主要
细胞自噬涉及将胞浆区域隔离在双层膜结合的隔室中，然后成熟并降解其细胞质内容物。这是一个高度调控的过程，其成分最近才通过使用酵母遗传学的广泛研究得到鉴定。由于在酿酒酵母，一系列自噬基因现已被描述，其许多产物的作用机制已被确定，其哺乳动物和其他同源物也已被确定1。在本次审查中，我们将使用符号自动液位计新采用的自噬基因命名法2有大量文献描述了一些研究，在这些研究中，新的遗传工具被用来证明细胞功能和有机体发育的许多方面都需要自噬及其机制或两者兼而有之。例如，人类贝克林1，酵母的同源物自动液位计6，已被证明是一种肿瘤抑制基因三饥饿反应也需要自噬：达尔形成于秀丽隐杆线虫需要功能beclin1（参考。4)以及盘状网柄菌在氮饥饿期间需要酵母的功能同系物自动液位计5和ATG7型（参考。5). 此外，在这两者中拟南芥6,7和秀丽线虫4，需要野生型自噬基因来防止过早衰老。
一个有吸引力的假设是，自噬对细胞溶质结构的降解可能在“清除”细胞内病原体方面起着普遍作用。电子显微镜（EM）研究经常报告观察到多泡体内的细胞内病毒和细菌8此外，在感染乙型肝炎的黑猩猩身上发现了一种称为肝脏“净化”的无法解释的现象。在感染后10周，这些受感染动物中多达75%的肝细胞被证明含有病毒蛋白，但在没有大规模细胞死亡的情况下，到了20周，这些肝细胞被证实是无病毒的9因此，必须有非常有效的抗菌机制，不涉及细胞凋亡或免疫系统对受感染肝细胞的破坏。在这篇综述中，我们将讨论积累的功能证据，即自噬是先天免疫反应的一个组成部分，具有抗病毒和抗菌功能。虽然这篇综述将集中于病毒和细胞内细菌，但一些报告也指出了真核生物寄生虫和自噬途径成分之间的相互作用10,11.
自噬结构
EM对细胞自噬过程的研究显示，细胞结构由两个不同的脂质双层包围；这些结构被称为自噬体(). 这些结构的内膜围绕着电子密度与细胞质相当的材料，而两个分隔膜之间的腔区是电子透明的。自噬体很大，在酵母中直径为400-900纳米，在哺乳动物细胞中直径为500-1500纳米12-含有细胞质和细胞质细胞器，如断裂的内质网（ER）、线粒体和过氧化物酶体.自噬体还包含来自内质网、内体和溶酶体的蛋白质标记物的混合物，以及大量的细胞质内容物13,14,15中提供了用于识别自噬体的标记物列表.
GFP–Atg5表达的人类细胞自噬的免疫电镜观察。附件5−/−用绿色荧光蛋白标记的酵母Atg5（GFP–Atg5）稳定转染小鼠胚胎干细胞，并在Hanks溶液中培养2h诱导自噬。使用抗GFP抗体通过银增强免疫金电镜检查GFP–Atg5的定位。一–d日|一系列图像显示了自噬体形成过程中膜延伸和细胞溶质隔离的推测进展。e（电子）|自噬体的一个例子。（f）|自体溶酶体的例子。比例尺，1μm。经参考文献允许复制。17©（2001）洛克菲勒大学出版社。
来自多种细胞来源的标记物的存在使得很难确定自噬体膜的起源。根据超微结构观察和粗内质网蛋白抗血清对自噬体的识别，内质网被认为是这些膜的来源16另一种假设是，小的含脂小泡融合形成一种独特的C形结构，称为“隔离新月体”。观察到由Atg5蛋白标记的小的膜结构支持了这一点，Atg5可能是成熟自噬体的结构前体17这种结构从隔离膜开始到封闭进入自噬体的推测进展如所示这些假说的最终解决可能需要等待无细胞系统的发展来研究自噬体的形成。尽管自噬因细胞成分的破坏而得名，但很明显，除了最终降解被隔离的胞浆外，还有几个过程构成了自噬途径，包括细胞信号传递、膜重排和室间混合。
自噬途径及其机制
自噬可分为三个阶段：开始、执行和成熟(). 自噬的启动可由多种细胞外信号触发，包括营养缺乏和激素治疗。这些信号的一个目标是任务大纲（第个目标，共个雷帕霉素)，一种抑制自噬途径的激酶，直到该蛋白通过去磷酸化而失活。TOR是一种全球细胞调节器，也控制蛋白质翻译和氨基酸合成18雷帕霉素和营养缺乏导致TOR去磷酸化，进而激活自噬途径。第三种化合物，塔莫西芬，已知可诱导自噬，但尚不清楚这是否通过TOR或其他途径介导19.
自噬途径。自噬体和自溶体的诱导、执行和成熟的已知步骤。绿线和箭头分别表示诱导自噬的激活或抑制事件；红线表示抑制自噬的事件。在每个形态步骤中出现的标记都显示在关键字中，还有几个已知的抑制剂以及它们被认为起作用的步骤（红色方框）。由于这些抑制剂的多效性作用，在解释使用所有这些抑制剂获得的结果时必须谨慎。3-甲基腺嘌呤；DAMP、，N个-（3-[2,4-二硝基苯基]-氨基）丙基-l-N个-（3-氨丙基-甲胺）二盐酸盐）；溶酶体相关膜蛋白；LC3，微管相关蛋白轻链3；MDC，单丹酰卡达韦；PE、磷脂酰乙醇胺；磷脂酰肌醇-3-激酶；TOR，雷帕霉素的靶点。
对癌细胞系的研究表明，三聚体G第3页蛋白质和I类和II类磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3Ks）在自噬隔离前的一个步骤中发挥作用20,21事实上，最近研究表明，高浓度的氨基酸会导致三聚体G蛋白失活，这表明除了抑制TOR通路外，还存在另一种机制，氨基酸耗竭可能通过TOR通路激活自噬22许多常用的自噬抑制剂，包括3-甲基腺嘌呤（3-MA）、沃特曼和LY294002，针对所有细胞PI3K。然而，研究表明，正是III类PI3Ks及其产生的磷酸三酰肌醇-3-磷酸对饥饿诱导的自噬信号和自噬体形成至关重要21胞浆的自噬隔离也被证明受到俄卡达酸表明蛋白磷酸酶2A在饥饿诱导的自噬体形成中的作用23总之，诱导自噬的信号是由TOR、PI3Ks、蛋白磷酸酶和三聚体G蛋白通过目前尚不完全了解的途径介导的。
自噬体执行的关键阶段由两条非常有趣的共价共轭途径介导：Atg5的共价连接和附件12和共价脂化附件8磷脂酰乙醇胺。调节这些结合的酶-Atg3型，附件7和附件10-是与蛋白质有关的酶的同源物泛化24,25然而，与泛素化不同，自噬中的蛋白质结合用于修饰通路成分，而不是标记降解底物。
Atg5和Atg12的共价连接通过几个步骤完成：187-氨基酸Atg12蛋白的羧基末端甘氨酸首先通过与Atg7的瞬时共价连接激活，然后再与Atg10共价连接，最后与Atg5的Lys130共价连接（参考文献26–28). 缺乏接合所需赖氨酸残基的Atg5蛋白突变形式不会形成Atg5–Atg12–第16页复合物或自噬体，但仍与膜相关。这表明Atg5本身包含一个膜靶向结构域，可能负责整个复合物的靶向17。如所示和，Atg5–Atg12–Atg16复合物仅存在于隔离新月体上，这是一种双膜结合结构，吞噬细胞溶质成分，形成明显闭合的双膜结合自噬体。
第二条共轭途径导致脂质磷脂酰乙醇胺共价添加到微管相关蛋白轻链3新生成的羧基末端(生命周期3)，人类同源酿酒酵母半胱氨酸蛋白酶Atg4裂解LC3的羧基末端氨基酸，留下保守的甘氨酸残基。然后，裂解的LC3暂时与Atg7蛋白连接，然后与Atg3连接，最后与磷脂酰乙醇胺连接29.LC3的脂质氧化对于膜结合是必要的和充分的，如，修饰的LC3仍与自噬体相关，直到自溶体阶段被破坏。
形成后，自噬体与内胚小泡融合，获得溶酶体相关膜蛋白1(灯1)和灯2，并获得累积DAMP的能力(N个-（3-[2,4-二硝基苯基]-氨基）丙基-l-N个（3-氨丙基-甲胺）二盐酸盐），从而成为中间自噬体30(). 这些结构与溶酶体融合并获得凯瑟琳和酸性磷酸酶成为成熟的自溶体(). 囊泡融合通常由小GTPases介导，如RAB蛋白31最近，一种孤儿小GTPase Rab24被证明与自噬体特异相关，尽管其在自噬体内的运输、融合和成熟的作用尚不清楚，但这可能为自噬小体形成的晚期事件提供了一条重要线索，并为自噬结构提供了一个额外的标记32.
自噬途径的检测
有许多方法可以识别和量化自噬体的形成和功能(). EM分析细胞自噬过程是一种经典而重要的方法。自噬可以通过电子显微照片进行量化，这通常需要估计自噬体结构中包含的体积，与细胞质其余部分中的体积相比。此外，根据形态，自噬体可分为两类，如EM所示：未成熟（或早期）自噬小体()在细胞质物质周围有两个或多个双层，而成熟的自溶体()密度更均匀，失去早期自噬体特有的内膜。
不幸的是，很少有蛋白质被特异性地保留在自噬体中。而Atg5只标记早期的自噬体结构()，两者都是酿酒酵母Atg8及其人类同源物LC3保留在自噬体膜中，直到成熟完成29这些标记物在免疫电子显微镜和荧光显微镜中的使用极大地促进了自噬体结构的鉴定33.
一些鉴定自噬体的方法使用在参与自噬体形成的各种细胞室和细胞器中积累并标记的化合物。其中一种化合物是LysoTracker（美国分子探针公司），它通常会对溶酶体进行染色34.DAMP是一种非荧光分子，与LysoTracker类似，它积聚在酸性隔间中30就个体而言，这些化合物并不能唯一地对自噬体进行染色；然而，当与检测自噬途径中的蛋白质结合使用时，它们可以帮助研究人员将自噬体与细胞中的其他结构区分开来。
单丹磺酰尸胺（MDC）是一种荧光化合物，也被证明能染色自噬体35MDC可以并入活细胞中，在活细胞中染色极化膜，并在紫外光激发下变成荧光。自噬体的特异性是在无洗涤剂固定后实现的，可能是在单细胞膜失去极性后，但由自噬体双细胞膜维持。然而，文献中对固定在使用MDC中的重要性存在混淆。在没有固定的情况下，这种染色可能与LysoTracker或DAMP一样，不是一种特殊的自噬体染色。
自噬体形成的量化主要依赖于细胞溶质隔离的生化分析。乳酸脱氢酶（LDH）和[三H] 标记的惰性糖可用于测量细胞膜与细胞溶质分离后被困在自噬结构中的隔离细胞溶质的数量14,36隔离LDH的定量是一种很好的检测方法，但预计它会低估自噬体形成所捕获的细胞质数量，因为任何发展为自溶体的LDH都会被降解。
为了监测自噬途径的终点——吞噬的细胞溶质成分的降解——可以测量长寿命蛋白质的破坏。细胞通常被代谢标记为[三H] -亮氨酸或[14C] -缬氨酸，然后在没有标记氨基酸的情况下孵育48小时，以降解短寿命蛋白质。然后确定剩余标记蛋白质的损失率；自噬与这一比率的增加有关36长期以来，对长寿命蛋白质降解速率变化的分析被认为是诊断自噬的最佳方法。然而，由于许多微生物本身编码蛋白酶，可能导致自噬过程的高估，并可能抑制自噬体成熟，可能导致对自噬小体形成的低估，因此该方法应与其他分析结合使用。
发现了自动液位计酵母和哺乳动物细胞自噬所需的基因和其他基因为诊断细菌或病毒感染等感兴趣的过程是否需要这些基因的野生型功能提供了一种杰出的方法。研究人员现在开始使用老鼠、植物、线虫和果蝇属和RNA干扰人类细胞，以测试消除或减少这些基因表达对相关过程的影响，如发育、转化和微生物感染。将基因功能降低的任何影响归因于该基因对自噬的影响显然依赖于该基因的唯一功能是自噬这一假设。然而，新鉴定的酵母同源物自动液位计基因为剖析自噬机制及其在许多有趣的细胞过程中的作用提供了强有力的新工具。
细菌对自噬的敏感性
在植物感染中，自噬与细菌感染之间的关系已被假定黄芪通过生根瘤菌37细菌在膜结合的隔间内分化，表现出改变的形态，直到它们能够固定氮并与植物形成共生关系。在受感染的植物根瘤营养缺乏的情况下，可以看到细菌降解的迹象。这导致了一种假设，即土壤中养分耗尽可能导致的自噬会导致植物在感染细菌分化为固氮形式之前消灭它们，因为在这些条件下，植物支持共生体没有任何好处。
最早在潜在自噬结构中发现细菌的例子之一是在含有酸性磷酸酶的双层膜结合囊泡中观察到立克次体38随后，双膜结合结构的存在与细菌破坏之间的关系被显示出来。The growth of柯诺里立克次体发现对干扰素（IFN）或肿瘤坏死因子-α敏感(肿瘤坏死因子-α)宿主小鼠或小鼠衍生细胞的治疗，这些细胞因子治疗与细胞一氧化氮（NO）产生的增加相关39,40,41在这些细胞因子存在的情况下，感染的小鼠内皮细胞的EM成像清楚地显示出细菌被双层膜包围，在某些情况下，细菌似乎受到了损伤，可能是由于降解42研究还表明，提供细胞内NO供体可以部分模拟细胞因子的抗立克次体作用，而竞争性NO合成抑制剂可以消除这些作用42众所周知，NO在先天免疫中起着重要的抗菌作用，这表明NO的产生可能直接激活自噬，作为杀死入侵细菌的机制。或者，细菌可能被活性氧物种杀死，随后被自噬体吸收降解。确定NO供体治疗是否对自噬有直接影响，并寻找NO生成、自噬和细菌存活之间的潜在相关性，将是一件有趣的事情。
最近的一份报告表明单核细胞增生李斯特菌可以被自噬体靶向43.单核细胞增生李斯特菌正常情况下，细菌通过吞噬作用进入宿主细胞，然后从吞噬体逃逸并在宿主细胞细胞质内繁殖。突变体ΔactA不能聚合肌动蛋白的细菌可以从进入的吞噬体中逃逸，但在细胞内和细胞间传播能力方面存在缺陷，并被双层膜结合的小泡吞噬。众所周知，沃特曼素可以抑制自噬，减少细菌进入这些假定的自噬体，而感染细胞的血清饥饿会增加细菌对膜泡的吸收。此外，通过EM成像和LAMP1与细菌抗原的共定位，已经确定了充满细菌的自噬体43.
细胞内细菌感染鼠伤寒沙门菌已知通过两种不同的途径杀死人类巨噬细胞：一种由分泌的细菌蛋白结合介导的快速凋亡途径唾液B到主机半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（参考。44)以及较慢的caspase-1独立机制。半胱天冬酶1的超微结构−/−感染野生型的巨噬细胞鼠伤寒沙门氏菌但不是那些感染III型分泌缺陷型病毒的人唾液D突变细菌表现出自噬特征，如MDC固定后染色和多层膜小泡数量增加45然而，对于本节中的所有示例，尚不清楚在鼠伤寒沙门氏菌巨噬细胞的感染在限制细菌生长方面有任何作用。
细菌对自噬途径的破坏
与上述情况相反，几种细菌可以破坏自噬途径，并在装饰有自噬体特征成分的隔间内复制。例如，牙龈卟啉单胞菌可以感染人冠状动脉内皮细胞，由于在细菌复制周期的早期存在ER标记物，后来又增加了溶酶体标记物，已证明其定位于被怀疑为自噬体的膜室46,47当沃特曼素被添加到宿主细胞中时，可能阻止了自噬体样结构的初步形成，细菌液泡中出现了质的变化：囊泡类似于溶酶体而不是自噬小体，并且获得了组织蛋白酶L在它们形成的早期和获得ER标记之前。就功能而言，细胞内的存活牙龈假单胞菌在3-MA或沃特曼宁的存在下显著降低，这表明显然由这些处理引起的溶酶体命运对细菌有害。
细菌潜在自噬破坏的大多数例子都需要细菌IV型分泌途径的功能，这些分泌途径与共轭质粒转移系统同源，并导致细菌蛋白质被感染细胞吸收。例如，在内胚体被哺乳动物细胞吸收后，流产布鲁氏菌定位于类似自噬体的结构，因为它们具有双层膜，并显示ER和晚期内体的标记48,49与自噬或自噬成分在细菌复制中的积极作用一致，发现3-MA和沃特曼均能减少布鲁氏菌属生长，而宿主细胞饥饿略微增加了细菌产量。这个virB布鲁氏菌操纵子编码IV型分泌途径的成员，病毒B突变体在正常细胞内运输和生长中有缺陷50,51以及他们本地化以获取的隔间组织蛋白酶D几乎立刻。对于两者牙龈假单胞菌和B.流产有人提出，细菌一旦进入细胞，就会立即进入新诱导的自噬体。由于沃特曼治疗或病毒B突变，导致细菌被溶酶体吸收并降解，如47,48,52.
细菌的自噬隔离。一|的电子显微照片柯诺里立克次体接种并添加细胞因子后36h感染小鼠内皮细胞。箭头表示立克次体细胞，位于双层膜结合的隔间内。箭头表示完好无损R.科诺里在细胞溶质中。b条|细菌感染刺激自噬体功能（红色箭头），细菌避免吞噬体命运的情况卟啉单胞菌属和布鲁氏菌属感染。c|细菌感染延迟自噬体形成的情况（红色钝头箭头）军团菌和立克次体感染。一经参考文献允许复制。42©（1997）自然出版集团。
一个充分研究过的细菌依赖IV型分泌途径来避免溶酶体命运的例子是嗜肺军团菌是一种革兰氏阴性病原体，可在人类巨噬细胞内复制。在实验中，自噬机制与膜泡的形成有关，膜泡内军团菌EM显示，这些小室被双层膜包围，并含有诸如ER-滞留蛋白BiP、溶酶体/内体标记LAMP1等标记，在较小比例的小泡中，还含有溶酶体蛋白组织蛋白酶D53,54,55,56突变导致细胞器运输或细胞内增殖缺陷的基因，称为点或国际货币基金组织基因-是必需的军团菌在人类巨噬细胞中复制，但在细菌生长介质中不复制。军团菌细菌，其中点/icm突变的基因在感染早期被错误定位，并且没有定位于双膜结合的囊泡，而是定位于具有晚期内体或溶酶体特征的囊泡55,57,58,59。进一步的工作表明点/icm基因编码IV型分泌系统的蛋白质60,61,62.在“怀孕暂停”模型中11,军团菌以及其他与液泡相关的病原体进入细胞并定位于自噬体。然后，通过需要IV型分泌器官进入宿主细胞质的细菌蛋白质的作用，这些自噬体样结构向自溶体的成熟被延迟。有人提出，这种延迟使微生物有时间发育成能够耐受自溶体环境的复制形式().
然而，自噬体的起源军团菌复制隔间一直存在争议。一些超微结构EM分析显示，细菌周围的结构似乎是粗糙的内质网63此外，室的形成对SAR1号机组和年度报告1，编码小GTP结合蛋白的基因，这些蛋白通常参与内质网和高尔基体之间的交通64.英寸D.盘状体，是军团菌，功能丧失等位基因atg1处,第5天,atg6,第7天和第8天基因显示了预期的自噬缺陷，但对细胞的生长也没有影响嗜肺军团菌或其复制室的形态65当然，细菌可能在这些不同的宿主中使用不同的复制策略。既然可以在哺乳动物细胞中使用类似的遗传方法，就有可能测试自噬所需基因的功能丧失等位基因是否影响细胞的功能、组成或超微结构军团菌人类巨噬细胞中的复制室。
与…密切相关的细菌军团菌,贝氏柯克斯体，是Q热.喜欢军团菌,burnetii梭菌已经证明在酸性囊泡中复制66,67.这些柯克西拉菌复制区室也显示出一些自噬特征，例如用自噬特异性标记物LC3以及溶酶体和晚期内体标记物标记34,66,68,69,70,71Rab7的显性负性表达改变了这些蛋白的大小和数量柯克西拉菌-包含小室，与溶酶体融合在其成熟过程中的作用一致34如果自噬途径参与了这些区室的形成，溶酶体融合能力可能会影响自噬诱导或细菌利用自噬成分的妊娠暂停模型，并且这些想法显然不是相互排斥的。分离诱导自噬小体形成、延迟自噬体成熟或两者兼而有之的效应分子，将加强自噬在复制空泡形成中的作用，并允许进一步测试自噬诱导和妊娠暂停模型。可以发现细菌破坏细胞自噬的共同机制。与此视图一致点/icm在中发现的同源物柯克西拉菌被证明可以挽救军团菌dot/icm突变细菌72然而，由这些可互换的IV型分泌机器输送的分子是否具有类似的功能尚待测试。
是否存在延迟自噬体成熟的I型病毒分泌依赖因子的候选基因？领先的候选人是两个方面都表达出来的因素军团菌和立克次体显示出与真核生物的同源性第7页鸟嘌呤核苷酸交换因子，已知参与膜融合和转运60. The军团菌SEC7同源物，拉尔夫已证明以I型病毒依赖性方式分泌，并将细胞ADP核糖基化因子ARF1招募到军团菌吞噬体。因此，RalF有可能在改变真空的贩运方面发挥作用62.虽然在拉尔夫不影响细胞内细菌的产量62，它可能在细胞内生长军团菌如果有的话，在人类巨噬细胞中是多余的。
关于细菌分泌的自噬的可能诱导物，一个候选者是幽门螺杆菌细胞毒素VacA具有多种作用，包括诱导细胞凋亡、细胞色素cT细胞活化的释放和抑制，取决于细胞类型73在其众多作用中，VacA已被证明能诱导酸性空泡的增殖，这些酸性空泡带有晚期内吞体和溶酶体标记，并可能在进一步研究中显示出自噬体的其他特征73,74,75.
自噬与病毒：回避与投降
对病毒感染过程的研究表明，自噬在从感染细胞中清除疱疹病毒中起着直接作用，这些细胞在表达双链RNA活化蛋白激酶方面存在差异巴基斯坦卢比是细胞抗病毒反应的关键组成部分(方框1). 激活的PKR的功能之一是磷酸化真核翻译启动因子eIF2α从而抑制和解除对细胞翻译的管制。单纯疱疹病毒1编码一种蛋白，ICP34.5，通过将细胞磷酸酶重定向到去磷酸化eIF2α来对抗这种功能。在缺乏PKR的小鼠中，由编码ICP34.5的基因缺失导致的疱疹病毒生长减少被证明是完全逆转的76因此，疱疹病毒的唯一目的ICP34.5型基因可能会抵消PKR激活的影响。
PKR的抗病毒作用是什么？众所周知，PKR激活可以改变细胞翻译、诱导凋亡和激活核因子-κB(核因子-κB)以及其他不太典型的效果(方框1)77如塔洛齐所示等.78PKR激活的下游后果之一是激活自噬。野生型疱疹病毒感染野生型小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）并没有导致长寿命蛋白质降解量的显著增加或自噬空泡总体积的增加78然而，疱疹病毒的类似感染ICP34.5型基因被删除后，这两种自噬指标均增加，而当变异型或野生型疱疹病毒感染时，自噬没有增加巴基斯坦卢比−/−MEF公司78因此，PKR激活对于在感染ΔICP34.5疱疹病毒。
激活PKR导致自噬增加的信号途径是什么？仅表达不能磷酸化的eIF2α突变版本的MEF在感染ΔICP34.5疱疹病毒78因此，PKR和可磷酸化的eIF2α对疱疹病毒诱导自噬是必要的；它们是否足够尚不清楚。
自噬是PKR诱导的特异性抗病毒反应吗ΔICP34.5疱疹病毒相对于野生型病毒，因此表明ICP34.5的功能之一是防止自噬？ICP34.5通过刺激eIF2α的去磷酸化，可以拮抗PKR对eIF2β磷酸化的任何下游影响(方框1)自噬很可能是其中的一个候选基因。事实上，使用抑制剂阻断eIF2α磷酸化的作用之一是可能是为了抑制自噬的诱导。
表2
dsRNA介导的PKR激活和eIF2α磷酸化的病毒抑制剂
自噬与病毒：颠覆
乔治·帕拉德实验室对病毒感染细胞进行了一些首次EM分析。脊髓灰质炎病毒感染细胞的研究()显示存在大量直径为200-400nm的膜小泡，由于小泡内腔中存在“细胞质基质”，这些膜小泡被假定为“通过类似于自溶小泡形成的机制发育”79.
脊髓灰质炎病毒感染过程中双膜结合囊泡的形成。|一|感染后7小时，化学固定的脊髓灰质炎病毒感染的HeLa细胞的电子显微照片。”B'表示双膜结合囊泡体的细胞溶质腔Va'表示一个液泡，似乎不是多层膜M’表示线粒体。脊髓灰质炎病毒颗粒，无论是单个的还是成群的，都可以在细胞质中看到，偶尔也可以在双层膜囊泡的腔中看到（箭头所示）。插图以较高的放大率显示主图像中由白色虚线勾勒出的区域。主图像中的比例尺，0.6μm；嵌入标尺，0.25μm。b条|通过高压冷冻保存和冷冻替代保存的脊髓灰质炎病毒感染的HeLa细胞感染后2.5 h的电子显微照片。箭头所示为双膜结合结构，具有明显的细胞溶质腔，与感染后后期所见类似。显示了具有内质网特征的分布和形态的膜（ER）N’表示原子核。比例尺，0.2μm。c|感染后4.5小时脊髓灰质炎病毒感染的HeLa细胞中晚期内体/溶酶体蛋白LAMP1的免疫定位。箭头表示与二级抗体结合的选定金颗粒。”L’表示溶酶体。比例尺，0.2μm。一经参考文献允许复制。79©（1965）爱思唯尔科学；b条和c经参考文献允许复制。85©（1996）ASM版权所有。
阳性链RNA病毒都需要膜表面来组装其RNA复制复合物80,81对这些膜的起源提出了几个假设，其中包括丙型肝炎病毒的内质网82，禽霍乱病毒的线粒体外膜83脊髓灰质炎病毒的自噬膜（参考文献79,84,85；W·T·J。等.，未发表的意见）。我们的实验室假设，脊髓灰质炎病毒RNA复制复合物的膜定位功能之一是-正如DNA噬菌体Φ29（参考文献86,87)-细胞膜提供一个二维表面，在其上组装与底物RNA协同结合所需的病毒蛋白的规则寡聚格88.
对于少数正链病毒，特别是脊髓灰质炎病毒、马动脉病毒（EAV）和鼠肝炎病毒（MHV），有证据表明，RNA复制复合物形成的膜类似于自噬体，含有自噬途径的已知成分，或两者兼而有之。对于脊髓灰质炎病毒，我们的实验室进行了Palade及其同事的原始观察，以表明脊髓灰质病毒感染期间诱导的膜类似于自噬体，因为在感染早期就存在双膜结合形态()，用抗LAMP1标记()以及低浮力密度84最近，发现脊髓灰质炎病毒RNA-复制复合体的蛋白质与共转染的绿色荧光蛋白（GFP）-LC3融合蛋白共定位，该融合蛋白是已知的自噬体标记(). 在脊髓灰质炎病毒感染后3小时内，GFP–LC3和LAMP1被显示为共定位，而在未感染的细胞中没有发现共定位（W.T.J。等.，未发表的意见）。然而，脊髓灰质炎病毒诱导的囊泡的另一种来源是酵母的人类同源物的存在第31节和第13节蛋白质，两者都是COPII公司从内质网中萌发的顺行运输囊泡89这一发现可能为这一观察提供了一种可能的解释，即在酵母中，编码COPII外壳蛋白的基因突变导致自噬缺陷90,91因此，尽管尚未进行测试，但COPII蛋白可能是自噬机制的正常组成部分，或者在某些情况下可以与之结合。
脊髓灰质炎病毒RNA-复制复合体与自噬体或自噬组分的结直肠化可能是由于病毒复制复合体使用这些组分或自吞噬机制破坏病毒结构所致。如果后一种情况是正确的，人们会期望通过雷帕霉素或三苯氧胺治疗预先诱导自噬来降低病毒产量。然而，产生了相反的效果：雷帕霉素或三苯氧胺治疗使脊髓灰质炎病毒产量增加3-5倍（W.T.J。等.，未发表的意见）。因此，自噬机制很可能在脊髓灰质炎病毒感染期间没有破坏作用，反而有助于形成病毒RNA-复制复合物。如果脊髓灰质炎病毒诱导的膜来源于自噬途径，可能是由于双膜结合结构的优势，病毒产物延迟了自噬体样结构进入降解室的成熟，正如已经提出的那样军团菌().
EAV和MHV都是奈多韦类病毒的成员，奈多韦类病毒是RNA病毒的一种，包括最近发现的导致严重急性呼吸综合征的人类冠状病毒(非典). 在感染EAV、MHV或SARS冠状病毒期间，由双脂双层结合的膜泡积聚92,93,94,95在EAV感染细胞中()，这些囊泡的直径为80–100 nm94而MHV感染的细胞含有双膜结合的小泡，其大小与脊髓灰质炎病毒感染细胞中的小泡相似，直径为200–350 nm（参考文献。93). 免疫电子显微镜显示，RNA-复制复合物和新合成的溴脲标记RNA的蛋白质和双膜结合囊泡直接相关93,94,96,97.
EAV感染期间双膜结合囊泡的形成以及EAV蛋白nsp2和nsp3的表达。一|用马动脉病毒（EAV）感染RK-13细胞8h，冰冻切片用抗nsp2标记，然后进行蛋白-A-金检测。比例尺，0.1μm。b条–d日|RK-13细胞的冷冻免疫电子显微术，其中EAV蛋白nsp2和nsp3使用Sindbis病毒载体以前体形式表达。金标签检测nsp2(一,c)和nsp3(d日); 箭头表示选定的黄金颗粒。感染后8–12小时收集细胞。比例尺，0.1μm。内质网。一经参考文献允许复制。94©（1999）ASM版权所有。b条–d日经参考文献允许复制。100©（2001）普通微生物学学会。
在MHV的病例中，病毒诱导的细胞膜上存在的细胞标记与它们来自自噬途径的来源一致：晚期内体蛋白和LC3均被发现与病毒RNA-复制蛋白在这些膜上共同定位98,99此外，感染细胞中长寿命蛋白质的降解率从1.3%增加到2%98重要的是，细胞外病毒的产量在附件5−/−表达Atg5的质粒恢复了小鼠胚胎干细胞和野生型产量（参考文献。98). 在缺乏自噬机制的关键组成部分的情况下，病毒产量的降低清楚地表明，该途径并不主要起降解该病毒的作用。相反，这强烈表明野生型Atg5是感染性MHV病毒形成所必需的，或者作为直接参与这一过程的宿主因子，或者假设其在哺乳动物细胞中的唯一功能是在自噬途径中，通过允许自噬膜的形成，可能起到RNA复制平台的作用。由于被感染细胞中某种类型的膜的存在被消除，导致产量如此惊人的下降，这也许是令人惊讶的。当蜂群病毒（一种能在酿酒酵母中复制其基因组的阳性RNA病毒）的RNA复制复合体从其正常线粒体位置重新定向到内质网时，RNA复制的效率非但没有降低，反而提高了六倍84确定细胞外MHV生产中对Atg5的强烈需求的原因将非常有意义。这可能是因为Atg5在这一过程中起着直接作用，因为它有助于诱导自噬膜，或者是由于Atg5的某些其他功能。
病毒蛋白的系统表达（单独或联合）已经确定了第一个形成双膜结合囊泡的病毒编码分子诱导物：脊髓灰质炎病毒蛋白2BC和3A以及EAV蛋白nsp2和nsp3。比较EAV感染期间诱导的膜的超微结构和免疫染色()在EAV蛋白nsp2和nsp3存在的情况下()100类似地，发现脊髓灰质炎病毒感染细胞的形态与仅表达病毒蛋白2BC和3A的细胞相似84免疫荧光显示，在2BC和3A存在下形成的膜在低浮力密度和LC3和LAMP1染色方面也与脊髓灰质炎病毒感染细胞形成的膜相似（W.T.J。等.，未发表的意见）。
RNA-病毒蛋白利用自噬途径的成分诱导双膜结合囊泡的机制尚不清楚。对于不同病毒和自噬途径本身诱导的不同大小的囊泡的理解，将等待对导致膜弯曲的蛋白质的鉴定。EAV蛋白和脊髓灰质炎病毒2C都含有核苷5′-三磷酸（NTP）结合基序101奇怪的是，表达脊髓灰质炎病毒3A和2C但不表达前体2BC的细胞的超微结构与感染MHV的细胞非常相似附件5−/−细胞，具有明显的ER-衍生膜，含有细胞质内陷84,98很容易推测，这些结构代表了膜-囊泡形成的中间产物，其中膜已经内陷，但尚未分解为自主囊泡。
总结
如图所示一些不同的细胞内细菌和阳性RNA病毒被认为既能刺激带有自噬标记的细胞膜的积累，又能抑制其成熟。为什么某些病毒和细胞内细菌使用来自自噬途径的蛋白质，可能还有膜？如果细菌在具有自噬体特征的小室中复制，这可能会提供一个细胞质但受到保护的环境，从而保护细菌免受宿主反应的影响。这里讨论的病毒和细菌可能利用高度诱导的细胞自噬途径增殖所需的膜而不触发细胞防御。由此产生的隔间的逐步成熟()可以根据诱导或抑制的步骤微调pH值或蛋白质或脂质组成(). 最后，例如，脊髓灰质炎病毒感染期间形成的双膜结合囊泡的细胞质内腔有时含有子代病毒粒子(). 这些小泡可能是感染后期形成的小泡，因此被吞噬的细胞质中已经含有成熟的病毒颗粒。这些病毒可能会被真诚地自噬。然而，也有可能是，双膜结合囊泡的独特拓扑结构允许一定量的专性细胞内微生物的胞外输送，而无需细胞溶解。众所周知，感染性脊髓灰质炎病毒能够从极化细胞单层的顶端表面流出，而不会破坏上皮片的完整性102；这种非溶血性细胞通过这种病毒和其他溶血性病毒退出的机制尚不清楚。
细菌和病毒对自噬途径或其成分的潜在破坏。细胞内细菌和病毒可能诱导或干扰自噬体发育的拟议阶段。所列病毒和细菌诱导形成双膜结合的隔间，这些隔间带有自噬途径的标记。这些结构的双膜结合形态的持续存在表明，如果它们类似于自噬体，则其成熟为自溶体的过程被阻止。在军团菌膜显示溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）获得延迟，而脊髓灰质炎病毒诱导的膜含有LAMP1；因此，军团菌和脊髓灰质炎病毒被提议在不同的步骤阻断自噬成熟。内质网；LC3，微管相关蛋白轻链3；PE，磷脂酰乙醇胺。
自噬途径与细胞内细菌和病毒感染周期之间的相互作用是复杂的。在自噬体形成和成熟到自溶体的破坏过程中，许多微生物无疑被吞噬。成功的微生物，如进化为通过PKR抑制eIF2α磷酸化的病毒，也有可能至少部分避免这种破坏。一些细菌和病毒似乎利用自噬途径的成分来促进其复制。了解微生物篡夺自噬成分的机制以及与之相关的分子可能有助于剖析细胞自噬过程及其颠覆。
证据中添加的注释
最近，一项基因筛查已鉴定出多种新型蛋白底物嗜肺军团菌dot/icm易位装置，所有这些都是伴随宿主膜重排的分子效应器的潜在候选军团菌感染。参见参考。128了解详细信息。
方框1 |涉及PKR的信号通路
PKR激活具有强烈抗病毒作用的最令人信服的证据可能来自于病毒为避免PKR激活所花费的惊人的时间及其后果(). PKR最初被发现是因为它在感染期间具有抗病毒作用103双标记RNA（dsRNA）通常存在于病毒感染过程中，要么是RNA病毒复制的副产物，要么是DNA病毒紧凑基因组重叠转录的产物。dsRNA是PKR的一种已知变构效应物，它引起PKR的构象变化，随后发生二聚化并激活其激酶活性。活化后，PKR磷酸化几种底物，包括其他PKR单体、蛋白磷酸酶2A（PP2A）的调节亚单位和真核生物翻译起始因子eIF2α。众所周知，磷酸化可提高PP2A复合物的活性，该复合物具有许多靶点。eIF2α的磷酸化阻止了eIF2–GDP复合物的再循环，这大大抑制了大多数翻译起始-宿主和病毒-这需要起始转移RNA，tRNA遇见然而，一些信使RNA在eIF2α磷酸化条件下选择性翻译。其中包括那些需要使用替代AUG密码子的密码子。降低生产启动频率可以允许通过上游AUG进行扫描104,105因此，dsRNA激活PKR（通常被描述为抑制翻译）对翻译的影响可能比单纯的抑制更为微妙，并且可能实际上激活一些mRNA的翻译，尤其是那些上游开放阅读框的mRNA。
PKR激活也激活核因子-κB（NF-κB）77-宿主抗病毒反应的已知参与者-但这是通过一种不需要eIF2α或PP2A磷酸化的机制发生的。其他表达受PKR刺激影响的基因和基因产物如图所示。PKR被激活的大多数信号转导途径不使用dsRNA激活机制，而是使用各种上游效应器，其中一些本身是激酶，可以直接磷酸化PKR。
已知可避免PKR抑制的病毒因子的作用机制()包括与PKR结合但不激活的RNA、滴定dsRNA的蛋白质以及作为激活PKR靶点的eIF2α诱饵，从而保护真正的翻译机制。另一种病毒PKR抑制剂ICP34.5型由单纯疱疹病毒1（HSV1）编码的基因产物与蛋白磷酸酶1a结合，使其去磷酸化eIF2α，从而逆转PKR对eIF2 a磷酸化的影响106推测，ICP34.5或任何其他中和PKR对eIF2α磷酸化作用的病毒产物的表达也会通过哺乳动物细胞中其他三种细胞eIF2β激酶中的任何一种逆转PKR磷酸化。这些是GCN2，在氨基酸饥饿时被激活；胰腺ER激酶（PERK），在内质网应激期间被激活；和血红素调节的eIF2α激酶（HRI），在血红素耗竭期间被激活77FADD，FAS相关死亡域；IκB，NF-κB的抑制剂；IKK、IκB激酶；JNK、c-JUN氨基末端激酶。
