肠道革兰氏阴性菌沙门氏菌是人类发病率和死亡率的一个重要原因，尤其是在世界上缺乏适当卫生和保健服务系统的地区。鼠伤寒沙门菌和伤寒沙门菌是研究人员特别感兴趣的两种血清型，因为它们分别是该属成员中最普遍和最严重的疾病。鼠伤寒沙门氏菌是肠胃炎的主要病因，肠胃炎是肠道的一种急性局部炎症。只要有支持治疗，它通常是自我限制的，没有并发症。伤寒是一种更致命但不太常见的全身性疾病，主要由以下因素引起伤寒沙门氏菌其特征是持续发热，临床表现和病程因受影响的器官系统而异(1).
这两种血清型都是通过摄入受污染的食物或水而获得的。在通过上消化道之后，沙门氏菌在回肠或结肠水平感染宿主(2). 细菌通过位于淋巴滤泡上皮细胞之间的M细胞易位，穿过肠上皮屏障(三，4).沙门氏菌破坏M细胞的正常功能，采集管腔抗原侵入宿主。到达肠壁固有层后，沙门氏菌遇到与M细胞密切相关的常驻组织巨噬细胞。而不是在内化后被这些专业吞噬细胞破坏，沙门氏菌在细胞内存活(5).体外研究已经证明，巨噬细胞感染沙门氏菌spp.，包括鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌，通过凋亡导致吞噬细胞死亡(6–8).
福氏志贺氏菌，细菌性痢疾的病原体是一种引起巨噬细胞凋亡的肠道病原体在体外和体内(9–11). 分泌的侵袭素IpaB对这个过程是必要的和充分的(12，13). 根据当前模型，细胞质分布的IpaB与半胱氨酸蛋白酶caspase-1[白细胞介素1-β（IL-1β）]结合)转化酶](14)导致其激活(15). 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1活性对诱导志贺氏菌-诱导巨噬细胞凋亡(13，16).
一套新颖的沙门氏菌通过诱变研究，确定了位于染色体中位数63的操纵子上的毒力基因(17–20). 操纵子被指示抿(沙门氏菌入侵蛋白），包含五个基因：sipE公司，细纹细布，sipC公司，刀槽花纹、和sipA公司这些基因编码的蛋白质不仅与国际机场协会的操纵子志贺氏菌，操纵子的基因以相同的顺序组织(17). 特别是，SipB和IpaB与蛋白质的C末端500个氨基酸有55%的同源性(17). 这两种蛋白质之间的功能相似性的建议得到了SipB补充αS.flexneri ipaB公司巨噬细胞吞噬体内HeLa细胞入侵和逃逸突变体(17).
至此，唯一暂时归属于SipB的致病功能来自于通过Inv-Spa III型分泌装置进行蛋白质移位的研究细纹细布突变体。一些效应蛋白（如SptP、SopE和AvrA）可以分泌到细菌上清液中，但它们不能通过沙门氏菌含有这种突变的菌株(21–23). 这些结果表明SipB可能参与了易位过程。
在本研究中，我们研究了SipB在沙门氏菌-诱导巨噬细胞凋亡和caspase-1在这一过程中的潜在参与。我们报告SipB对于沙门氏菌-诱导巨噬细胞发生凋亡，该蛋白通过与必需的促凋亡酶caspase-1直接相互作用来激活该蛋白酶。
材料和方法
细菌菌株和生长条件。
本研究中使用的细菌菌株如下。野生型、致病性沙门氏菌菌株伤寒沙门菌类型2，鼠伤寒沙门氏菌C5级(17)、和鼠伤寒沙门氏菌SL1344型(24).伤寒沙门菌Ty233和鼠伤寒沙门氏菌ST100是插入突变体细纹细布亲本菌株的(17). BJ66是一株SL1344的非侵袭性等基因突变株，含有组织(25). SF620是痢疾志贺菌野生型菌株M90T，其中包含一个非极性缺失突变体ipaB接口基因(26).
伤寒沙门氏菌通过PCR扩增，并在3′末端包含一个FLAG表位标签（N-DYKDDDDK-C）细纹细布。PCR产物使用Pst（磅/平方英尺）我和Xba公司I站点（pFSipB）。
沙门氏菌菌株在37°C下在添加139 mM NaCl的LB培养基中不经搅拌培养过夜。试验当天，将细菌继代培养到LB肉汤+NaCl中，并在37°C下培养3小时。这个志贺氏菌菌株在37°C的胰蛋白酶大豆肉汤中通气生长。抗生素的使用浓度如下：氨苄西林，100μg/ml；卡那霉素，10μg/ml。
细胞毒性试验。
将小鼠巨噬细胞以2×10的密度接种到96 well板上4每个孔的细胞数，并在37°C下培养过夜。在感染细菌之前，用无血清RPMI 1640培养基代替培养基。细胞感染志贺氏菌和沙门氏菌已按说明完成(27)，通过将100:1感染多重性（moi）的细菌旋转到细胞上（600×克10分钟），然后在37°C下孵育。培养30分钟后，加入庆大霉素（90μg/ml）杀死细胞外细菌。在感染期间的指定时间点，收集培养上清液作为实验释放样品进行分析。用CytoTox96乳酸脱氢酶（LDH）释放试剂盒（Promega）比色法定量细胞毒性。细胞毒性百分比用公式计算：100×[（实验释放−自发释放）/（总释放−自发释放）]，其中自发释放是未感染细胞上清液中LDH活性的量，总释放是巨噬细胞裂解物中的活性。
半胱氨酸蛋白酶-1抑制剂研究。
在感染前1小时，将RAW264.7巨噬细胞与50μM乙酰Tyr-Val-Ala-Asp氯甲基酮（Ac-YVAD-CMK；Bachem Bioscience，King of Prussia，PA）孵育。巨噬细胞感染如前所述。在感染后4小时，对培养上清进行LDH释放检测。
微量注射分析。
按照所述进行微注射实验(28). 简单地说，从小鼠中分离出腹腔巨噬细胞，并将其置于RPMI 1640培养基（GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD）中的玻璃盖玻片上，该培养基补充有10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和50μg/ml每种青霉素/链霉素（完全培养基）。将细胞在37°C下培养3-8小时，然后用PBS清洗。将样品装入用自动P80/PC微移液器（Sutter Instruments）制成的玻璃毛细管微移液管中。划伤盖玻片上的一个特定区域以定位注射区域，并在该区域内显微注射单层巨噬细胞（0.3–0.7×10−11使用Eppendorf微量注射系统，使用编码样品（750μg蛋白质/ml）。微量注射后，将细胞在37°C下孵育4-6小时，用1μM碘化丙啶（PI）/PBS对活细胞进行染色。对每个微量注射的细胞进行鉴定，并对其进入细胞核的PI摄取进行评分。由于注射设备的机械操作（通过注射PBS进行控制），巨噬细胞单层内未观察到背景杀伤。谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）样品控制GST融合蛋白中是否存在该肽。
免疫细胞化学。
间接免疫荧光研究如下：RAW264.7巨噬细胞以5×10的密度接种在35mm组织培养皿中的22cm玻璃盖玻片上5每个培养皿，在37°C下培养过夜。细胞以100:1moi（600×克10分钟），然后在37°C下培养。此时，用PBS清洗细胞，用4%多聚甲醛/PBS固定，用0.1 M甘氨酸/PBS淬火，用冷丙酮渗透，用正常山羊血清封闭，然后用抗FLAG M2抗体（伊士曼柯达）+RNase A（1 mg/ml）孵育。然后再次阻断细胞，用与荧光素结合的抗鼠二级抗体孵育，最后用PI孵育后再安装在玻片上，通过共焦显微镜（分子动力学）进行分析。在免疫电子显微镜下，RAW264.7巨噬细胞被感染伤寒沙门菌Ty233/pFSipB或Ty233/4pSipB固定40分钟，然后用2%甲醛和1%戊二醛混合物在冰上固定35分钟。样品在分级乙醇系列中通过培养脱水，然后渗透分级低苦杏仁白色系列。样品在55°C下在旋转器上培养，直到在50°C下聚合。用2%的BSA封闭切片（70 nm），然后用抗FLAG单克隆抗体（1:250）孵育1小时。然后用与10-nm金颗粒（BBInternational）结合的抗鼠IgG孵育30分钟，然后用1%醋酸铀酰染色3分钟，柠檬酸铅染色30秒。样品在CM12飞利浦透射电子显微镜上进行分析。图像显示为原始图像和使用photoshop（加利福尼亚州山景城Adobe Systems），背景强度降低，单个黄金颗粒突出显示。
成熟度测定。
在杀死C57BL/6小鼠前4天，腹腔注射1 ml巯基乙酸盐培养基（GIBCO/BRL）。巨噬细胞用冷的无菌PBS腹腔灌洗收集，在RPMI 1640培养基中洗涤，密度为5×105在RPMI完全培养基中的24孔板上，然后在37°C下培养3小时。用培养基清洗贴壁细胞三次，然后用含有1μg/ml纯化苯酚水的培养基激活过夜痢疾志贺菌1A脂多糖（LPS）（西格玛）。然后用无血清培养基清洗细胞，然后感染指示的细菌。将庆大霉素（90μg/ml）添加到感染的细胞培养物中，持续30分钟以上。通过离心法清除感染细胞的裂解液，然后用SDS/PAGE分析，然后转移到硝化纤维素和免疫印迹(29). 用兔抗鼠Caspase-1（p45）抗体免疫印迹法测定Caspase-1和IL-1β的成熟度(｛“type”：“entrez nucleotide”，“attrs”：｛“text”：“R10311”，“term_id”：“762267”，“term_text”：“R10311”｝10311兰特，Doug Miller，Merck Laboratories，Rahaway，NJ赠送的实物）或山羊抗小鼠IL-1β一级抗体（R&D Systems，Minneapolis，MN）。
Caspase-1−/−巨噬细胞感染。
在采集腹腔巨噬细胞前4天，向Caspase-1敲除小鼠（默克实验室John Mudgett赠送的礼物）和Balb/c小鼠注射3%巯基乙酸。约5×104将腹腔巨噬细胞接种到96周培养皿的每个孔中，按照上述10:1 moi感染8小时。然后对培养上清液进行Cytotox96分析。
结合试验。
无细胞分析。生产GST-SipB，PCR-扩增细纹细布被结扎到巴姆HI和Xba公司表达载体pGEX-KG的I位点(30)产生融合蛋白。用异丙基β诱导含有pGEX-KG/SipB或单独含有pGEX-KG的菌株SF620 3小时-d日-37°C下的硫代半乳糖苷。通过离心收集细菌培养物，并用1 mM苯甲基磺酰氟、10μg/ml抑肽酶、10μg/ml胃蛋白酶抑制素A和10μg/ml亮氨酸肽在PBS中重新悬浮。细菌通过法式压榨机进行裂解，裂解产物与谷胱甘肽-Sepharose 4B珠（法玛西亚生物技术公司）一起培养。洗涤后，用谷胱甘肽从小球中洗脱GST-SipB或GST，然后透析和浓缩，然后用于分析。J774A.1电池（109收集、清洗每个结合反应的细胞，并通过在裂解缓冲液（PBS与1%Triton X-100、5 mM EDTA、0.1%2-巯基乙醇、1 mM苯甲基磺酰氟、10μg/ml抑肽酶、10μg/ml胃蛋白酶抑制素A和10μg/ml亮氨酸蛋白酶）中孵育进行裂解。裂解液以160000×克4°C下培养1小时，然后在4°C用谷胱甘肽-脑葡萄糖珠培养过夜。将纯化的GST-SipB或GST（25μg）添加到等分的细胞裂解液中，并在4°C下孵育过夜，然后在PBS中用60个体积为1%Triton X-100的床层进行洗涤。通过在SDS/PAGE样品缓冲液中煮沸，将蛋白质从珠中洗脱出来，用SDS/PACE分离，转移到硝化纤维素中，并用抗小鼠caspase-1抗体进行免疫印迹分析。
受感染的完整细胞检测。
约8×107如上所述，在37°C下，用SF620/pFSipB或SF620/p SipB感染J774A.1细胞40分钟。细胞用冷PBS洗涤三次，刮除，并通过离心收集。细胞在上述裂解缓冲液中培养，然后以2700×克在4°C下保持30分钟。在用预先加载有抗FLAG M2抗体的IgG-琼脂糖珠孵育之前，用IgG琼脂糖小球隔夜清除裂解产物。在PBS中用40床体积的1%Triton X-100清洗后，洗脱蛋白质并进行如上所述的免疫印迹处理。
结果
沙门氏菌-诱导的巨噬细胞毒性依赖于SipB。
的容量鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门菌诱导巨噬细胞凋亡首先被识别为在体外使用两种小鼠巨噬细胞系J774A.1和RAW264.7以及骨髓源巨噬细胞作为靶细胞进行分析(6–8). 细胞死亡依赖于时间和moi。我们试图确定SipB在这一过程中的作用。图。显示了野生型巨噬细胞感染10小时后的细胞死亡检测结果伤寒沙门氏菌，的细纹细布突变体Ty233，或由单独载体或含有细纹细布通过测量细胞质酶LDH的释放来确定细胞毒性。野生型伤寒沙门菌杀死52%的巨噬细胞，而失去细纹细布这种表达导致细胞毒性的消除。垂死的细胞表现出典型的细胞和核凋亡形态学改变(31)（未显示数据）。正在添加细纹细布反式导致杀伤的恢复，从而证明细胞毒性缺陷是由SipB的丢失引起的，而不是对操纵子其他成员的突变产生极性影响。在细胞毒性试验中对RAW264.7细胞、小鼠腹腔巨噬细胞和佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯分化的THP-1人单核细胞进行测试时，也发现了类似的结果（数据未显示）。我们的结果与陈的报告一致等。(7)，其中细纹细布突变体被发现是非细胞毒性的。
SipB对细胞毒性的依赖性沙门氏菌在J774A.1巨噬细胞系上.以100:1的moi感染细胞10小时，然后进行LDH释放分析。野生型伤寒沙门菌（WT）对J774A.1细胞具有细胞毒性。插入突变体细纹细布（SipB-）没有保留细胞毒性表型，可以通过细纹细布反式（SipB−/pFSipB）。阴性对照（SipB−/pUC19）没有恢复杀灭活性。给出了三个实验的平均值和标准偏差。
SipB足以引起细胞凋亡。
我们进行了微量注射研究，以测试SipB是否直接参与促进细胞凋亡或作为“转定位酶”间接参与(21，22). 每个样本至少600个腹腔巨噬细胞微注射750μg/ml纯化GST-SipB融合蛋白、纯化GST-IpaB或仅GST作为阴性对照。细胞死亡通过PI进入细胞核进行量化，并通过与凋亡一致的形态学改变进行确认。GST–SipB和GST–IpaB均能有效杀死巨噬细胞（分别为76±5%和85±5%），而相同浓度的GST注射产生了背景水平的细胞毒性（24±4%）。图。(C类和E类)显示细胞具有典型的凋亡形态，如细胞圆形、收缩和空泡化。这些结果为SipB在诱导细胞凋亡中的直接作用提供了证据。
微量注射SipB后，巨噬细胞被杀死。现场的每一个巨噬细胞都被微量注射纯化的GST(一个和B类，同一字段），GST–IpaB(C类和D类，相同字段），或GST–SipB(E类和F类同场），然后在PBS中用PI染色，不固定。然后对凋亡细胞进行PI摄取和细胞形态评分。更多的细胞对GST–SipB中的PI摄取和凋亡细胞改变呈阳性(E类和F类)和GST–IpaB(C类和D类)注射的细胞比GST注射的细胞多(一个和B类). 箭头突出显示了一些正在凋亡的细胞。凋亡水平的量化见正文。
SipB定位于沙门氏菌-感染的巨噬细胞。
作为诱导凋亡的候选效应分子，我们研究了SipB的亚细胞定位。在巨噬细胞感染过程中，沙门氏菌维持在内胚体室中；细菌永远不会直接进入细胞质。用间接免疫荧光法测定感染过程中吞噬体内是否存在SipB伤寒沙门菌。通过PCR，我们设计了细纹细布编码蛋白质氨基末端的FLAG八肽表位标签（FSipB）。然后，FSipB蛋白可以被抗FLAG单克隆抗体（M2Ab）检测到。FSipB由分泌伤寒沙门菌体外培养并且可以补充伤寒沙门菌巨噬细胞细胞毒性试验中缺乏内源性SipB（Ty233）（数据未显示）。用Ty233作为阴性对照或用FSipB构建物（Ty233/pFSipB）转化的Ty233.感染巨噬细胞。感染45分钟后，对样品进行间接免疫荧光处理，并用共焦显微镜对载玻片进行分析（图。 一个和B类). 由于DNA结合染料PI的染色，细菌和细胞核可见红色。FSipB是由荧光标记的二级抗体检测到的，在图像中呈绿色。如图所示。一个感染Ty233/pFSipB的巨噬细胞含有绿色荧光图案，该图案延伸至吞噬体边界以外，并包围了细胞质的大部分。我们注意到SipB在细胞质中分布不均匀。事实上，即使在以后的时间点，这种SipB扩散模式仍然存在（数据未显示）。似乎存在某种性质的限制或排除。感染Ty233的对照细胞（图。B类)未被抗FLAG抗体染色。
SipB的亚细胞定位沙门氏菌-受感染的巨噬细胞。RAW264.7细胞感染伤寒沙门菌pFSipB转化的Ty233(一个，C类、和E类)，pSipB(D类和F类)，或仅矢量(B类)持续40分钟。间接免疫荧光(一个和B类)：巨噬细胞核和细菌均用DNA结合染料PI染色。通过使用荧光素标记的第二抗体（绿色）检测FSipB，并显示其分散在受感染巨噬细胞的细胞质中。免疫电子显微镜：金颗粒显示FSipB的大部分位于巨噬细胞的细胞质中(C类和E类). FSipB与内膜，尤其是内质网之间似乎存在关联。(E类)计算机增强中发现的信号C类.未检测到缺乏FLAG表位的SipB(D类和F类). (F类)计算机增强中发现的信号D类（棒材=10μm）
为了解决SipB的不均匀分布，并以更高的分辨率确定其定位，我们进行了免疫电子显微镜检查。我们使用了Ty233/pFSipB菌株（图。C类)用不含FLAG表位（Ty233/pSipB）的SipB转化Ty233作为阴性对照（图。D类). 用这两种菌株感染巨噬细胞45分钟，并进行免疫电镜处理。为了可视化ImmunoGold颗粒，如图3所示C类和D类这些图像的背景强度降低了，黄金颗粒被Adobe标记photoshop以生成图。 E类和F类分别为。代表FSipB定位的免疫金颗粒分布与免疫荧光图像一致。吞噬体内含有与细菌相关的金颗粒。然而，大多数信号存在于细胞质中。通过对大量图像的回顾，我们注意到细胞质SipB通常与细胞膜相关，主要是内质网。正如预期的那样，感染阴性对照Ty233/pSipB的细胞切片没有标记（图。 D类和F类).
SipB直接与Caspase-1结合。
定位研究表明，SipB在感染沙门氏菌因此，SipB与促凋亡caspase-1共享相同的亚细胞隔室(32). 为了确定SipB是否与caspase-1直接相互作用，我们进行了无细胞和完整细胞结合研究。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1在巨噬细胞中以45-kDa前体形式表达，然后需要蛋白水解过程最终产生成熟半胱氨酸蛋白酶-1的10-kDa和20-kDa亚单位(33).
对于无细胞结合分析，我们生成了GST–SipB融合蛋白，用作亲和纯化的配体。巨噬细胞细胞质裂解物与GST–SipB或GST单独孵育，然后应用于谷胱甘肽-糖粒。GST–SipB结合组分的免疫印迹显示两种蛋白被抗caspase-1抗体识别（图。一个). 这些蛋白质的分子量分别为45和33 kDa，与前体形式caspase-1和中间裂解产物的大小相匹配。SipB和caspase-1之间的相互作用具有特异性，因为抗caspase-1抗体在GST结合部分中未检测到任何蛋白质。
结合分析以确定SipB是否与caspase-1结合。(一个)对来自J774A.1细胞裂解物的GST（第1道）和GST–SipB（第2道）亲和纯化蛋白进行Western blot分析，用15%SDS/PAGE凝胶和抗小鼠caspase-1兔血清进行解析。GST–SipB特异性结合到抗半胱氨酸-1抗体识别的45和33 kDa的两种蛋白质上。这些蛋白质是caspase-1的前体及其中间形式之一。(B类)用SF620/pSipB（通道2）或SF620/p FSipB（通道3）感染J774A.1细胞40分钟后，用抗FLAG抗体免疫共沉淀的蛋白质的Western blot分析。作为对照，包括来自未感染的等效数量细胞的裂解物（泳道1）。样品在15%SDS/PAGE上溶解，并用抗caspase-1抗体进行免疫印迹。胱天蛋白酶-1（p45）的前体形式与FSipB共免疫沉淀，表明SipB在巨噬细胞感染过程中与胱天蛋白酶-1结合。抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1抗体没有识别出从暴露于缺乏FLAG表位的SipB的细胞裂解液中免疫沉淀的蛋白。
为了测试SipB在实际细胞感染期间是否与caspase-1结合，我们用志贺氏菌菌株SF620转化为表达FSipB或SipB。我们使用这种突变株是因为它比沙门氏菌可能是因为它能更有效地将SipB传递给巨噬细胞。感染40分钟后，将细胞溶解，并用载有抗FLAG抗体的IgG-琼脂糖微球对细胞质部分进行检测。通过免疫印迹法和抗caspase-1抗体分析产生的免疫沉淀物（图。B类). 正如预期的那样，caspase-1并没有从感染了缺乏FLAG表位的表达SipB的SF620的细胞的裂解液中沉淀出来。然而，FSipB确实与caspase-1的45kDa前体形式结合，因此表明我们观察到的结合在体外巨噬细胞感染时也会发生。
SipB激活Caspase-1对细胞毒性是必要的。
然后检查SipB和caspase-1之间相互作用的生物学相关性。我们测试了在感染期间是否接触SipB沙门氏菌导致将45-kDa前体形式的caspase-1催化加工成成熟酶的20-kDa和10-kDa亚基。感染LPS活化的腹腔巨噬细胞的裂解物鼠伤寒沙门氏菌用抗caspase-1抗体进行免疫印迹分析（图。一个). 巨噬细胞的LPS激活并未导致caspase-1表达上调。野生型感染后10分钟内检测到caspase-1成熟为20-kDa形式鼠伤寒沙门氏菌在观察到的感染过程中，这种成熟型的水平持续增加。注意，较小的10-kDa亚单位不能被该抗体检测到，因此在免疫印迹中不可见。不出所料，感染70分钟，无细胞毒性细纹细布插入突变体ST100并没有导致酶的加工。
Caspase-1在巨噬细胞感染时被激活沙门氏菌(一个和B类)LPS激活的小鼠腹腔巨噬细胞感染鼠伤寒沙门氏菌C5.感染10分钟（通道2）、25分钟（通道3）、40分钟（通道4）和70分钟（通道5）后，细胞裂解物在15%SDS/PAGE凝胶上溶解，并用抗caspase-1抗体进行免疫印迹(一个)或抗IL-1β抗体(B类). 作为对照，巨噬细胞感染了细纹细布突变ST100 70分钟（每个凝胶中的通道1）并并行处理。caspase-1及其特异性底物IL-1β在感染后10分钟内进行催化成熟，在整个感染过程中观察到成熟形式的积累。
诱导caspase-1生物活性的测试是确定其已知底物之一IL-1β的成熟状态。这种促炎细胞因子以31kDa的前体形式存在，可被特异性切割成成熟的、生物活性的17kDa形式。LPS处理激活腹腔巨噬细胞导致IL-1β前体表达上调至用抗IL-1β抗体免疫印迹检测到的水平。如图所示。B类，野生型感染鼠伤寒沙门氏菌结果感染ST100后，IL-1β裂解为成熟形式，而IL-1β未裂解。因此，胱天蛋白酶1被沙门氏菌感染。
Caspase-1直接参与沙门氏菌-诱导的细胞凋亡。
caspase-1的激活被发现在沙门氏菌-诱导巨噬细胞凋亡。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1活性可被对该蛋白酶具有高亲和力的抑制剂Ac-YVAD-CMK不可逆转地阻断。如图所示。一个、野生型感染前用Ac-YVAD-CMK预处理巨噬细胞鼠伤寒沙门氏菌根据用于感染的moi，导致杀灭率显著降低至野生型细胞毒性的7%或27%。仅用抑制剂培养细胞不会改变其存活率（数据未显示）。
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1对诱导细胞凋亡至关重要。(一个)YVAD对RAW264.7巨噬细胞的保护作用沙门氏菌-诱导细胞死亡。感染前1小时鼠伤寒沙门氏菌SL1344在100:1（1和2）或50:1（3和4）的moi下，用50μM Ac-YVAD-CMK（2和4）或单独培养基（1和3）预培养细胞。caspase-1抑制剂的存在导致细胞毒性降低。(B类)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1对沙门氏菌-诱导细胞毒性。野生型或caspase-1−/−小鼠的腹腔巨噬细胞感染S。鼠伤寒SL1344或BJ66。SL1344杀死了野生型小鼠的巨噬细胞，而SL1344和BJ66都不能杀死缺乏caspase-1的巨噬细胞。给出了三个实验的平均值和SDs。
为了确定caspase-1是否对观察到的细胞毒性至关重要，我们用以下两种方法感染了来自野生型和caspase-1基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞鼠伤寒沙门氏菌SL1344或非侵入性衍生物BJ66。感染8小时后，SL1344（而非BJ66）杀死了野生型小鼠约85%的巨噬细胞，而缺乏caspase-1的腹腔巨噬细胞对沙门氏菌-诱导细胞毒性（图。B类). 因此，caspase-1活性对于细胞凋亡过程的发生是必要的沙门氏菌感染。
讨论
我们已经确定分泌蛋白SipB是诱导感染巨噬细胞凋亡的效应分子鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门菌当微量注射纯化的SipB时，巨噬细胞会发生细胞死亡，这表明该分子足以诱导细胞凋亡。细胞质分布的SipB直接参与巨噬细胞凋亡机制的关键成分caspase-1。正是这种相互作用可能导致caspase-1的激活（图。一个)从而促进细胞凋亡所必需的尚未定义的下游事件。如敲除细胞毒性研究所示（图。B类)caspase-1活性是必需的，因此对参与凋亡途径至关重要。此外，IL-1β成熟为其生物活性形式（图。B类)并可能引发炎症反应体内因此，SipB不仅是志贺氏菌，它也是一个模拟。SipB是否也可作为其他毒力因子的转位酶，尚待确定。
SipB和IpaB通过类似机制明显诱导细胞凋亡。然而，相应的细菌将这些蛋白质传递到其作用的细胞隔室的方法是完全不同的。通过吞噬作用内化后，志贺氏菌迅速逃离吞噬体并直接将IpaB分泌到细胞质中。相反，沙门氏菌维持在吞噬体内，因此远离巨噬细胞细胞质。我们的研究（图。 A–F)还有Collazo和Galán(22)明确显示SipB在感染期间进入细胞质；然而，Collazo和Galán报告了SipB在细胞质中的均匀分布，而我们观察到的是一种局限的细胞质模式。无论如何，SipB很可能直接穿过吞噬体膜屏障，或插入吞噬体膜，然后通过囊泡化事件释放，从而实现细胞质分布。SipB与内质网等内膜的明显优先结合支持了后者的假设。事实上，Garcia-del Portillo的免疫荧光研究等(34)证明LPS散布在沙门氏菌-通过吞噬体的囊泡化感染巨噬细胞。可能SipB也使用这种运输方式。
诱导细胞凋亡在沙门氏菌病发病机制中的重要性尚不明确。里希特·达尔福尔斯等。(35)证明巨噬细胞凋亡发生在感染鼠伤寒沙门氏菌在他们的研究中，他们没有对肠壁、脾脏和胆囊等其他可能的凋亡部位发表评论。因此，我们不知道程序性细胞死亡是否更普遍。在志贺氏菌病的病例中，动物模型已经证明，成熟的、生物活性的IL-1β的释放，可能是通过巨噬细胞的凋亡，对于促进随后发生的急性炎症至关重要(36). 在沙门氏菌病中，由于肠道炎症的不同性质和系统感染的可能性，巨噬细胞凋亡和IL-1β释放的作用不太明确。体内目前正在进行研究，以确定细胞凋亡的程度和意义，尤其是IL-1β的释放对沙门氏菌病的发展和最终解决的影响。
