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.1998年8月；72（8）：6689-98。
doi:10.1128/JVI.72.8.6689-6698.1998。

ORF1a-编码的复制酶亚单位参与动脉病毒复制复合体的膜结合

Y van der Meer先生 1, H van Tol公司, J K更衣室, E J斯奈德
附属公司

ORF1a-编码的复制酶亚单位参与动脉病毒复制复合体的膜结合

Y van der Meer先生等。 J维罗尔. 1998年8月.

摘要

马动脉炎病毒复制酶（EAV；Arteriviridae家族，Nidovirales目）的功能包括重要的病毒酶活性，如蛋白酶和假定的RNA聚合酶和RNA解旋酶功能。复制酶以两种多蛋白的形式表达（开放阅读框1a[ORF1a]和ORF1ab），三种病毒蛋白酶将其加工成12种非结构蛋白。在免疫荧光分析中，大多数裂解产物定位于细胞的核周区域。观察到致密的颗粒状和囊泡状染色，这强烈表明膜结合。通过共焦显微镜和双标记免疫荧光，EAV复制酶的分布与PDI重叠，PDI是内质网和中间隔室的驻留蛋白。用溴化UTP原位标记新生病毒RNA表明，复制酶亚基积累的膜结合复合体确实是病毒RNA合成的场所。许多ORF1a编码的疏水结构域被假定参与了动脉病毒复制复合物的膜结合。通过使用各种生化方法（Triton X-114提取、膜纯化和碳酸钠处理），含有这些结构域的复制酶亚基表现为完整的膜蛋白，并在感染细胞中与膜相关。因此，促进病毒复制-转录复合物膜结合支架的形成似乎是动脉病毒ORF1a复制酶多聚蛋白的一个重要新功能。

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图1
图1
EAV ORF1a和ORF1ab复制酶多蛋白的蛋白质水解处理方案、疏水性图和亚基命名（39、49、52）。图中显示了三个EAV蛋白酶域（类木瓜蛋白酶[PCP]、半胱氨酸蛋白酶[CP]和丝氨酸蛋白酶[SP]）及其切割位点（箭头和箭头）。在ORF1b编码的多肽中，鸟巢病毒中保守的四个主要结构域被描述为：POL，假定的RNA-依赖性RNA聚合酶；M、 假定金属结合域；HEL，推测的RNA解旋酶；C、 鸟巢病毒特有的保守C末端结构域。疏水性图是通过Kyte和Doolittle（24）的方法生成的。轴上方是疏水的。aa，氨基酸。
图2
图2
免疫荧光分析显示了EAV复制酶在Vero细胞内胞内分布的时间进程。细胞被模拟感染（A）或EAV感染，并固定在4 h（B）、6 h（C）、8 h（D）、10 h（E）和12 h（F）p.i。随后，用抗nsp2抗血清（39）对细胞进行间接免疫荧光分析。生成的照片具有相同的曝光时间，用于记录和打印。识别nsp4、nsp7-8、nsp8、nsp9、nsp10和nsp12的抗血清获得了基本相同的结果（参考文献和数据未显示）。
图3
图3
EAV复制酶和细胞蛋白PDI的克隆化，这是ER和IC的标记。使用三种不同的细胞系：BHK-21（A到C）、RK-13（D到F）和Vero（G到I）。这些是感染了EAV的病毒，在p.i.8 h固定，并使用针对PDI（50）的小鼠MAb、抗nsp2兔抗血清（39）和与荧光标记结合的适当二级抗体进行双标记免疫荧光分析。PDI显示为红色（A、D和G），EAV nsp2显示为绿色（B、E和H）。对于每个样品，使用共焦显微镜从同一光学切片记录差异荧光图像。显示了PDI和EAV nsp2图像的计算机生成叠加（C、F和I）。
图4
图4
EAV复制酶（nsp2）和主要EAV糖蛋白G的细胞内分布L（左）在感染的早期阶段，可以用作高尔基复合体的标记（见正文）。Vero细胞感染了EAV，分别固定在6 h（A至C）和10 h（D至F）p.i.，并用针对G的小鼠单克隆抗体进行双标记免疫荧光分析L（左）（18） 、抗nsp2兔抗血清（39）和适当的荧光偶联物。G公司L（左）显示为红色（A和D），EAV nsp2显示为绿色（B和E）。对于每个样品，使用共焦显微镜从同一光学切片记录差异荧光图像。G的计算机生成叠加L（左）还显示了nsp2图像（C和F）。
图5
图5
EAV复制酶（nsp2）的克隆化和病毒RNA合成。用EAV感染BHK-21（A和B）和RK-13（C和D）细胞，用BrUTP原位标记从头合成的病毒RNA。用大青霉素阻断宿主细胞RNA合成，然后用脂质体将BrUTP导入细胞。将细胞固定在每天7.5小时，并用抗nsp2兔抗血清（39）、识别BrUTP标记RNA的大鼠单克隆抗体和适当的荧光偶联物进行双标记免疫荧光分析。显示了nsp2（A和C）和BrUTP-标记RNA（B和D）的相同细胞标记。nsp2阳性但BrUTP阴性的细胞的存在是因为BrUTP只能被引入20%到40%的细胞中（见正文）。
图6
图6
ORF1a-和ORF1b-编码EAV复制酶亚基的TX-114提取分析。复制酶处理方案和nsp命名如图顶部所示，实心框表示疏水域（图1）。EAV感染RK-13细胞，病毒蛋白35用1%TX-114裂解细胞，并对裂解物进行三轮TX-114提取（见材料和方法）（4）。将清洁剂颗粒（p）和上清液混合并稀释在免疫沉淀缓冲液中。EAV复制酶亚单位用一组先前描述的识别nsp1（α1）、nsp2（α2）、nsp4（α4）、nsp7-8（α78）、nsp 9（α9）和nsp10（α10）的兔抗血清进行免疫沉淀。样品通过SDS-PAGE和放射自显影进行分析。
图7
图7
ORF1a-和ORF1b-编码的EAV复制酶亚单位的膜结合。复制酶处理方案和nsp命名如图顶部所示，实心框表示疏水域（图1）。EAV感染RK-13细胞，病毒蛋白35用Dounce细胞匀浆器破碎标记的S细胞，制备PNS。一半的PNS保持在pH 7，而另一半在pH 11下用100 mM碳酸钠处理，以去除膜上的整体和外周蛋白（16）。随后，通过超速离心制备膜（m）和细胞质（c）组分，在免疫沉淀缓冲液中稀释，并使用图6图例中描述的同一组抗血清进行免疫沉淀分析。免疫沉淀样品通过SDS-PAGE和放射自显影进行分析。
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