一个沙门氏菌蛋白质通过诱导自噬导致巨噬细胞死亡

致病性的核心肠道沙门菌是编码在其染色体离散区域的III型分泌系统（TTSS）的功能沙门氏菌致病岛1（SPI-1）；Galaín，2001年). 该系统向宿主细胞注射一组效应蛋白，这些效应蛋白具有精确调节细胞功能的能力。在肠上皮细胞中，沙门氏菌诱导大量肌动蛋白细胞骨架重排和核反应，最终导致细菌摄取和产生促炎细胞因子。这些反应是由细菌编码的交换因子SopE和SopE2以及磷酸肌醇磷酸酶SopB激活Rho家族GTPases Cdc42和Rac的结果，后者通过SPI-1 TTSS传递到宿主细胞(Galaín，2001年).

相反在巨噬细胞中，沙门氏菌诱导程序性细胞死亡，这一过程也依赖于SPI-1 TTSS的功能(Chen等人，1996年;Monack等人，1996年). 通过何种机制沙门氏菌对巨噬细胞的杀伤作用知之甚少。正在经历的巨噬细胞沙门氏菌-诱导的细胞死亡表现出不同的形态学特征，表明坏死和凋亡细胞死亡(Chen等人，1996年;Monack等人，1996年;布伦南和库克森，2000年;博伊西和柯林斯，2001年). 很明显，在沙门氏菌-诱导巨噬细胞杀伤。一种死亡发生在感染后1小时内，表现出“坏死样”特征，如细胞器退化和染色质缺乏凝集。另一种类型的死亡发生在感染后约5小时，表现出更典型的凋亡特征，如染色质凝集和DNA断裂。实验表明，被称为“程序性坏死”的快速死亡依赖于caspase-1，因为沙门氏菌-caspase-1缺陷巨噬细胞诱导的细胞死亡显著延迟(Hersh等人，1999年;布伦南和库克森，2000年;Jesenberger等人，2000年). 对于导致沙门氏菌-诱导caspase-1非依赖性巨噬细胞死亡。两种形式的巨噬细胞死亡都是由沙门氏菌严格依赖于SPI-1 TTSS。先前的研究表明，caspase-1依赖性巨噬细胞死亡是由SipB沙门氏菌SPI-1 TTSS传递到宿主细胞的蛋白质(Hersh等人，1999年). SipB明显结合并激活caspase-1，从而刺激具有坏死特征的非常规形式的程序性细胞死亡。

关于沙门氏菌可能负责刺激caspase-1非依赖性程序性细胞死亡的SPI-1 TTSS效应蛋白。剖析不同的机制沙门氏菌触发细胞程序性死亡对于理解其生物学意义和对发病机制的贡献至关重要。在这些分析中，我们关注的是沙门氏菌-诱导巨噬细胞死亡。我们发现该途径是SPI-1 TTSS效应蛋白转座酶SipB活性的结果。在感染期间，SipB定位于线粒体，在培养细胞中瞬时表达时，形成类似于自噬小泡的多层结构，并含有ER和线粒体标记。此外，巨噬细胞感染沙门氏菌积累了大量的自噬体。我们建议沙门氏菌通过破坏线粒体诱导巨噬细胞自噬介导的程序性细胞死亡。

TTSS分泌一组蛋白质，这些蛋白质要么是细胞反应的效应器，要么参与效应蛋白向宿主细胞的转运(Galaín和Collmer，1999年). 如果是沙门氏菌SPI-1 TTSS、转定位酶SipB、SipC和SipD介导一系列具有不同功能的效应蛋白的转移(Collazo和Galaín，1997年). 尚不清楚是否沙门氏菌使用一组独特的SPI-1 TTSS分泌蛋白诱导caspase-1非依赖性巨噬细胞死亡。为了研究这个问题，我们构建了肠道沙门菌伤寒血清型(鼠伤寒沙门氏菌)编码所有已知SPI-1 TTSS效应蛋白（包括Cdc42和Rac激活剂SopE）的基因发生功能丧失突变(Hardt等人，1998年b)和SopE2(Stender等人，2000年)，磷脂酰肌醇磷酸酶SopB(Norris等人，1998年)，肌动蛋白结合蛋白SipA(Zhou等人，1999年)酪氨酸磷酸酶和GTPase激活蛋白SptP(Fu和Galaín，1999年)和AvrA(哈德和加拉，1997年)，一种与泛素样蛋白蛋白酶YopJ高度相关的蛋白质耶尔森菌属spp.，与这些细菌诱导细胞凋亡有关(Orth等人，2000年). 所有这些突变菌株都保留了以与野生型（未发表的数据）无法区分的方式杀死caspase-1（缺陷骨髓源初级巨噬细胞）的能力。为了检验效应蛋白功能冗余的可能性，我们构建了一个鼠伤寒沙门氏菌同时携带SPI-1 TTSS所有已知效应蛋白的功能丧失突变的菌株（以下称为“无效应”）。无效应器沙门氏菌突变体能够以一种与野生型无法区分的方式诱导caspase-1缺陷型BMDPM中的细胞死亡(图1、A和B). 由于该突变株可能只能传递SipB、SipD和SipC，因此这些结果表明，这些蛋白质中的任何一种（或其组合）都可能直接导致巨噬细胞的细胞毒性。

沙门氏菌携带功能丧失突变的菌株细纹细布，sipC公司，或刀槽花纹不能诱导巨噬细胞死亡(Chen等人，1996年). SipB、SipC和SipD被称为转定位酶，因为它们介导所有效应蛋白通过宿主细胞质膜的传递(Collazo和Galaín，1997年). 因此，尚不清楚这些突变体杀伤巨噬细胞的能力是由于它们在相互移位中的作用，还是由于它们直接诱导细胞死亡的能力。为了研究TTSS蛋白转位酶在刺激caspase-1非依赖性程序性细胞死亡中的潜在作用，我们在BMDPM中表达了来自caspase-2的SipB、SipC或SipD^−/−并检测其细胞毒性。SipC或SipD的表达不会导致细胞毒性(图2; 未发布的数据）。全长SipB的表达无法检测到，可能是由于转染巨噬细胞的快速死亡，再加上大多数TTSS效应蛋白（包含其分泌和转位结构域）固有的低表达水平(Hardt等人，1998年a; 未发布的数据）。为了提高SipB的表达水平，我们去除了其位于氨基末端的假定分泌和移位结构域。在caspase-1的BMDPM中可以检测到这种SipB缺失的表达^−/−转染后早期的小鼠(图2; 可能是因为转染的巨噬细胞从培养皿中分离出来。这些巨噬细胞表现出明显的细胞毒性和明显的染色质凝集(图2; 未发布的数据）。总之，这些结果表明SipB对巨噬细胞具有细胞毒性，很可能直接导致caspase-1非依赖性巨噬细胞死亡。

由于巨噬细胞中SipB的表达导致其快速死亡，因此我们检测了带有YFP标记的SipB在瞬时转染COS-2细胞中的定位，这些细胞对沙门氏菌-诱导细胞死亡。SipB-YFP几乎只局限于不同大小的圆形囊泡结构，与典型的细胞器不相似(图3A） ●●●●。这种定位模式并不是由于SipB的过度表达，因为即使在转染时使用极少量的DNA也可以观察到这种定位模式，尽管在这种情况下，结构的尺寸稍小，数量明显较少(图3C类；未发布的数据）。线粒体经常与这些不寻常的囊泡结构密切相关，甚至包含在其中(图3B） ●●●●。此外，用线粒体标记物MitoTracker标记SipB诱导的囊泡结构^®红色(图3B） 以及针对线粒体蛋白CoxIV的抗体（未公开数据）。在瞬时共转染实验中，囊泡结构也与Sec61-CFP融合蛋白共定位，后者是ER的标记物(图3C） 。当SipB在293T、Henle-407或Ref52细胞中表达时，也获得了类似的结果（未公布的数据）。这些观察结果表明线粒体和ER衍生膜都是SipB诱导的囊泡结构的组成部分。

通过电镜观察，囊泡结构呈现出一种引人注目的“类离子”外观，由一系列紧密相连的膜组成，大多数（尽管不总是）以圆形排列(图4). 这些结构容易被针对SipB或GFP的金标抗体染色(图4). 线粒体通常与洋葱状结构密切相关(图4A） 甚至在他们内部(图4D） ●●●●。有时，线粒体似乎正在与SipB诱导的结构融合(图4、B和C). 事实上，SipB诱导的膜结构与果蝇属精子发生过程中的精子细胞。在此过程中，由模糊洋葱基因、线粒体聚集在精子细胞核旁边，融合成巨大的细胞器，这些细胞器相互包裹，被称为内本克恩(Hales和Fuller，1997年). SipB诱导的结构也类似于缺乏ATP合成酶ε亚基的细胞中线粒体的外观(Paumard等人，2002年)，参与线粒体嵴的形成，并在过度表达丝裂原融合蛋白2的细胞中(桑特尔和富勒，2001年)，哺乳动物的同源物模糊洋葱.

先前的研究表明，纯化的SipB可以整合到磷脂膜中，并在中性pH下诱导脂质体融合(Hayward等人，2000年). 为了探讨SipB膜融合活性对瞬时转染细胞中多泡结构形成的潜在贡献，我们表达了一个SipB突变体（SipB_428–593)已证明其在保持与膜结合能力的同时缺乏融合活性(Hayward等人，2000年;McGhie等人，2002年). SipB的表达_428–593未能诱导线粒体重塑和巨噬细胞死亡(图5A） ●●●●。然而，SipB_428–593如与线粒体标记物MitoTracker共定位所示，它保留了定位于线粒体的能力^®红色(图5A；未发布的数据）。这种SipB的突变形式此前已被证明对野生型SipB具有显性负效应。当同时存在于膜融合分析中时，SipB_428–593能够抑制野生型蛋白诱导膜融合的能力(Hayward等人，2000年;McGhie等人，2002年). 与SipB融合活性对形成多泡结构的要求一致，SipB_428–593当在培养细胞中同时共存时，消除了野生型SipB诱导这些异常结构形成的能力(图5B类；未发布的数据）。这些结果表明，SipB的膜融合活性是其诱导多泡室形成的能力所必需的，而不是其定位于线粒体的能力。

瞬时转染实验表明，SipB通过破坏线粒体诱导巨噬细胞死亡。因此，我们检测了SipB在细菌感染期间是否定位于线粒体。来自caspase-1的BMDPM^−/−小鼠感染了野生型鼠伤寒沙门氏菌或TTSS易位缺陷刀槽花纹突变体，并通过免疫电镜和生化分离检测线粒体中是否存在SipB。这个鼠伤寒沙门氏菌sipD突变菌株可以作为阴性对照，因为它以类似于野生型的方式被巨噬细胞吸收，并且能够分泌SipB，但完全不利于其转移到宿主细胞胞质溶胶中(Kaniga等人，1995年). 感染巨噬细胞的免疫电镜显示，感染野生型巨噬细胞的线粒体中存在SipB沙门氏菌而不是在感染TTSS易位缺陷的巨噬细胞线粒体中刀槽花纹突变体(图6A） ●●●●。即使在感染后的早期，巨噬细胞的线粒体也会感染野生型沙门氏菌表现出以嵴肿胀和消失为特征的破坏形态(图6A） ●●●●。后来，线粒体的外观被严重破坏，在电子显微镜下很难识别它们（未发表的数据）。通过细胞分馏分析证实线粒体中存在SipB。来自caspase-1的BMDPM^−/−小鼠感染了野生型鼠伤寒沙门氏菌或刀槽花纹用蔗糖梯度离心法分离突变株线粒体，Western免疫印迹法检测SipB的存在。感染野生型的巨噬细胞线粒体中容易检测到SipB鼠伤寒沙门氏菌但在感染了鼠伤寒沙门氏菌携带突变的菌株刀槽花纹基因(图6B） ●●●●。用线粒体蛋白CoxIV抗体重制印迹，证实在这两种情况下，装载了等量的材料(图6B） ●●●●。这些结果表明，SipB在细菌感染期间也能靶向线粒体。

SipB在转染细胞中诱导的结构具有多层性，与ER标记物和受损线粒体相关，类似于自噬体，通常诱导膜结构来隔离和清除受损的细胞器(Kim和Klinsky，2000年;Klinsky和Emr，2000年). 因此，我们研究了细菌感染期间巨噬细胞中存在的自噬体。来自caspase-1的BMDPM^−/−小鼠感染了野生型鼠伤寒沙门氏菌或易位缺陷刀槽花纹突变株，我们使用自噬空泡标记单丹酰尸胺（MDC；Biederbick等人，1995年;Inbal等人，2002年). 感染野生型的巨噬细胞鼠伤寒沙门氏菌但不是那些感染易位缺陷型等基因的人刀槽花纹突变株，表现出丰富的MDC染色结构(图7，面板I）。此外，感染野生型巨噬细胞的电镜分析鼠伤寒沙门氏菌发现了大量类似于自噬体的多泡结构(图7，A–D），在感染易位缺陷的巨噬细胞中不存在刀槽花纹突变体(图7、E和F). 自噬体样结构的外观与耐药细胞（如COS）中SipB表达诱导的结构略有不同，很可能是因为巨噬细胞在耐药细胞中观察到的结构出现之前迅速死亡。总之，这些结果表明鼠伤寒沙门氏菌巨噬细胞感染可诱导自噬体的形成。

观察到SipB在培养细胞中的瞬时表达以及胱天蛋白酶-1缺陷巨噬细胞感染鼠伤寒沙门氏菌自噬体的形成促使我们考虑诱导自噬可能与诱导巨噬细胞死亡有关。自噬是一种高度有序的现象，与程序性细胞死亡的诱导有关，被认为是发育过程中程序性组织重塑的重要组成部分(Bursch等人，2000年;Inbal等人，2002年). 尽管对诱导和执行自噬介导的程序性细胞死亡（也称为“II型”程序性细胞死亡率）的分子机制知之甚少，但已有研究表明，这些机制涉及经典凋亡或“I型”程序化细胞死亡的共同因素，以及II型程序性细胞死亡的独特过程(施瓦茨等人，1993年;Lemasters，1999年;Xue等人，1999年;Cohen等人，2002年). II型程序性细胞死亡的一个显著特征是它独立于半胱天冬酶的活性(Xue等人，1999年). 因此，我们检测了半胱天冬酶依赖性沙门氏菌-诱导巨噬细胞死亡。来自caspase-1的BMDPM^−/−小鼠感染了野生型鼠伤寒沙门氏菌或易位缺陷刀槽花纹存在或不存在泛酶抑制剂Z-VAD的突变体。与II型程序性细胞死亡有关沙门氏菌-泛酸蛋白酶抑制剂对诱导的巨噬细胞死亡没有显著影响(图8).

沙门氏菌通过涉及不同途径的复杂机制诱导巨噬细胞程序性细胞死亡，并需要致病岛1（SPI-1 TTSS）中编码的细菌TTSS。一条导致巨噬细胞快速死亡的死亡途径依赖于caspase-1和SPI-1 TTSS分泌蛋白SipB，其特征是坏死(Hersh等人，1999年;布伦南和库克森，2000年;Jesenberger等人，2000年). 然而，来自caspase-1的巨噬细胞^−/−小鼠也会经历程序性细胞死亡，尽管具有延迟的动力学和不同的形态学特征。在这里，我们描述了另一种由沙门氏菌这与caspase-1无关。系统的细菌遗传分析使我们得出结论，这种细胞死亡途径也依赖于SipB，一种具有膜融合活性的蛋白质，通过SPI-1 TTSS传递到宿主细胞。SipB的已知双重功能使该分析变得复杂，SipB既是细胞内毒力的效应器，又是将其他效应蛋白转移到宿主细胞所需的蛋白转位酶。然而，我们发现沙门氏菌SPI-1 TTSS递送的所有已知效应蛋白的产生缺陷保留了其杀死胱天蛋白酶-1的能力^−/−巨噬细胞。更重要的是，SipB在caspase-1中的表达^−/−巨噬细胞导致了它们的死亡。SipB的参与也得到了以下观察结果的支持：鼠伤寒沙门氏菌参与巨噬细胞细胞毒作用的基因只会在编码SPI-1 TTSS的成分或调节因子或蛋白转座子本身的基因中产生突变（未发表的数据）。后者表明不太可能存在一种未知的SPI-1效应物来诱导巨噬细胞死亡。

为了深入了解SipB杀死巨噬细胞的机制，我们在对沙门氏菌-诱杀。我们观察到，在这些细胞中，SipB诱导形成类似于自噬体的多泡结构。这些结构包含线粒体和ER标记，表明线粒体和ER衍生膜是SipB诱导的囊泡结构的组成部分。事实上，线粒体与SipB诱导的结构密切相关或位于其中。这些观察结果，以及SipB诱导的膜结构与线粒体融合形成的膜结构之间的相似性，如内本克恩(Hales和Fuller，1997年)，表明SipB可能具有诱导线粒体融合的能力。事实上，体外缺乏膜融合活性的SipB突变形式并没有诱导形成多泡结构。此外，这种SipB突变形式的表达在体外脂质体融合试验中对野生型SipB具有显性负效应(Hayward等人，2000年)，阻止了多层结构的形成。这些结果强烈暗示了SipB在多层结构形成中的融合活性。形成内本克恩由模糊洋葱基因(Hales和Fuller，1997年)它有哺乳动物的对应物，称为丝裂原(桑特尔和富勒，2001年). 有趣的是，SipB的模块化组织（即疏水结构域和线圈区域的排列），以及插入膜时预测的拓扑结构(McGhie等人，2002年)，让人想起丝裂原(Rojo等人，2002年). 因此，SipB可能通过模拟这些宿主细胞蛋白的某些活动来发挥其功能，至少部分如此。需要更多的实验来研究这个假设。

SipB是如何靶向线粒体的？对SipB一级氨基酸序列的检查没有发现典型的线粒体靶向序列。先前的工作表明，SipB与脂质体的结合及其膜融合活性受到膜脂组成的显著影响(Hayward等人，2000年). 重要的是，当囊泡含有心磷脂（一种线粒体膜中丰富的脂质）时，SipB的融合活性显著增强。最近的工作表明，促凋亡Bcl-2家族成员Bax的线粒体靶向性(Kuwana等人，2002年)和投标(Lutter等人，2000年)由心磷脂介导。令人感兴趣的是，假设SipB可能以类似的方式靶向线粒体。

在瞬时转染实验中，SipB定位于线粒体并形成自噬体样结构的能力与其在细菌感染期间诱导巨噬细胞细胞死亡的能力之间有什么关系？我们在沙门氏菌感染后，SipB定位于感染巨噬细胞的线粒体，线粒体受损，无嵴。此外，我们发现巨噬细胞因沙门氏菌感染显示存在大量自噬体。被称为II型的程序性细胞死亡的一种不太为人所知的形式与自噬细胞的诱导有关(施瓦茨等人，1993年;Lemasters，1999年;Xue等人，1999年;Cohen等人，2002年). 尽管这类程序性细胞死亡的许多特征与传统凋亡的特征相似（即染色质凝集、DNA断裂等），但II型程序性细胞死亡率似乎有一些独特的特征。例如，II型程序性细胞死亡不需要半胱天冬酶激活，因为添加泛天冬酶抑制剂不能阻止这种类型的细胞死亡(Xue等人，1999年). 我们发现添加泛酶抑制剂并不能阻止沙门氏菌-caspase-1的诱导杀伤^−/−巨噬细胞。我们从这些分析中提出沙门氏菌-诱导巨噬细胞杀伤是线粒体中SipB活性触发的自噬介导或II型程序性细胞死亡的结果，可能在其他细胞器如内质网中也会触发。我们假设SipB可能通过破坏线粒体和/或改变线粒体融合与分裂之间的平衡来触发这种反应，它们是已知的自噬刺激物(Frank等人，2001年;托尔科夫斯基等人，2002年).

对于由以下因素触发的不同形式的程序性细胞死亡的生物学意义知之甚少沙门氏菌以及它们对发病机制和/或宿主防御的相对贡献。目前尚不清楚它们是构成宿主对传入病原体的防御反应以阻止其复制，还是由病原体触发以避免宿主防御机制的过程。caspase-1依赖型和非依赖型细胞死亡在先天性和后天性免疫应答中的具体影响沙门氏菌也不得而知。毫无疑问，对不同形式细胞死亡触发机制的理解沙门氏菌这将有助于理解这些不同形式的细胞死亡的生物学和免疫学后果。

先前的研究表明，通过TTSS传递的效应蛋白通过精确模拟宿主细胞蛋白来调节细胞功能(斯特宾斯和加拉，2001年). 在某些情况下，细菌效应器与宿主细胞蛋白质（例如，酪氨酸磷酸酶和肌醇多磷酸酶）具有广泛的氨基酸序列相似性，而在其他情况下，这种相似性在初级氨基酸序列水平上并不明显，但通过其晶体结构显示出来。SipB可能是细菌蛋白的另一个例子，它模拟宿主细胞蛋白的功能，以确保病原体的复制。这种细菌蛋白重塑线粒体和触发程序性细胞死亡的能力是微生物病原体调节细胞功能能力的一个显著例子。

野生型，投资G-、和鼠伤寒沙门氏菌以前已经描述过菌株(Kaniga等人，1994年，1995). 无效应菌株中含有空突变sopE公司，索普E2，sopB公司，平均值A，标准贯入试验，sipA公司，标准操作程序，sopD（标准操作程序）、和sopD2类根据标准程序，通过共轭和P22介导的等位基因替换策略构建基因(Kaniga等人，1994年). 编码SipB、SipB的序列_428–593通过PCR扩增、SipC或SipD，并通过标准技术克隆到pEYFP-C1或pECFP-C1（CLONTECH Laboratories，Inc.）的BamHI-XbaI位点。质粒pECFP-Sec61是Walther Mothes（耶鲁大学，纽黑文，CT）赠送的礼物。

如前所述分离线粒体(Scaffidi等人，1998年)进行了一些修改。简而言之，来自caspase-1的BMDPM^−/−巨噬细胞以约2×10的密度接种在15厘米的平板上过夜⁶每个板的细胞数。细胞感染了多种野生型感染，感染范围为～15鼠伤寒沙门氏菌或在III型分泌蛋白易位中缺陷的突变衍生物(刀槽花纹)或缺乏TTSS效应蛋白（无效应）。感染在37°C下进行50分钟。用HBSS冲洗平板三次，然后用含有100μg/ml庆大霉素的培养基再培养50分钟。用HBSS清洗平板三次。然后在37°C下，在含有200μg蛋白酶K的10 ml HBSS中培养20分钟后，向每个平板中添加含有2 mM PMSF的10 ml冰镇HBSS。通过刮取细胞，并如前所述分离线粒体(Scaffidi等人，1998年).

表达SipB、SipB的质粒_428–593按照制造商的说明，使用FuGENE™6（Roche）将Sec61转染到Cos-2细胞中。对于免疫荧光分析，细胞在转染3.7%PFA后18小时固定，在配备META检测器的共焦显微镜（LSM510；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）下进行安装和可视化。对于免疫-EM，细胞在感染后18小时固定，并按照前面所述进行处理(Seemann等人，2002年)使用GFP（由耶鲁大学纽黑文分校的L.Pelletier提供）或SipB的特异性抗体，以及金标抗兔二级抗体。

野生型或胱天蛋白酶-1^−/−将小鼠BMDPM接种在玻璃盖玻片上过夜。第二天早上，细胞被不同菌株的鼠伤寒沙门氏菌在37°C下以50:1的感染倍数持续25分钟。清洗细胞，向培养基中添加100μg/ml庆大霉素以杀死任何细胞外细菌，6小时后，用3.7%PFA固定细胞。细胞核用碘化丙啶（红色）染色，碎片染色质用TUNEL染色标记，如前所述(Chen等人，1996年). 观察自噬体caspase-1^−/−BMDPM感染了野生型或刀槽花纹（效应蛋白移位缺陷）沙门氏菌在37°C下以50:1的多重感染持续25分钟。感染后6 h，将MDC添加到培养基中，使其最终浓度达到100μM，并在37°C下再培养60 min。用HBSS清洗细胞三次，用3.7%PFA固定，并在荧光显微镜下观察。评估SipB、SipC或SipD、caspase-1的毒性^−/−根据制造商的说明（Amaxa Biosystems），使用人类CD34 Cell Nucleofector™试剂盒将编码这些蛋白的质粒转染BMDPM。简言之，8×10⁶将细胞重新悬浮在100μl Nucleofector™溶液中。添加2μg质粒DNA（pEYFP-C1、pEYFP-SipB、pEYFP-SipC或pEYFP-SipD），并将细胞转移到试管（Amaxa Biosystems）。使用Nuclefector™设备上的U-08程序对细胞进行电穿孔，再悬浮在培养基中（含有20%FBS和30%L细胞上清液的RPMI 1640），并在玻璃盖玻片上培养过夜。然后用3%PFA固定细胞，用抗GFP抗体（CLONTECH Laboratories，Inc.）和DAPI染色，并用荧光显微镜检查毒性迹象。

我们感谢Galaín实验室的成员仔细审阅了这份手稿，感谢Walther Mothes提供了各种试剂，感谢L.Pelletier提供了抗GFP抗体。

这项工作得到了国家卫生研究院拨款GM52543（给J.E.Galaín）和Damon Runyon-Walter Winchell基金会的奖学金（给L.D.Hernandez）的支持。