调节PKR激活的Lytic-Cycle EB病毒基因产物的鉴定

摘要

在溶血性感染的早期，EBV表达了一种长度为479个氨基酸的多肽，称为SM、Mta或EB2，可以在转录后调节病毒基因的表达(9，13，29). SM多肽由连接BSLF2和BMLF1开放阅读框的剪接信使核糖核酸编码，可以在瞬时转染试验中以启动子非依赖性、基因特异性的方式反式激活报告基因表达(4，9，25，29，41，42). 此外，据报道，SM能结合RNA，穿梭于细胞核内外，抑制内含子基因的表达，并激活缺乏内含子的基因的表达(2，三，8，13，18，41，42，45). 许多对生产性感染细胞中病毒复制重要的EBV基因不包含内含子，其mRNA的细胞质积累受SM调节，从不含内含子的报告基因转录的mRNA的胞质水平也受SM调节(13，26，45). 然而，其他研究提供了证据表明，SM抑制含有弱5′剪接位点共识序列的前体剪接，并调节其在细胞质中的积累(三，18，45). 最后，SM与细胞SC35剪接因子相关(8，26，45).

许多这些活性被认为涉及与单纯疱疹病毒1型（HSV-1）ICP27多肽同源的羧基末端区域。许多人类疱疹病毒编码类似于ICP27的转录后转录激活子，被认为能结合RNA，介导新生病毒转录物从细胞核向胞浆的转运，并可能调节剪接(1，2，14，15，21，27，43，47，49). EBV SM蛋白在这些蛋白中是独一无二的，因为它还拥有一个富含精氨酸和脯氨酸的模块，这对剪接和RNA运输的影响是不需要的(三，41). 这种元素与HSV Us11多肽中的一种类似，后者是一种阻止细胞PKR激酶激活的RNA结合蛋白(38，39，44).

作为宿主天然抗病毒反应的关键组成部分，病毒感染细胞中丰富的双链RNA（dsRNA）或高度结构RNA激活PKR（参考文献综述24，28、和37). 随后，活化的激酶磷酸化eIF2的α亚单位，导致细胞翻译起始因子失活并抑制蛋白质合成。许多病毒编码调节eIF2α磷酸化的功能，因为如果不能抵消这种反应，可能会导致病毒蛋白质合成提前停止，并阻止组装感染性病毒后代所需的蛋白质的产生（参考文献综述37).

在人类疱疹病毒中，人巨细胞病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒、EBV和HSV-1都含有对阻止磷酸化eIF2α积累很重要的基因(5，10-12，22，33，46). 例如，潜伏感染EBV的细胞会产生大量非编码的EBERRNAs，与PKR结合并阻止酶的激活(11，12，46). HSV-1采用不同的策略，针对该信号通路中的多个步骤。当γ34.5基因产物与细胞蛋白磷酸酶1α（PP1α）复合，去磷酸化eIF2α并保持翻译起始因子的活性时，Us11蛋白起到阻止PKR激活的作用(7，22，33，38). Us11的羧基末端68个氨基酸与胞浆中的多核糖体结合，在核仁中积累，阻止PKR活化，与PKR相互作用，并结合RNA(6，38-40，44). Us11 RNA结合域与任何已知的RNA结合基序都不同源，最近的研究表明它与dsRNA结合(第26页). 此外，它由Arg-X-Pro序列组成，重复约21次，具体取决于菌株。在EBV SM多肽中发现类似的RXP重复序列。

虽然EBV在潜伏感染细胞中产生的小而非编码的EBERRNAs可以阻止PKR激活，但它们在裂解复制过程中不会合成，此时形成病毒dsRNA的潜力最大(19，20). 由于SM蛋白在EBV裂解周期早期表达，并且包含RXP基序，因此我们研究SM是否可以类似于Us11蛋白的方式发挥作用。这项工作证明SM结合PKR并抑制PKR激酶的激活；此外，这种效果需要隔离的RXP域。这是首次鉴定出可调节PKR激活的裂解周期EBV基因产物。

材料和方法

结果

α-和γ-疱疹病毒RNA结合蛋白中存在重复的RXP基序。

SM包含多个功能区，可以表示独立折叠的域。羧基末端片段与几种疱疹病毒转录后调节因子具有同源性，包括ICP27基因产物，一种由α疱疹病毒HSV-1编码的即时早期蛋白。与核输出信号一起，该元素可能对将mRNA从细胞核运输到胞浆起重要作用(2，三，8，18，45). 它也可能是观察到对RNA加工的影响所必需的(三，18，45). 此外，SM具有富含精氨酸和脯氨酸的RNA结合域，可与多种不相关的RNA结合。

EBV BMRF1和BMLF1 RNA与SM相关，而无关的细胞RNA与SM无关(45). 然而，SM也能与几个瞬时转染报告基因转录的mRNA相互作用(三，41，42). 来自HSV-1 UL38基因3′非翻译区、EBV VCA衣壳抗原基因和多种报告基因的RNA片段也与SM结合(42). HSV-1 Us11蛋白的SM RNA结合域和RNA结合域都包含氨基酸序列RXP的多个拷贝。Us11羧基末端区域包含21个三联体基序拷贝，而SM包含8个重复单元（图。​（图1）。1). 此外，与SM相比，在RXP三联体中占据中心位置的氨基酸在Us11中有所不同。虽然X残基在Us11通常是疏水性或酸性的，但在SM中通常是丙氨酸。目前，Us11和SM是数据库中唯一包含这种独特重复RXP基序的蛋白质；此外，Us11和SM之间的唯一序列同源性位于各自的RXP模块中。

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图1。

α疱疹病毒编码的EBV SM蛋白和Us11多肽都含有一个重复的RXP片段。（A） SM和Us11蛋白质的结构域。479-氨基酸SM多肽由剪接的mRNA编码，该剪接mRNA将BSLF2开放阅读框（S；氨基酸1至20）的一段连接到BMLF1开放阅读框架（M；氨基酸41至479）。S段和M开放阅读框之间的虚线表示BMLF1 ATG密码子上游序列编码的20个残基。图中显示了RXP片段以及核输出序列（NES）和ICP27同源结构域。HSV-1 Us11蛋白（巴顿株）长155个氨基酸，在其羧基末端包含68个氨基酸RXP结构域。（B） SM的RXP片段序列似乎与各种α疱疹病毒Us11蛋白（HSV-1巴顿株、HSV-1 17株、HSV 2 HG52株和猿病毒B）对齐。

RXP片段促进SM与dsRNA的结合。

最近，我们确定Us11 RXP域包含一个新的dsRNA识别基序(第26页). 为了确定EBV SM蛋白是否也能与dsRNA相互作用，我们表达并纯化了几种SM蛋白衍生物，并在过滤结合试验中检测了它们与dsRNA底物的结合能力。在与标记的poly（IC）（一种合成dsRNA聚合物）孵育后，以剂量依赖的方式增加含有SM结合poly（IC）的37氨基酸RXP片段的纯化GST融合蛋白的数量（图。​（图2A）。2年). 仅添加等量的GST并没有导致在硝化纤维过滤器上保留放射性（图。​（图2A2年).

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图2。

疱疹病毒RXP结构域与poly（IC）的结合。（A） 将越来越多的纯化GST或含有HSV-1 Us11 RXP结构域（GSTΔ1-87）或融合到GST的EBV SM RXP片段（GST-SM-RXP）的纯化蛋白质与标记的聚（IC）孵育，并量化通过硝化纤维素过滤反应混合物后保留的放射性量。GSTΔ1-87，▴; GST-SM-RXP，▪; GST，•，虚线。（B） GST-SM-RXP（300 ng）与标记的poly（IC）（约4 ng）在过量的未标记poly（IC）（•，折线）、poly（A）存在的情况下孵育(▴), 或多边形（U）(▪). 在没有未标记竞争者的情况下，硝化纤维过滤器上保留的放射性量标准化为1.0。（C） GSTΔ1-87（10纳克）(▴, 断裂线）或GST-SM-RXP（300 ng）（•）与标记的多聚物（IC）一起孵育，同时存在越来越多的未标记的多聚物（C）。按照面板B所述，对结合进行量化和标准化。

虽然分离的SM RXP基序结合dsRNA，但它没有结合HSV-1 Us11蛋白的68氨基酸RXP结构域。用3 ng GSTΔ1-87检测到不同水平的蛋白-RNA复合物，而检测与SM的RXP片段的结合至少需要100 ng（图。​（图2A2年和数据未显示）。在较高的蛋白质浓度下，EBV GST-RXP蛋白与poly（IC）的结合增强，因为其结合的dsRNA仅为Us11衍生融合蛋白的3到3.6倍（图。​（图2A2年和数据未显示）。虽然融合到GST的SM RXP片段比相关的Us11域短，但它仅由八个RXP迭代组成，而Us11中的相应域包含21个拷贝。此外，这两个基序中的X残基之间几乎没有守恒性。

Us11-和SM RXP-衍生片段与聚（IC）结合的一个独特特征是它们在存在过量未标记多核糖核苷酸时的行为。反应中包含未标记的聚（A）或聚（U）对GST SM-RXP与聚（IC）的结合几乎没有影响，而聚（IC。​（图2B2B型和C）。这可能反映了SM RXP结构域的内在偏好，即除了其dsRNA结合活性外，还与包含一个或多个富含C序列片段的RNA分子相关联。此外，低水平的聚（C）可通过高达3倍的因子再生地刺激与标记聚（IC）的结合（图。​（图2C）。2摄氏度). 相反，GSTΔ1-87与poly（IC）的结合不受过量poly（C）、poly（U）或poly（A）的影响，并且仅在存在未标记poly（IC）的情况下才减少（图。​（图2C）2摄氏度) (第26页). 因此，尽管两个RXP片段都足以与聚（IC）相互作用，但它们以不同的亲和力相互作用，并在与竞争多核苷酸的激发下表现出不同的反应。

Poly（IC）是一种大小极不均匀的合成RNA聚合物。为了评估与大小均匀、序列更自然复杂的dsRNA的结合，我们从pBlueScript克隆载体衍生的体外合成转录物中制备了81-bp dsRNA分子。此外，为了评估全长蛋白的dsRNA结合特性，我们构建了表达His标记野生型SM（His-SM）或缺失37氨基酸RXP片段（His-ΔRXP）的突变SM的重组杆状病毒。虽然杆状病毒表达蛋白的总产量低于我们通过在细菌中生产这些多肽所能获得的产量，但完整蛋白的质量更好（图。​（图3A3A级和未发表的观察结果）。图​图3B3B公司证明增加的全长SM确实结合了dsRNA；此外，在测试的最高蛋白质量下，去除RXP片段后，这种相互作用减少了四到五倍（图。​（图3B）。3B公司). 因此，SM RXP基序对于与dsRNA的结合是重要的，其缺失减少了这种相互作用。

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图3。

嵌入全长SM蛋白的RXP片段对dsRNA结合很重要。（A） 从感染重组杆状病毒的细胞中分离出全长His-tagged SM（His-SM）和缺乏RXP结构域的突变衍生物（His-SM-ΔRXP）。纯化的蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，然后用考马斯亮蓝R-250染色或转移到膜上，随后用抗-His单克隆抗体进行检测。分子量标记的位置如图所示（单位：千道尔顿）。（B） 制备标记的81-bp RNA双链，并与不断增加的His-SM（•）或His-S-ΔRXP孵育(·，虚线）。通过量化保留在硝化纤维过滤器上的放射性来测量与dsRNA的结合。

SM中的37氨基酸RXP结构域足以与PKR相互作用。

最近的研究表明，含有一部分RXP重复区域的Us11片段对与PKR结合很重要(6). 为了确定EBV SM多肽是否与PKR相互作用，我们培养纯化的GST-SM或GST-Us11衍生物，这些衍生物固定在谷胱甘肽-甘露糖珠上，并在体外翻译[³⁵S] 蛋氨酸标记的PKR。在混合之前，蛋白结合珠和体外翻译的PKR均用微球菌核酸酶或微球菌核酸酶类、RNase a和RNase T的组合处理₁降解反应混合物中的双链和单链核酸。该程序可有效减少99%以上（未显示）的酸不溶性、放射性标记RNA[聚（IC）或合成335-核苷酸RNA]的数量。

在清洗收集的珠子后，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳分离结合蛋白，并通过放射自显影术显示标记的PKR的量。含有与GST融合的30氨基酸SM RXP基序的珠子能有效地保留PKR，而仅含有GST的珠子则不能与PKR相互作用（图。​（图4A）。4A级). 这表明来自SM的30氨基酸RXP片段足以与PKR结合。来自Us11的68氨基酸RXP基序也足以在相同条件下结合PKR。然而，含有GST的珠融合到Us11的氨基末端87氨基酸，与PKR无关（图。​（图4A4A级).

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图4。

SM RXP域足以与PKR交互。与谷胱甘肽-甘露糖结合的纯化GST融合蛋白在体外翻译³⁵标记为S的PKR。在混合之前，用微球菌核酸酶分别处理裂解产物和固定化GST融合蛋白。收集并清洗珠子后，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离结合蛋白，随后用荧光团浸渍并暴露于薄膜中。分子量标记的位置显示在左侧（单位为千道尔顿）。（A） GST-SM-RXP包含SM融合到GST的37氨基酸片段；GSTΔ1-87包含Us11与GST融合的羧基末端68个氨基酸；GSTΔ88-155含有与GST融合的Us11的氨基酸末端87个氨基酸。（B） RXP结构域不与体外翻译的荧光素酶或糖皮质激素受体发生非特异性相互作用。完整的翻译产品在每个图像的右侧用星号表示。

RXP结构域和PKR之间的相互作用似乎是特定的，因为其他在体外翻译的蛋白质中，其中一个也结合核酸，没有保留在珠子上（图。​（图4B）。4B类). 最后，疱疹病毒RXP蛋白与细胞PKR激酶之间的相互作用对微球菌核酸酶、RNase A和RNase T的处理具有抵抗力₁（图。​（图44和​和55以及未示出的数据）。

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图5：。

全长SM与PKR的相互作用需要RXP重复片段。纯化的GST融合蛋白与谷胱甘肽-糖结合，并按照图的图例所述进行处理。​图4。4GST-SM含有与GST融合的SM的1到479个氨基酸；GST-SM-ΔRXP包含37个氨基酸的内部缺失，删除RXP片段。

SM RXP域可以调节PKR激活。

此前，我们确定Us11的68氨基酸RXP模块足以阻止PKR激活(38). 为了评估SM RXP模块抑制PKR激活的能力，将纯化的GST或GST-RXP融合蛋白添加到从α-干扰素刺激的293细胞制备的细胞提取物中。通过添加dsRNA可以在这些提取物中激活PKR，并且可以通过免疫沉淀含有[γ]的反应混合物中的PKR来监测激活程度-³²P] ATP。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离免疫复合物中的蛋白质后，可通过放射自显影术观察活化的PKR，并通过磷成像仪分析进行量化。

在反应混合物中加入越来越多的GST-RXP导致活化PKR量的剂量依赖性减少，而添加GST没有影响（图。​（图6A）。6A级). 在评估的最高剂量GST-RXP下，与仅用GST编程的对照反应混合物相比，这种抑制意味着磷酸化PKR的量减少了3.6倍。因此，EBV SM蛋白的37氨基酸RXP基序足以抑制PKR激活。

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图6。

SM可以调节PKR的激活。（A） SM RXP段足以抑制PKR激活。在含有[γ-³²P] 在30°C孵育30分钟后，PKR被免疫沉淀，免疫复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中被分离。随后将固定的干燥凝胶暴露于薄膜中。分子量标记的位置显示在左侧（单位为千道尔顿）。（B） 从SM中去除RXP片段会降低其抑制PKR激活的能力。与面板A中相同，但反应混合物包含纯化的GST-SM（3.75或12.5 pmol）、His-SM（5.7或19 pmol），His-SM-ΔRXP（5.7 or 19 pmol，或GST（37 pmol）。分子量标记的位置显示在左侧（单位为千道尔顿）。

有趣的是，68-氨基酸Us11 RXP结构域的三分之一质量需要与固定数量的SM RXP基序相同的程度来抑制PKR激活(30)（未显示数据）。由于Us11包含的RXP重复序列大约是SM的三倍，因此RXP单位的可比浓度似乎可以达到类似的抑制水平。最后，全长SM蛋白还阻止PKR激活，与缺乏RXP结构域的His标记变体相比，纯化后的His标签SM将磷酸化PKR的量减少了1.7到3.5倍（图。​（图6B）。6亿). 同样，与单独添加GST相比，添加纯化的GST-SM使磷酸化PKR水平降低了约两倍（图。​（图6B）。6亿). 因此，需要SM中的RXP域来阻止PKR的激活。

讨论

虽然SM在EBV裂解周期中调节转录后基因表达，但它至少执行两个涉及RNA代谢的独立功能。先前的研究表明，SM在细胞核和细胞质之间穿梭，主要运输未折叠的病毒RNA货物(2，三，8，13，18，26，41，42，45). 这种活性可以通过一类疱疹病毒编码的分子来证明，这些分子与HSV-1ICP27反式激活因子具有同源性(1，2，14，15，21，27，43，47，49). 我们现在报道，SM可以阻止细胞PKR激酶的激活，这是一种eIF2α激酶，能够抑制dsRNA和病毒感染引起的蛋白质合成。SM中包含的重复RXP序列与PKR相关，结合dsRNA，并且需要抑制PKR激活。Us11是一种由HSV-1编码的RNA结合蛋白，它还包含一个重复的RXP结构域，可指导类似的一系列活动(6，第26页，38). 因此，RXP基序在疱疹病毒蛋白质中定义了一个新的结构域，该结构域旨在与PKR和dsRNA相互作用。因此，含有RXP元件的多肽能够阻止PKR激活，从而阻断对宿主抗病毒反应至关重要的战略组分。

目前，RXP模块仅存在于几种α疱疹病毒指定的Us11蛋白和γ疱疹病毒EBV编码的SM蛋白中。该结构域可能被两种病毒类型独立获得，也可能在γ疱疹病毒家族分化之前被α疱疹病毒最初捕获。重要的是要认识到含有RXP的蛋白质在其他方面是不相关的，因为事实上，SM显示出与另一种α疱疹病毒蛋白质，即单纯疱疹病毒ICP27多肽的结构和功能同源性(2，三，8，13，18，42，45). 其他疱疹病毒编码的类似反式激活蛋白不包含RXP重复元件，Us11同源蛋白仅在HSV-1、HSV-2和猿猴B病毒中发现(16，31，35). 然而，重要的是，已知几种人类疱疹病毒编码可以调节PKR激活的活动，而不管它们是否产生包含RXP的蛋白质(5，10).

虽然SM和Us11的RXP片段对PKR激活的抑制程度相似，但Us11结构域对poly（IC）的亲和力要大得多。Us11中的21个RXP重复序列与SM中的8个重复序列相比，可能是造成这种差异的原因，三联体重复序列中心位置的氨基酸同一性的变化也是如此。然而，它确实质疑了RXP元件结合dsRNA在阻止PKR激活中的作用。在这方面，68氨基酸Us11 RXP结构域阻止PACT激活PKR，PACT是一种在缺乏dsRNA的情况下激活激酶的细胞蛋白(第37页). 虽然在没有dsRNA的情况下，含有RXP的疱疹病毒蛋白可以抑制PKR的激活，但这并不一定意味着dsRNA的结合并不重要。RXP结构域可以有效地隔离dsRNA分子并阻止其激活激酶。不同RXP蛋白通过后一种机制进行操作的有效性可能反映了它们对dsRNA的亲和力。

虽然ICP27和SM都是基因表达的转录后调节器，将RNA分子传递到胞浆中，然后在胞浆中进行翻译，但SM中嵌入的37-氨基酸RXP片段不需要进行这种活动(三，42). 这强烈暗示了SM与RNA结合的另一种机制，要么通过第二个RNA识别域，要么通过与另一种能结合RNA的蛋白质的相互作用。有趣的是，早期的研究表明，RNA只与含有RXP元素的SM衍生物结合；然而，尽管在西北地区的分析中，RXP片段是RNA结合所必需的，但全长蛋白并没有与氯霉素乙酰转移酶报告RNA探针结合(42). 只有截短的衍生物才能够结合RNA，这引发了人们的猜测，即RXP结构域识别RNA的能力可以被调节。

在我们的dsRNA过滤结合试验中，去除RXP基序会削弱dsRNA结合，尽管ΔRXP突变中仍保留一些可检测的活性。事实上，翻译后修饰或与其他配体的相互作用可以改变SM的构象，改变RXP片段的可及性及其识别RNA的效率。有趣的是，poly（C）刺激与poly（IC）的结合，表明单链RNA可能调节SM RXP结构域的dsRNA结合活性。在单个多肽或结构域中巩固这两种功能可以提供一种机制来隔离病毒mRNA转录物中的dsRNA区域，从而有效地保护它们免受PKR的影响。

SM中的RXP域是与PKR复合形成所必需的。虽然这种相互作用阻碍了微球菌核酸酶、核糖核酸酶A和核糖核糖核酶T的广泛治疗₁，我们不能完全排除一小块抗核、结构化RNA以某种方式促进这种蛋白质相互作用的可能性。最近，有报道称Us11与PKR相互作用，而RNases A和T的治疗完全打破了这种联系₁(6). 这两项调查中使用的不同技术可能对理解这种差异很重要。在他们的研究中，Cassady和Gross证明，从HSV-1感染细胞分离出的抗PKR免疫复合物中可以检测到Us11，并且这种相互作用会被之前使用RNases A和T的治疗所破坏₁(6). 然而，这些作者使用亲和纯化的反肽抗血清来免疫沉淀PKR，因此仅分离出暴露该表位的复合物。如果在没有RNA的情况下与PKR结合，该表位通过构象变化或空间位阻而被掩盖，则该复合物将无法被抗血清识别。细胞内可能会形成两种形式的Us11-PKR复合物，一种由核酸介导，另一种独立于核酸。这种情况并非没有先例，因为PKR通过RNA依赖和独立关联与细胞蛋白NF90相互作用(36).

EBV编码至少两种抑制细胞PKR激酶激活的功能。早期的研究表明，小的、非聚腺苷酸化的EBER RNA可以以类似于腺病毒产生的VA RNA的方式阻止PKR的激活(11，12，46). 然而，最近很明显，EBER是在潜伏感染的细胞中合成的(19，20). EBER能够抑制PKR激活，以响应病毒潜伏转录物5′非翻译区的重复区域；此外，它们可能有助于观察到EBV相关肿瘤细胞对α-干扰素诱导的凋亡的抵抗(17，34). 自相矛盾的是，病毒裂解复制或培养细胞的转化并不需要EBER(48).

与其他疱疹病毒类似，EBV可能在其生产性生长周期中也会产生dsRNA，因此需要表达裂解周期病毒功能，以抵消对病毒复制产生负面影响的dsRNA依赖信号通路(22，23，32，33). 我们对SM反式激活子内保守基序的鉴定首次描述了可阻止PKR激活的裂解周期EBV基因产物。此外，它表明EBV和HSV-1一样，具有多种独立功能，旨在阻止PKR介导的信号传导，从而阻碍细胞抗病毒反应。产生重组EBV基因组，其携带不影响多肽的其他潜在基本功能的活的突变SM等位基因，将能够在有效感染EBV的细胞中进一步评估这些活性。

致谢

参考文献