并用针对PKCδ（1:500）、PKCε（1:500）、PKCα（1:3000）和肌动蛋白（1:2000；MP Biomedics，克隆C4）的抗体探测膜。用辣根过氧化物酶标记的二级抗体（Amersham Biosciences），以SuperSignal系统（Pierce Chemical）为底物，观察蛋白质。化学发光用CCD摄像机（富士胶片）检测。
细胞生长分析（WST-1分析）
细胞以每孔2000个细胞的密度接种在96周的培养板中，并培养24小时。为了进行细胞系比较，在播种后24小时和48小时测量活细胞数。对于PKC的抑制或激活实验，2μM Gö6976（钙生物化学）或同等体积的二甲基亚砜，或16 nM 12-O（运行）-播种24小时后，在完全培养基（CM）或无血清培养基（SFM）中添加十四烷基佛波-13-醋酸盐（TPA；Sigma），并在估计活细胞数之前培养细胞72小时。活细胞数量通过WST-1细胞活性测定进行评估（罗氏应用科学公司）。在Antos 2020（Antos Labtech Instruments）的ELISA平板读取器中测量吸光度。
免疫荧光和共焦显微镜
PKCα的免疫荧光按所述进行[33]使用Alexa Fluor 488-共轭二级抗体。细胞使用蔡司LSM 710共焦系统进行检查，使用Alexa Fluor 488的标准设置。
细胞周期分析
MDA-MB-231细胞以每35 mm细胞培养皿10万个细胞的密度接种，并用siRNA转染。转染后，细胞在SFM或CM中培养24小时。将细胞胰蛋白酶化，并在-20°C的70%乙醇中固定20分钟，在PBS中洗涤，并用含有3.5μM Tris-HCl（pH 7.6）、10 mM NaCl、50μg/ml碘化丙啶（PI）、20μg/ml RNase和0.1%igepal CA-630的溶液在冰上培养20分钟，以标记DNA。在FL-2通道上为PI信号采集了10000个事件。使用CellQuest软件（Becton Dickinson）进行样品采集和分析。
伤口愈合分析
以每35 mm细胞培养皿150000个细胞的密度接种MDA-MB-231或MCF-7细胞，并用siRNA转染。转染后，用200μl移液管尖端在细胞培养皿的汇合区域划痕。在指定的时间点拍摄每个划痕的选定区域的照片。对于PKC抑制剂的实验，MDA-MB-231细胞以350000细胞/35 mm细胞培养皿的密度接种，并培养24小时，然后划痕并添加PKC抑制剂。在刮伤后0和16小时拍摄每个刮伤的选定区域的照片。使用ImageJ软件测量剩余的伤口面积。
统计
对于TMA分析，使用皮尔逊双尾显著性检验计算变量之间的相关性。使用χ2-测试。根据PKC的表达，采用Kaplan-Meier分析和对数秩检验来说明无复发生存期（RFS）和乳腺癌特异性生存期（BCSS）之间的差异。在单变量和多变量分析中，使用Cox回归比例风险模型估计PKCα表达对乳腺癌特异性生存率的影响，并根据诺丁汉组织学分级（NHG）、年龄、淋巴结状态和队列II的肿瘤大小进行调整。对于在体外实验中，通过方差分析（ANOVA）和邓肯（Duncan）多范围检验评估差异的显著性。如果第页-值<0.05。所有统计计算均使用SPSS V.11.0进行。
结果
PKC在乳腺癌肿瘤中的表达
对两组原发性乳腺癌患者（详见实验程序）进行PKC亚型表达分析。对几批抗体进行测试，以确定与其他亚型无交叉反应的抗体。交叉反应是PKC异构体分析中一个臭名昭著的问题。对于PKCα、PKCδ和PKCε，我们可以获得与其他亚型没有交叉反应的抗体（图和)。如图所示在同源亚型过度表达的一些细胞中，只有强烈的免疫反应。在图中可以看出，siRNA的下调消除或显著减少了抗体对同源亚型的染色。
原发性乳腺癌的免疫组织化学染色及抗体特异性的验证用编码PKCα（α）、PKCδ（δ）或PKCε。将转染细胞的颗粒排列在细胞系阵列中，并使用针对指示PKC亚型的抗体进行免疫组织化学。（C-J）队列II乳腺癌标本中PKCα的免疫组化染色示例，在20倍放大（C-F）和40倍放大（G-J）下显示阴性（C和G）、低（D和H）、中度（E和I）和强（F和J）染色。
当存在于肿瘤中时，所研究的所有PKC亚型通常都是细胞质的，并在所有肿瘤细胞中表达。因此，分析中只考虑了细胞质染色强度。图显示了不同PKCα染色强度的肿瘤示例，从阴性到强染色。
最初对较小队列（队列I）的TMA进行评估（表和)。PKCα染色强度与ER缺乏（p<0.001）、孕酮受体缺乏（PR；p=0.002）以及肿瘤分级（p=0.001）和增殖率（Ki-67；p<0.000）显著相关。PKCα水平与其他临床病理参数如局部或远端转移没有显著相关性（表)。PKCδ和PKCε与所分析的任何临床病理参数均无显著相关性（表).
表3
队列I和队列II中PKCα、PKCδ和PKCε强度与临床病理变量之间的相关性。
| 队列 | 我 | | | 二 | |
|---|
| 变量 | PKCα | PKCδ | PKCε | PKCα | PKCε |
|
| NHG公司 | | | | | |
| ρ | 0.401 | -0.049 | -0.029 | 0.247 | -0.011 |
| 第页 | 0.001 | 0.719 | 0.833 | <0.001 | 0.863 |
| n个 | 60 | 57 | 55 | 249 | 263 |
|
| 雌激素受体 | | | | | |
| ρ | -0.482 | 0.210 | -0.016 | -0.334 | 0.068 |
| 第页 | <0.001 | 0.120 | 0.907 | <0.001 | 0.273 |
| n个 | 59 | 56 | 54 | 244 | 261 |
|
| 孕酮受体 | | | | | |
| ρ | -0.402美元 | -0.081 | -0.216 | -0.280 | 0.062 |
| 第页 | 0.002 | 0.554 | 0.120 | <0.001 | 0.342 |
| n个 | 58 | 55 | 53 | 223 | 240 |
|
| Ki-67阳性 | | | | | |
| ρ | 0.535 | 0.229 | 0.280 | 0.295 | -0.056 |
| 第页 | <0.001 | 0.144 | 0.069 | <0.001 | 0.363 |
| n个 | 46 | 42 | 43 | 244 | 261 |
|
| 节点状态 | | | | | |
| ρ | -0.027 | 0.095 | -0.002 | 0.029 | 0.028 |
| 第页 | 0.842 | 0.495 | 0.987 | 0.666 | 0.667 |
| n个 | 56 | 54 | 52 | 224 | 233 |
|
| 远处转移 | | | | | |
| ρ | 0.159 | 0.162 | -0.064 | 0.090 | 0.037 |
| 第页 | 0.226 | 0.227 | 0.642 | 0.159 | 0.556 |
| n个 | 60 | 57 | 55 | 247 | 261 |
表4
队列I和队列II中PKCα、PKCδ和PKCε强度与组织学类型之间的关系。
| 第一组 | | 管道 | 小叶的 | 髓质 | 粘液的 | | |
|---|
| PKCα强度 | 0 | 25 | 三 | 0 | 2 | | |
| p*=0.295 | 1 | 20 | 0 | 1 | 0 | | |
| 2 | 4 | 0 | 0 | 0 | | |
| 三 | 4 | 0 | 1 | 0 | | |
| 不适用。 | 42 | 三 | 0 | 2 | | |
|
| | |
| PKCδ强度 | 0 | 12 | 0 | 0 | 1 | | |
| p*=0.850 | 1 | 33 | 1 | 2 | 1 | | |
| 2 | 7 | 0 | 0 | 0 | | |
| 三 | 0 | 0 | 0 | 0 | | |
| 不适用。 | 43 | 5 | 0 | 2 | | |
|
| | |
| PKCε强度 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | | |
| p*=0.800 | 1 | 12 | 0 | 1 | 0 | | |
| 2 | 29 | 1 | 1 | 2 | | |
| 三 | 9 | 0 | 0 | 0 | | |
| 不适用。 | 45 | 5 | 0 | 2 | | |
|
| | |
| 第二组 | | 管道 | 小叶的 | 髓质 | 粘液的 | 管状的 | 混合的 |
|
| PKCα强度 | 0 | 124 | 17 | 1 | 10 | 14 | 13 |
| 第页*<0.001 | 1 | 34 | 4 | 5 | 2 | 三 | 三 |
| 2 | 10 | 0 | 4 | 0 | 0 | 1 |
| 三 | 三 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 |
| 不适用。 | 168 | 52 | 三 | 5 | 17 | 17 |
|
|
| PKCε强度 | 0 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| p*=0.328 | 1 | 38 | 9 | 7 | 4 | 5 | 5 |
| 2 | 90 | 19 | 4 | 7 | 9 | 7 |
| 三 | 41 | 5 | 1 | 1 | 1 | 7 |
| 不适用。 | 168 | 39 | 三 | 5 | 19 | 15 |
更大的队列（队列II；表和)然后分析PKCα的表达水平，因为该亚型与第一队列中的几个临床病理参数和PKCε相关，因为我们的数据与已发表的研究有点矛盾[22]. 队列II的结果证实了队列I的发现，其中PKCα水平高的肿瘤增殖率较高（p<0.001），ER（p<0.00 1）和PR-阴性（p<00.001），组织学分级较高（p<0.001）。此外2分析表明，在队列II的不同组织学亚组中，PKCα水平高低的肿瘤分布不均匀（表)。这种偏斜分布与骨髓型肿瘤有关。符合以下标准的肿瘤被定义为髓质肿瘤：1）淋巴细胞质反应，2）显微镜下的界限，3）合胞体生长模式，4）分化差的核分级和高有丝分裂率。对于这一组，十二分之二的被调查肿瘤（17%）具有高PKCα表达水平，而所有被评估乳腺癌的相应数量为五分之二百五十（2%）。只有8%的髓质肿瘤PKCα阴性，而所有肿瘤的PKCα阳性率为72%。因此，在PKCα水平较高的肿瘤中，髓样癌的比例过高。PKCε的结果与队列I相似，与任何相关的临床病理参数无关。
PKCα表达与预后不良相关
接下来，我们分析了PKCα和PKCε的表达与患者10年生存率之间的关系（图)。如图所示，较低的PKCα水平与显著延长的10年RFS相关（p=0.050）。10年BCSS也出现了类似的趋势，但没有达到统计显著性（图; p=0.116）。由于大多数肿瘤的PKCα为阴性，而其他组（染色强度1-3）较小，因此将一个二分法变量定义为无染色和任何染色，用于无复发和乳腺癌特异性生存的相同分析。当进行二分法时，PKCα阳性与10年RFS较差的无显著性趋势相关，图; p=0.074）。然而，与PKCα阳性肿瘤患者相比，PKCα阴性肿瘤患者的10年BCSS显著改善（图; p=0.016）。我们还进行了Cox回归比例风险分析，证明了根据PKCα表达在单变量和多变量分析中对相对风险（RR）的估计，并根据诊断年龄、肿瘤大小、NHG、淋巴结状态和ER表达进行了调整（表)。这表明PKCα阳性与10年BCSS较差之间的相关性独立于既定的预后参数（多变量RR=2.123，95%CI 1.092至4.126，p=0.026）。
表5
根据PKCα在所有患者中的表达以及排除骨髓癌患者时，对队列II乳腺癌特异性生存期进行Cox单变量和多变量分析。
| 所有患者 | 髓样癌除外 |
|
|
| RR（95%置信区间） | p值 | RR（95%置信区间） | p值 |
|
|
| 单变量的 | | 单变量的 | |
| PKCα阴性 | 1 | | 1 | |
| PKCα阳性 | 2.105（1.148至3.862） | 0.016 | 1.995（1.069至3.721） | 0.030 |
| | | | |
| 多变量 | | 多变量 | |
| PKCα阴性 | 1 | | 1 | |
| PKCα阳性 | 2.123（1.092至4.126） | 0.026 | 1.978（0.984至3.975） | 0.055 |
根据PKCα和PKCε表达的无复发生存率和乳腺癌特异性生存率根据PKCα（A-D）和PKCε（E-H）的表达，Kaplan-Meier估计了10年无复发生存期（A-B和E-F）和乳腺癌特异性生存期（C-D和G-H）。
由于所分析的大多数髓样癌均为PKCα阳性，因此这些肿瘤患者通常预后良好[34]在排除髓样癌患者后，我们还检测了10年的BCSS，发现PKCα仍然是一个独立的预后因素（表).
无论是在所有组（染色强度0-3）中，还是在将其分为染色强度0-2和3时（图)。由于阴性肿瘤所占比例较小，因此选择了较高的临界值对PKCε进行二分。
PKC在乳腺癌细胞系中的表达
为了评估不同的乳腺癌细胞株是否代表肿瘤中PKC亚型的表达模式，我们测量了四种乳腺癌细胞系中PKC的水平（图)。与MCF-7和MDA-MB-468细胞相比，MDA-MB-231细胞中PKCα水平较高。在T47D细胞中未检测到PKCα。MCF-7细胞中PKCδ水平较高，而PKCε的表达水平没有显著差异。
乳腺癌细胞系PKC的表达与增殖Western blot显示T47D、MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌细胞（A）中PKCα、PKCδ和PKCε的表达水平。增殖细胞的细胞颗粒用抗Ki-67免疫组织化学染色。每个细胞系至少有200个细胞被评为阴性-弱染色或强染色强度（B）。培养24小时和48小时后，用WST-1法测定活细胞数。48小时与24小时的比值被用作细胞增殖的指标（C）。在所有实验中，细胞都是在完全培养基中生长的。蛋白质印迹是三个独立实验的代表。B和C中的数据为平均值±SEM，n=3。星号表示具有统计意义的差异(*第页<0.05和**第页<0.01）与其他细胞系（B和C）相比。
为了研究PKCα与肿瘤中观察到的高增殖率之间的关系，我们检测了细胞系的增殖率（图和)。T47D没有检测到PKCα，是增殖能力最低的细胞系，支持肿瘤数据。另一方面，对于PKCα水平明显最高的MDA-MB-231，97%的细胞具有中等或强的Ki-67染色强度（图)。对于PKCα水平较低但可检测到的细胞系MCF-7和MDA-MB-468，相应的数量分别为88%和91%。这与MDA-MB-231细胞没有显著差异，考虑到这些细胞系中阳性细胞的比例接近100%，这是不可预期的。Ki-67数据得到了细胞系生长率的支持，该生长率由培养48小时后的活细胞数与24小时后获得的细胞数之比估算得出（图).
PKCα在无血清条件下对乳腺癌细胞增殖至关重要
为了进一步研究PKCα对乳腺癌细胞增殖是否重要，研究了PKC激活剂和抑制剂的作用（图)。在无血清条件下，TPA对PKC的激活不足以增加细胞生长，正如活细胞的数量所表明的那样，这代表了增殖和细胞死亡的累积效应。TPA确实会影响PKCα，如PKCα重新定位到质膜上，并在MCF-7和MDA-MB-231细胞的细胞核中富集（图)。这表明经TPA治疗后PKCα被激活，但PKCα的总水平也降低（图)这使得TPA对细胞中PKCα净效应的估计变得复杂。
PKC激活或抑制后的细胞生长分析在WST-1分析之前，将T47D（A）、MCF-7（B）和MDA-MB-231（C）乳腺癌细胞在无血清培养基（SFM）或2μM Gö6976、GF109203X或同等体积的二甲基亚砜（DMSO）中无或存在16 nM TPA的培养基中培养72小时。数据（平均值±SEM，n=3）表示在控制条件下获得的活细胞百分比。用免疫荧光和共聚焦显微镜（D）检测PKCα在对照或TPA处理的MCF-7和MDA-MB-231细胞中的定位。通过Western blot（E）分析TPA或Gö6976治疗后PKCα的水平。
经典PKC抑制剂Gö6976并没有显著减少细胞数量，这表明PKCα的活性对正常条件下乳腺癌细胞的生长并不重要。
PKCα的促增殖作用与其催化活性无关[35]. 这一事实，加上TPA和Gö6976除了调节PKCα活性外，还可能具有非特异性的作用，导致我们使用siRNA寡核苷酸，然后分析细胞周期分布，更具体地分析PKCα的作用。在MDA-MB-231细胞中，PKCα水平被下调，两种siRNAs都以PKCα为靶点，这并不影响其他PKC亚型的表达水平（图)。当细胞在含血清的完全培养基中生长时，只有一种PKCα寡核苷酸（α#1）显著影响细胞周期分布（CM；图)。与对照组相比，寡核苷酸略微减少了S期细胞的数量。然而，在无血清培养基（SFM）下，与对照细胞相比，使用任一siRNA下调PKCα导致S期细胞数量显著减少（图)。结果表明，PKCα对细胞增殖起着重要作用，尤其是在亚优化条件下。在最佳生长条件下，PKCα可能是多余的增殖因子。
PKCα下调的MDA-MB-231细胞的细胞周期分布用靶向PKCα（α#1和α#2）或对照寡核苷酸的两种不同siRNA转染MDA-MB-231细胞。转染后，用完全培养基（CM）或无血清培养基（SFM）培养细胞24小时。贴壁细胞随后进行Western blot（A）或碘化丙啶染色和流式细胞术（B和C）。蛋白质印迹是三个独立实验的代表。B和C中的数据（平均值±SEM，n=3）显示了s期细胞的百分比。
PKCα活性对乳腺癌细胞迁移是必需的
在乳腺癌中，PKCα与细胞迁移能力的增强有关，因为PKCα的过度表达已被证明可以促进乳腺癌细胞的迁移和转移[4,36,37]. 基于此，我们旨在研究内源性PKCα对乳腺癌细胞运动的重要性。在没有或存在PKC抑制剂的情况下，对MDA-MB-231细胞进行伤口愈合分析（图)。在DMSO处理的细胞中，对经典PKCs（Gö6976）或经典和新型PKCs（GF109203X）的抑制分别将伤口闭合抑制到34%和56%，表明PKC活性对MDA-MB-231细胞的迁移能力很重要。由于PKC抑制剂是异型非特异性的，我们在伤口愈合试验之前用siRNA下调MDA-MB-231细胞中的PKCα，以更具体地研究PKCα在迁移中的作用。然而，PKCα的下调并不影响MDA-MB-231细胞的迁移（图)。与本研究中研究的其他细胞系相比，MDA-MB-231细胞具有较高的PKCα基础水平（图)。用靶向PKCα的siRNA转染这些细胞可能不能充分降低PKCα水平。与MCF-7细胞的比较（图)事实证明，在对MDA-MB-231细胞进行siRNA处理后，这些细胞中的PKCα水平与MCF-7细胞中的水平大致相同。因此，为了获得更实质性的PKCα耗竭，我们下调了MCF-7细胞中的PKCβ，然后进行了伤口愈合试验（图)。MCF-7细胞中PKCα的沉默并不影响研究的其他PKC亚型（图)。在这些细胞中，PKCα的下调显著减少了55%的对照细胞向伤口的迁移（图)。结果表明，PKCα活性对乳腺癌细胞的迁移至关重要在体外.
MDA-MB-231和MCF-7细胞的迁移MDA-MB-231细胞在存在或不存在PKC抑制剂（A）或转染靶向PKCα（α）或对照寡核苷酸（c）（B）的siRNA后进行创伤愈合试验。在进行创伤愈合试验（E）之前，MCF-7细胞（C和D）中的PKCα下调。数据（平均值±SEM，n=4）表明，与对照条件下的闭合相比，伤口闭合。星号表示具有统计意义的差异(*第页<0.05和**第页<0.01）。
讨论
一些研究表明，DAG-敏感的PKC亚型有助于乳腺癌的进展和乳腺癌细胞的恶性特征。尤其是PKCα、PKCδ和PKCε亚型已被强调为乳腺癌或疾病特定亚群治疗的潜在靶点。这导致我们设计了这项研究，其中检测了这些PKC亚型在原发性乳腺癌肿瘤中的表达，以评估其作为肿瘤侵袭性标记物的实用性。
为了证实这一分析，我们使用了两个不同的原发性乳腺癌肿瘤队列，队列的结果相似。我们发现PKCα水平与包括ER阴性在内的几种肿瘤侵袭性标记物之间存在显著相关性。最近的一项研究也观察到PKCα水平与ER阴性之间的相关性[8]使用70例接受过系统内分泌治疗的患者肿瘤。他们还表明，高PKCα水平预示着内分泌治疗的疗效较差，这也得到了早期对少数患者的研究的支持[7]. 我们的数据，如两个单独的队列所示，牢固地建立了PKCα和ER阴性之间的关系。此外，我们发现PKCα与PR阴性之间存在明显的相关性，与肿瘤分级和高增殖率呈正相关，进一步支持了PKCα表达与肿瘤侵袭性相关参数的观点。最后，对于PKCα阳性的原发性肿瘤患者，PKCα的表达预示着更糟糕的疾病结局，其10年乳腺癌特异性生存期明显较差。多变量分析结果进一步表明PKCα是乳腺癌的独立预后因素。
然而，其他研究表明，与正常乳腺组织相比，乳腺癌中PKCα的水平实际上降低了[12,13]. 这可能并不一定与我们的发现相矛盾，因为我们材料中的绝大多数癌症样本基本上都是PKCα阴性，这与PKCα下调是乳腺癌进展过程中常见事件的观点一致。因此，公布的数据和我们的结果表明，大多数乳腺癌是PKCα阴性的，但也有较小的亚组PKCα水平较高，表现出更具侵袭性的临床病理特征。如果PKCα被用作乳腺癌治疗的靶点，这些数据强调了在进行此类干预之前评估PKCα水平的必要性。
在最大队列（II）中，PKCα水平与组织学亚型也有显著相关性。在PKCα水平高的组中，骨髓组织学癌的代表性过高。此外，队列I中唯一的骨髓癌是PKCα阳性。
与肿瘤数据表明PKCα水平与侵袭性特征相关一致，在乳腺癌细胞系中也发现了PKCα与恶性特征的关联。PKCα水平升高与三苯氧胺相关并可诱导其产生[38,39]和多药[9,10]ER阳性细胞株的耐药性。此外，PKCα在MCF-7细胞中的过度表达导致增殖增加，这与我们的肿瘤数据一致[4]，但也使它们更容易受到凋亡损伤[40,41]. 我们发现，与其他细胞系相比，未检测到PKCα表达的细胞系T47D的Ki-67阳性细胞百分比更低，生长速度较慢，与肿瘤数据类似。然而，PKCα表达最高的细胞系MDA-MB-231与可检测但表达低得多的细胞系相比，Ki-67阳性率稍高。这可能与Ki-67阳性细胞比例较高（97%）且不能进一步升高有关。
血清中PKCα的抑制作用和血清饥饿时PKC的激活都不会影响细胞系的生长，从而支持PKCα对乳腺癌细胞生长的重要作用。最近的一篇论文表明，PKCα蛋白（而非活性）对胶质瘤细胞增殖至关重要[35]. 我们发现，用siRNA下调PKCα对在完全培养基中生长的MDA-MB-231细胞的细胞周期分布产生适度影响。然而，在无血清条件下，PKCα沉默明显减少了增殖细胞的数量，这表明，与胶质瘤细胞一样，PKCβ蛋白（但可能不是其催化活性）支持次优条件下的增殖。
研究在体外已经证明，增加MCF-7细胞中PKCα的表达会使其对PKC激活的反应更加迁移[42]. 我们对细胞株的实验表明，PKC活性支持MDA-MB-231细胞的迁移。然而，在该细胞系中用siRNA下调PKCα并不影响细胞迁移。MDA-MB-231细胞具有较高的PKCα基础表达水平，PKCα的不完全下调可能解释了其对细胞迁移缺乏影响。MCF-7细胞中PKCα的下调更有效地抑制了伤口愈合，支持了这一假设。因此，我们的数据表明，PKCα活性对乳腺癌细胞的迁移很重要，这与以前使用PKCα过度表达的研究结果一致。迁移倾向可能促进肿瘤的转移。然而，我们的肿瘤数据不支持PKCα在传播中的作用。PKCα的表达与淋巴结或远处转移无关。因此，PKCα对迁移的影响可能主要很重要在体外.
对于PKCδ，关于原发性肿瘤中表达水平的信息较少。一项研究表明，低水平的PKCδ，尤其是结合高PKCα，可以预测内分泌治疗的耐药性[8]. 在本研究中，我们未观察到PKCδ表达与相关临床病理参数之间的任何显著关联。因此，改变PKCδ表达似乎不是乳腺癌进展的先决条件。
PKCε被认为是侵袭性乳腺癌的标志物，因为据报道，其在激素受体阴性的高肿瘤级别乳腺癌中的表达升高HER2型放大[22]. 然而，PKCε表达与肿瘤分级之间的关系在本研究中未得到证实，这表明在代表所有乳腺癌组织学亚型的队列中可能并不明显。在更明确的乳腺癌亚组中，PKCε水平可能是侵袭性的标志。
结论
总之，我们的研究结果表明，PKCα的表达与乳腺癌ER和PR阴性以及高组织学分级和增殖率相关。PKCα在乳腺癌细胞增殖中也有重要作用在体外.PKCα的表达与乳腺癌样本的转移无关，但PKCα活性支持乳腺癌细胞的迁移在体外重要的是，PKCα的表达独立于已确定的预后参数，预测10年乳腺癌特异性生存率较差。因此，我们认为PKCα可能是乳腺癌预测和治疗分层的有用标记物。
作者的贡献
GKL评估了临床样本，进行了统计分析，参与了实验设计并完成了大部分实验工作，并汇编了手稿草稿。
LC做了一些实验工作。
IOZ参与了抗体和临床样本的评估。
德国劳埃德船级社监督了队列I的分析，并参与了解释性讨论。
KJ监督了队列II的分析和患者数据的统计分析，并帮助起草了手稿。
CL构思了这项研究，参与了实验工作的设计，并帮助起草了手稿。
所有作者阅读并批准了最终手稿。
致谢
我们感谢Elise Nilsson提供的出色技术援助。这项工作得到了瑞典癌症协会、瑞典研究委员会、瑞典儿童癌症基金会、马尔默大学医院研究基金会以及科克、克拉福德、奥利、埃洛夫·爱立信和冈纳·尼尔森基金会的资助。
工具书类
- Vargo-Gogola T，Rosen JM。乳腺癌建模：一种尺寸并不适合所有人。Nat Rev癌症。2007年；7:659–672. doi:10.1038/nrc2193。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Sorlie T、Perou CM、Tibshirani R、Aas T、Geisler S、Johnsen H、Hastie T、Eisen MB、Rijn M van de、Jeffrey SS。乳腺癌的基因表达模式区分具有临床意义的肿瘤亚类。美国国家科学院程序。2001;98:10869–10874. doi:10.1073/pnas.191367098。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- 牛顿AC.蛋白激酶C：磷酸化、辅因子和大分子相互作用的结构和空间调节。化学版次。2001;101:2353–2364. doi:10.1021/cr0002801。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Ways DK、Kukoly CA、deVente J、Hooker JL、Bryant WO、Posekany KJ、Fletcher DJ、Cook PP、Parker PJ。转染蛋白激酶C-α的MCF-7乳腺癌细胞表现出其他蛋白激酶C亚型的表达改变，并显示出更具侵袭性的肿瘤表型。临床投资杂志。1995;95:1906–1915. doi:10.1172/JCI117872。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Chisamore MJ，Ahmed Y，Bentrem DJ，Jordan VC，Tonetti DA。雌二醇对注射过表达蛋白激酶Cα的T47D乳腺癌细胞系的裸鼠的新型抗肿瘤作用临床癌症研究。2001;7:3156–3165.[公共医学][谷歌学者]
- Tonetti DA，Chisamore MJ，Grdina W，Schurz H，Jordan VC。蛋白激酶CαcDNA在激素依赖性乳腺癌细胞系中的稳定转染。英国癌症杂志。2000;83:782–791. doi:10.1054/bjoc.2000.1326。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Tonetti DA、Morrow M、Kidwai N、Gupta A、Badve S。蛋白激酶Cα表达升高可能预示他莫昔芬治疗失败。英国癌症杂志。2003年；88:1400–1402. doi:10.1038/sj.bjc.6600923。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Assender JW、Gee JM、Lewis I、Ellis IO、Robertson JF、Nicholson RI。蛋白激酶C亚型表达作为乳腺癌内分泌治疗疾病预后的预测因子。临床病理学杂志。2007年；60:1216–1221. doi:10.1136/jcp.2006.041616。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Gill PK，Gescher A，Gant TW。蛋白激酶C同工酶α和θ对人乳腺癌细胞MDR1启动子活性的调节。欧洲生物化学杂志。2001;268:4151–4157. doi:10.1046/j.1432-1327.2001.02326.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Blobe GC、Sachs CW、Khan WA、Fabbro D、Stabel S、Wetsel WC、Obeid LM、Fine RL、Hannun YA。选择性调节多药耐药MCF-7细胞中蛋白激酶C（PKC）同工酶的表达。PKCα表达增强的功能意义生物化学杂志。1993;268:658–664.[公共医学][谷歌学者]
- Roychowdhury D，Lahn M.针对蛋白激酶C-α的反义疗法（Affinitak，LY900003/ISIS 3521）：在乳腺癌中的潜在作用。塞明·昂科尔。2003年；30:30–33.[公共医学][谷歌学者]
- Ainsworth PD、Winstanley JH、Pearson JM、Bishop HM、Garrod DR。蛋白激酶Cα在正常乳腺、导管原位癌和浸润性导管癌中的表达。欧洲癌症杂志。2004;40:2269–2273. doi:10.1016/j.ejca.2004.06.027。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Kerfoot C，Huang W，Rotenberg SA。晚期乳腺癌的免疫组织化学分析显示蛋白激酶Cα下调组织化学与细胞化学杂志。2004;52:419–422.[公共医学][谷歌学者]
- Zeidan YH、Wu BX、Jenkins RW、Obeid LM、Hannun YA。蛋白激酶Cδ介导的酸性鞘磷脂酶磷酸化在紫外线诱导线粒体损伤中的新作用。法塞布J。2008;22:183–193. 网址：10.1096/fj.07-8967com。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- McCracken MA、Miraglia LJ、McKay RA、Strobl JS。蛋白激酶Cδ是人类乳腺癌细胞系中的生存因子。摩尔癌症治疗。2003年；2:273–281.[公共医学][谷歌学者]
- Nabha SM、Glaros S、Hong M、Lykkesfeldt AE、Schiff R、Osborne K、Reddy KB。PKC-δ的上调有助于乳腺肿瘤细胞抗雌激素抵抗。致癌物。2005;24:3166–3176. doi:10.1038/sj.onc.1208502。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Alonso-Escolano D、Medina C、Cieslik K、Radomski A、Jurasz P、Santos-Martinez MJ、Jiffar T、Ruvolo P、Radomski MW。蛋白激酶Cδ介导血小板诱导的乳腺癌细胞侵袭。药理学实验与治疗杂志。2006年；318:373–380. doi:10.1124/jpet.106.103358。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Kiley SC、Clark KJ、Duddy SK、Welch DR、Jaken S.乳腺肿瘤细胞中蛋白激酶Cδ增加：与转化和转移进展的关系。致癌物。1999;18:6748–6757. doi:10.1038/sj.onc.1203101。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Kiley SC、Clark KJ、Goodnough M、Welch DR、Jaken S.蛋白激酶Cδ参与乳腺癌细胞转移。癌症研究。1999;59:3230–3238.[公共医学][谷歌学者]
- Grossoni VC、Falbo KB、Kazanietz MG、de Kier Joffe ED、Urtreger AJ。蛋白激酶Cδ增强小鼠乳腺细胞的增殖和存活。霉菌致癌。2007年；46:381–390. doi:10.1002/mc.20287。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Lönne GK，Masoumi KC，Lennartsson J，Larsson C。蛋白激酶Cδ通过抑制ERK1/2通路支持MDA-MB-231乳腺癌细胞的存活。生物化学杂志。2009年；284:33456–33465. doi:10.1074/jbc。M109.036186。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Pan Q，Bao LW，Kleer CG，Sabel MS，Griffith KA，Teknos TN，Merajver SD。蛋白激酶Cε是侵袭性乳腺癌的预测性生物标志物，是RNA干扰抗癌治疗的有效靶点。癌症研究。2005;65：8366–8371。doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-0553。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Lu D，Sivaprasad U，Huang J，Shankar E，Morrow S，Basu A。蛋白激酶C-ε通过抑制Bax易位来保护MCF-7细胞免受TNF介导的细胞死亡。细胞凋亡。2007. [公共医学]
- Sivaprasad U，Shankar E，Basu A.Bid下调与PKCε介导的TRAIL抵抗相关。细胞死亡不同。2007年；14：851–860。doi:10.1038/sj.cdd.4402077。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Lu D，Huang J，Basu A.PKB的解除对乳腺癌细胞中PKC抗凋亡信号的影响。国际癌症杂志。2004;25:671–676.[公共医学][谷歌学者]
- Zeidman R、Lofgren B、Pahlman S、Larsson C.PKCε通过其调节域并独立于其催化域，诱导神经母细胞瘤细胞中的神经突样过程。细胞生物学杂志。1999;145:713–726. doi:10.1083/jcb.145.4.713。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Nielsen NH、Arnerlov C、Emdin SO、Landberg G.Cyclin E过度表达，乳腺癌的一个负面预后因素，与雌激素受体状态密切相关。英国癌症杂志。1996年；74:874–880. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
- Nielsen NH、Emdin SO、Cajander J、Landberg G.乳腺癌中细胞周期蛋白E和D1的放松调节与视网膜母细胞瘤蛋白的失活有关。致癌物。1997;14:295–304. doi:10.1038/sj.onc.1200833。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Roos G、Nilsson P、Cajander S、Nielsen NH、Arnerlov C、Landberg G。乳腺癌中端粒酶活性与p53状态和临床病理参数的关系。国际癌症杂志。1998年；79:343–348. doi:10.1002/（SICI）1097-0215（19980821）79:4<343:：AID-IJC6>3.0.CO；2伏。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Svensson S、Jirstrom K、Ryden L、Roos G、Emdin S、Ostrowski MC、Landberg G。ERK磷酸化与乳腺癌中VEGFR2表达和Ets-2磷酸化相关，与三苯氧胺治疗耐药和预后良好的小肿瘤相关。致癌物。2005;24:4370–4379. doi:10.1038/sj.onc.1208626。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Borgquist S、Holm C、Stendahl M、Anagostaki L、Landberg G、Jirstrom K。雌激素受体α和β与临床病理参数有不同的相关性，它们的共同表达可能预示乳腺癌内分泌治疗的更好反应。临床病理学杂志。2008;61:197–203. doi:10.1136/jcp.2006.040378。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Helczynska K、Larsson A-M、Holmquist Mengelbier L、Bridges E、Fredlund E、Borgquist S、Landberg G、Pahlman S、Jirstrom K。低氧诱导因子-2α与侵袭性乳腺癌的远处复发和不良预后相关。癌症研究。2008;68:9212–9220. doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-1135。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Raghunath A，Ling M，Larsson C。催化域限制了蛋白激酶Cα的移位，以响应Ca2+和二酰甘油的增加。生物化学杂志。2003年；370:901–912. doi:10.1042/BJ20021420。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Malyuchik SS，Kiyamova RG公司。髓样乳腺癌。Exp Oncol公司。2008;30:96–101.[公共医学][谷歌学者]
- Cameron AJ、Procyk KJ、Leitges M、Parker PJ。PKCα蛋白而非激酶活性对胶质瘤细胞的增殖和存活至关重要。国际癌症杂志。2008;123：769–779。doi:10.1002/ijc.23560。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Ng T、Shima D、Squire A、Bastiaens PI、Gschmeisner S、Humphries MJ、Parker PJ。PKCα通过结合和控制整合素流量调节β1整合素依赖的细胞运动。Embo J。1999;18:3909–3923. doi:10.1093/emboj/1814.3909。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Abeyweera TP，Chen X，Rotenberg SA。蛋白激酶Cα对α6-微管蛋白的磷酸化激活人类乳腺细胞的运动。生物化学杂志。2009[PMC免费文章][公共医学]
- Frankel LB、Lykkesfeldt AE、Hansen JB、Stenvang J.蛋白激酶Cα是抗雌激素抵抗的标志物，参与三苯氧胺耐药人类乳腺癌细胞的生长。乳腺癌研究治疗。2007年；104:165–179. doi:10.1007/s10549-006-9399-1。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Lin X，Yu Y，Zhao H，Zhang Y，Manela J，Tonetti DA。在T47D人乳腺癌肿瘤模型中，需要过度表达PKCα才能实现雌二醇抑制和他莫昔芬耐药。致癌。2006年；27:1538–1546. doi:10.1093/carcin/bgl002。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Yde CW、Gyrd-Hansen M、Lykkesfeldt AE、Issinger OG、Stenvang J.获得性抗雌激素抵抗的乳腺癌细胞对顺铂诱导的细胞死亡敏感。摩尔癌症治疗。2007年；6:1869–1876. doi:10.1158/1535-7163.MCT-07-0072。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- de Vente JE、Kukoly CA、Bryant WO、Posekany KJ、Chen J、Fletcher DJ、Parker PJ、Pettit GJ、Lozano G、Cook PP。磷酸酯类通过蛋白激酶C亚型表达的改变诱导MCF-7乳腺癌细胞死亡。p53诱导gadd-45依赖性诱导在引发死亡中的作用。临床投资杂志。1995;96:1874–1886. doi:10.1172/JCI118233。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Parsons M、Keppler MD、Kline A、Messent A、Humphries MJ、Gilchrist R、Hart IR、Quittau-Prevestel C、Hughes WE、Parker PJ、Ng T.蛋白质激酶C-整合素相互作用的定点扰动阻断癌细胞趋化性。分子细胞生物学。2002;22:5897–5911. doi:10.1128/MCB.22.16.5897-5911.2002。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
