Inhibition of PKR activation by the proline-rich RNA binding domain of the herpes simplex virus type 1 Us11 protein

doi:10.1128/jvi.74.23.11215-11221.2000

.2000年12月；74(23):11215-21.

doi:10.1128/jvi.74.23.11215-11221.2000。

单纯疱疹病毒1型Us11蛋白富含脯氨酸的RNA结合域对PKR激活的抑制作用

J波普尔¹, M Mulvey先生, D Khoo公司, I莫尔

附属公司

PMID： 11070019
预防性维修识别码：项目编号113216
内政部： 10.1128/jvi.74.23.11215-11221.2000

单纯疱疹病毒1型Us11蛋白富含脯氨酸的RNA结合域对PKR激活的抑制作用

J提升阀等。 J维罗尔. 2000年12月.

.2000年12月；74(23):11215-21.

doi:10.1128/jvi.74.23.11215-11221.2000。

作者

J波普尔¹, M Mulvey先生, D Khoo公司, I莫尔

附属

¹美国纽约州纽约市纽约大学医学院微生物与卡普兰综合癌症中心系，邮编：10016。

PMID： 11070019
预防性维修识别码：第113216页
内政部： 10.1128/jvi.74.23.11215-11221.2000年

摘要

病毒感染细胞中的双链RNA激活后，细胞PKR激酶磷酸化翻译起始因子真核起始因子2（eIF2），从而抑制蛋白质合成。由单纯疱疹病毒1型（HSV-1）编码的γ34.5和Us11基因产物致力于防止磷酸化eIF2的积累。虽然γ34.5基因指定了蛋白磷酸酶1α的调节亚单位，但Us11基因编码的RNA结合蛋白也阻止PKR激活。γ34.5突变体无法在多种人类细胞上生长，因为磷酸化eIF2积累，蛋白质合成在病毒生命周期完成之前停止。我们证明，含有新的富含脯氨酸的碱性RNA结合域的Us11的68氨基酸片段的表达允许持续的蛋白质合成和增强γ34.5突变体的生长。此外，该片段足以在无细胞系统中抑制细胞PKR激酶的激活，这表明该小片段的固有活性，尤其是RNA结合和核糖体结合，可能需要阻止PKR激活。

PubMed免责声明

数字

图1
靶向结构体及其设计表达的Us11相关蛋白。所示质粒中HSV-1 tk基因的5′和3′区域靶向基因组病毒tk位点的同源重组，并创建tk阴性重组病毒。HSV-1α27启动子的转录发生在感染后的即刻早期，该启动子转录的方向用箭头指示。转录物在poly（A）处被聚腺苷化⁺添加位点位于3′tk区。11S-UF表达来自野生型巴顿菌株的全长155-氨基酸Us11蛋白。编码氨基酸末端87氨基酸的区域被着色，而编码羧基末端68氨基酸的区域则显示为棋盘。Δ88-155表达氨基末端87个氨基酸，Δ5-87将氨基末端4个氨基酸融合到羧基末端68个残基。Δ5-87fs在密码子3处包含一个单核苷酸插入，导致+1移码（fs），但在其他方面与Δ5-87中的插入相同。

图2
（A） tk阴性重组病毒基因组的物理分析。病毒DNA用*Pvu公司*II和千磅一、通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，转移到尼龙膜上，并杂交到³²P标记*Bsp公司*EI公司-*Bst公司*EII探针来自tk基因的3′区。11S-UF结构的探针位置和相关限制位点如图所示。编码氨基酸末端87氨基酸的Us11基因片段被遮蔽，而编码羧基末端68氨基酸的片段则显示为棋盘。含有Us11羧基末端区域的重组基因组对千磅I和产生较小的片段，将其与仅表达Us11氨基末端87氨基酸的重组病毒和包含完整tk基因的非重组病毒（以Δ34.5病毒为代表）区分开来。所有plaque纯化的重组病毒都是均一的tk阴性等位基因，完全没有与野生型tk阳性病毒相结合的片段就证明了这一点*Pvu公司*Δ34.5亲本基因组中包含的II片段。（B）用tk阴性重组病毒生产Us11相关蛋白。用11S-UF、Δ5-87、Δ5-87fs或Δ88-155模拟感染U373细胞或在MOI为5时感染。在感染后6 h，制备裂解物，并在17.5%聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE对多肽进行分离，并将电泳转移到膜上，该膜用针对Us11的氨基或羧基末端的抗体进行检测。

图3
含有RNA结合域的Us11的羧基末端片段对Δ34.5突变体具有生长优势。非许可U373细胞（3×10⁶细胞）感染8000个11S-UF、Δ5-87、Δ5-87fs或Δ88-155的PFU。37°C下4.5天后，用10%三氯乙酸固定细胞，并用结晶紫染色。

图4
在感染Δ34.5突变体的细胞中，需要表达Us11 RNA结合域来克服蛋白质合成障碍。非许可性U373细胞被模拟感染或感染Δ88-155、Δ5-87、Δ5-87fs或11S-UF，MOI为50。在1小时脉冲后³⁵S-氨基酸在感染后10小时，蛋白质在样品缓冲液中溶解，并在12.5%聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE进行分离。随后将固定的干燥凝胶暴露在柯达XAR胶片上。左边的数字是以千道尔顿为单位的分子质量。

图5
68氨基酸Us11 RNA结合域抑制PKR激活。（A）在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并用考马斯蓝染色。（B）向293 S10提取物中添加更多纯化GST、GSTΔ1-87或GST△88-155。添加呼肠孤病毒dsRNA后，将反应混合物在30°C下孵育30分钟。免疫沉淀PKR，并通过SDS-PAGE分离免疫复合物。将凝胶固定并暴露在柯达XAR胶片上。每块面板左侧的数字表示以千道尔顿为单位的分子质量。

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[6] Chien C Y、Tejero R、Huang Y、Zimmerman D E、Rios C B、Krug R M、Montelione G T。甲型流感病毒非结构蛋白1中的一种新的RNA结合基序。自然结构生物学。1997;4:891–895。-公共医学

[7] Chou J，Roizman B.单纯疱疹病毒1的γ34.5基因阻止神经母细胞瘤细胞触发神经细胞程序性细胞死亡特征的蛋白质合成完全关闭。美国国家科学院院刊1992；89:3266–3270.-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Chou J，Roizman B.单纯疱疹病毒1的γ34.5基因阻止神经母细胞瘤细胞触发神经细胞程序性细胞死亡特征的蛋白质合成完全关闭。美国国家科学院院刊1992；89:3266–3270.-项目管理咨询公司-公共医学

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