干扰素是宿主对病毒感染的先天免疫的关键组成部分，通过几种途径阻止病毒生长和毒力（参考文献。1–三; 图。). 我们考虑了单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的ICP34.5基因灭活干扰素应答的特定成分的假设体内该假设基于观察结果，即ICP34.5抑制细胞培养中IFN诱导的双链RNA依赖性蛋白激酶R（PKR）系统（图。; 参考文献。4–6)并且缺乏ICP34.5的病毒被严重削弱体内(7，8). PKR的激活导致真核细胞起始因子2α（eIF-2α）的α亚基磷酸化，随后导致宿主和病毒蛋白质合成和复制的停止（图。; 参考文献。9和10). 此外，PKR磷酸化IκB并激活NF-κB，这些转录因子可能有助于IFN依赖性抗病毒作用(11). ICP34.5靶向PKR依赖性反应的假设很有吸引力，因为ICP34.5与蛋白磷酸酶结合，使其去磷酸化eIF-2α，从而可能否定PKR的抗病毒作用（图。; 参考文献。2和12).
干扰素介导RNase L和PKR通过独立途径诱导抗病毒状态。对于核糖核酸酶L，干扰素与其受体相互作用导致2-5A合成酶的表达，该合成酶在双链RNA结合后产生2′，5′-寡腺苷酸，导致核糖核酶L激活和阻断病毒复制。干扰素还诱导PKR的表达，PKR也通过双链RNA结合被激活。PKR的活性之一是磷酸化eIF-2α，导致蛋白质合成停止和病毒复制受阻。为了避免这种抗病毒机制，HSV-1 ICP34.5与蛋白磷酸酶1α结合并去磷酸化eIF-2α，解除对病毒复制的阻碍。在本研究中，使用干扰素受体、RNase L和PKR（灰盒）无突变的小鼠来分析ICP34.5与这些通路的相互作用。
我们之前证明，在缺乏1型（IFN-αβ）和2型（IFN-γ）IFN受体（IFN-βγR）的小鼠中，基因ICP34.5中的HSV-1突变株生长到正常水平，并表现出野生型毒性−/−). 尽管在正常小鼠中，突变体的复制和神经毒力降低了10000倍，但仍获得了这些结果(13). 通过删除IFN受体恢复ICP34.5突变的正常表型与IFN作用的某些方面的假设一致体内是ICP34.5基因的主要靶点。然而，干扰素受体的缺失也导致了ICP0、胸苷激酶无突变的HSV小鼠的复制增加(tk公司)核糖核苷酸还原酶与病毒宿主关闭(甚高频系统)基因。增加病毒复制体内因此，由于干扰素受体的丢失，并不是缺乏ICP34.5的病毒的特性。
我们确定必须满足三个标准才能验证ICP34.5阻断PKR依赖性抗病毒作用的假设体内这种相互作用对神经毒力至关重要。首先，在缺乏PKR（PKR）的小鼠中，ICP34.5缺失的病毒必须表现出恢复的生长和毒性−/−老鼠）。其次，在缺乏独立于PKR的干扰素诱导抗病毒途径的小鼠中，不能恢复ICP34.5缺失病毒的生长和毒性。第三，非ICP34.5基因突变的HSV株必须在PKR中保持减毒−/−老鼠。在本研究中，我们测试并满足这三个标准，表明通过删除ICP34.5而减弱的病毒在删除PKR基因的宿主中具有野生型复制和毒力。这种特定的表型恢复都定义了ICP34.5的关键分子靶点体内并为确定微生物毒力机制提供了遗传标准体内.
材料和方法
病毒和细胞Vero。
（非洲绿猴肾）细胞进行繁殖，并按所述进行所有病毒株的生长和检测(14). HSV-1的KOS株是突变病毒UL41NHB的背景(甚高频系统无义突变在这里称为Δvhs；裁判。15)和数字图书馆8.36tk公司(tk公司删除，这里称为Δtk；裁判。16). ICP34.5突变体17TermA（此处称为Δ34.5）及其标志物拯救病毒17TermAR（右）（此处称为控制病毒）以及tk公司缺失17/tBTK（−）（在这里称为17Δtk）及其标记拯救病毒17/tBRTK（+）（在此处称为17△tkR）是在菌株17的背景下进行的，由Richard Thompson（俄亥俄州辛辛那提大学；参考文献。8和17).
老鼠拉伤。
小鼠在华盛顿大学医学院生物安全二级动物设施中饲养和繁殖，每3-6个月对哨兵小鼠进行一次小鼠病原体筛查，结果为阴性。PKR和RNase L缺失的小鼠分别为129 Ev/Sv/C57BL/6J和C57BL/6J背景(11，18). 删除小鼠的干扰素受体（IFN-αβR−/−和干扰素-αβγR−/−)具有129 Ev/Sv背景，最初从Michel Aguet（苏黎世大学分子生物学研究所，苏黎世；参考。三). 菌株129 Ev/Sv（简称129）、C57BL/6（Taconic，简称B6）和（129 Ev/Sv×C57BL/6）F1杂交（Taconic，简称129/B6）小鼠用作免疫活性对照。
动物程序。
6-8周龄的小鼠用甲苯噻嗪和氯胺酮麻醉。用一根27 gauge的针头和5μl含有2×104或2×106每只眼睛加入病毒斑形成单位（pfu）。将盖子轻轻按摩在一起，以促进病毒的吸附。按说明进行了急性感染的眼拭子和三叉神经节化验(15). 简单地说，对于眼拭子，将眼睛伸出，并使用湿润的棉拭子对眼睛表面进行取样，在将拭子放入1 ml组织培养基中之前，在眼睛周围以环形方式进行三次，并在眼睛上进行两次，形成“X”。在MiniBeadbeater-8（美国俄克拉何马州巴特尔斯维尔市Biospec Products）中使用1mm珠，在1ml组织培养基中均匀化取样的三叉神经节。所有样本均通过Vero细胞上的标准菌斑试验进行效价测定。所有数据均为对数平均值±SEM，检测限为10 pfu。基本上按照所述进行了脑内接种(15). 简而言之，用含有适当病毒的20μl病毒接种物在小鼠脑内接种，并记录死亡时间。所有小鼠程序均符合华盛顿大学动物研究委员会批准的方案。
结果
ICP34.5生长的特定标准化−PKR中的病毒−/−老鼠。
我们检测了PKR中ICP34.5突变体的复制−/−小鼠和使用菌株129/B6 F1杂交小鼠作为野生型对照。本研究中使用的所有129和129/B6品系小鼠都是在129品系中繁殖的，与用于产生PKR的129品系相同−/−和IFN-αβγR−/−老鼠。这种育种方式是为了避免129个菌株之间的变异可能导致的数据偏差(19). 作为阳性对照，我们感染了IFN-αβγR−/−缺乏整个干扰素途径激活的小鼠与129株小鼠一起作为野生型对照（图。). 作为宿主抗性基因特异性的对照，我们还通过同时感染缺乏RNase L（RNase L−/−老鼠；裁判。20)与B6小鼠一起作为野生型对照。干扰素诱导合成2-5（A）寡腺苷酸合成酶，其产物导致潜在核糖核酸酶L的激活(21). 该途径对控制RNA和DNA病毒的复制很重要(22). 我们推断RNase L−/−小鼠为分析ICP34.5突变病毒提供了有效的对照，因为PKR和RNase L都是IFN依赖的抗病毒途径，但ICP34.5被认为只针对PKR（参考文献。4; 图。).
各种野生型菌株和PKR−/−，干扰素-αβγR−/−和RNase L−/−小鼠通过角膜感染减弱的ICP34.5突变体17TermA（此处称为Δ34.5）或其标记拯救病毒17TermAR（此处称之为控制病毒），该病毒具有野生型生长和毒性。在角膜上皮和三叉神经节中测量病毒复制（图。). 在所有野生型小鼠菌株中，Δ34.5的复制显著(对<0.01），与对照病毒相比，眼睛减少了1000倍（图。 A类，C类、和E类). 这些结果与已发表的小鼠和兔子的结果一致(23，24). 在PKR中−/−和干扰素-αβγR−/−然而，小鼠角膜中Δ34.5的复制在统计学上无法区分(对=0.84和对=0.27）从对照病毒（图。 B类和D类). 相反，在RNase L中−/−小鼠，Δ34.5的复制衰减仍然显著(对<0.02）相对于控制病毒（图。F类). 在三叉神经节急性感染期间观察到类似的模式（图。). 在核糖核酸酶L神经节中几乎未检测到Δ34.5的生长−/−和所有野生型小鼠株，但恢复到控制PKR中的病毒水平−/−和干扰素-αβγR−/−老鼠。因此，PKR（而非RNase L）的零突变恢复了缺乏ICP34.5的病毒的正常生长，从而满足上述第一和第二标准。
角膜中控制病毒（闭合正方形）和Δ34.5（开放三角形）的复制。(A类)野生型129/B6小鼠的生长（一个实验，每个时间点四到六个样本；对双尾<0.01t吨测试）。(B类)PKR缺陷小鼠（三个实验，每个时间点四个样本；对>0.8）。(C类)野生型129只小鼠（两个实验，每个时间点有四个样本；对< 0.01). (D类)干扰素-αβγ受体缺乏小鼠（两个实验，每个时间点四个样本；对> 0.27). (E类)野生型C57BL/6小鼠（一个实验，每个时间点四到六个样本；对< 0.01). (F类)RNase L缺乏小鼠（三个实验，每个时间点四个样本；对< 0.02). 所有数据均通过双尾分析t吨测试，所示值为对数平均值（±SEM）。对照病毒和Δ34.5都在菌株17的背景中。检测极限为10 pfu。
野生型129/B6小鼠感染后3天三叉神经节内对照病毒（实心条）和Δ34.5（阴影条）的复制（一个实验；每个时间点四个样本；对<0.001），PKR缺陷小鼠（三个实验；每个时间点四个样本；对>0.9），野生型129只小鼠（两个实验，每个时间点四个样本；对<0.001），干扰素-αβγ受体缺乏小鼠（两个实验，每个时间点四个样本；对>0.3），野生型C57BL/6小鼠（一个实验，每个时间点六个样本；对<0.001）和RNase L缺乏小鼠（三个实验，每个时间点四个样本；对< 0.01). 所示值为对数平均值（±SEM）。对照病毒和Δ34.5均在17号菌株的背景中。
PKR缺失导致生长正常化是缺乏ICP34.5的病毒特有的。
我们认为PKR可能是干扰素对抗所有弱毒病毒的抗病毒作用的关键，这些弱毒病毒在缺乏干扰素受体的小鼠中的复制可以显著增强。另外两种减毒病毒，胸苷激酶(tk公司)空突变体数字图书馆8.36tk（称为Δtk）和病毒宿主关闭(甚高频系统)因此，将空突变UL41NH（此处称为Δvhs）用作ICP34.5-PKR关系特异性的对照。相对于KOS，野生型小鼠角膜和神经节中Δtk和Δvhs的复制减少（图。 A类和D类). IFN-αβγR的角膜和三叉神经节−/−小鼠，Δtk和Δvhs的复制增强，但没有完全恢复（图。 B类和D类). 相反，PKR的缺失并没有(对>0.05）显著促进任一病毒的生长（图。 C类和D类)与Δ34.5得出的结果形成鲜明对比（图。和). 然而，这两个突变体（Δtk和Δvhs）都是HSV-1 KOS的背景，而Δ34.5及其控制病毒是17 syn+因此，我们考虑了以下假设：Δtk和Δvhs缺乏表型恢复是由于这些病毒处于不同的弱毒力菌株的背景中。为了解决这个假设，PKR−/−129/B6小鼠感染了在17 syn株背景下产生的tk突变体（称为17Δtk）或标记拯救病毒（称为Δtk17R）+与Δ34.5及其对照病毒背景相同。在角膜和三叉神经节（图。 E类–G公司)，17Δtk在PKR中的复制没有增强−/−小鼠与129/B6对照小鼠进行比较。这一结果表明，PKR的缺失逆转了ICP34.5突变体的生长缺陷表型，并没有导致所有减毒病毒的生长普遍增加，因此符合上述第三个标准。
角膜和三叉神经节中KOS、Δtk、Δvhs、17Δtk和17ΔtkR的复制。在野生型129只小鼠中，KOS（闭合正方形）、Δtk（开放三角形）和Δvhs（开放圆圈）在角膜中复制(A类)，干扰素-αβγR−/−老鼠(B类)，和PKR缺陷小鼠(C类). (D类)KOS（实心棒）、Δtk（阴影棒）和Δvhs（开放棒）野生型129、PKR缺乏和IFN-αβγ受体缺乏小鼠三叉神经节的生长。野生型129/B6小鼠角膜中17Δtk（开放三角形）和17ΔtkR（闭合正方形）的复制也显示出来(E类)和PKR−/−老鼠(F类). (G公司)野生型129/B6和PKR-缺陷小鼠的三叉神经节生长17ΔtkR（阴影条）和17Δt k（实心条）。所示值为四到六个样品的对数平均值（±SEM）。Δtk和Δvhs是应变KOS的背景。17Δtk和17ΔtkR是应变17的背景。
ICP34.5毒力的特定标准化−PKR中的病毒−/−老鼠。
除了生长减少外，缺乏ICP34.5的HSV菌株有10株4-到106-角膜或脑内（i.c.）感染后对小鼠的致死性测定显示，神经毒力比对照病毒低一倍(7，8). 因此，我们推断，如果ICP34.5否定PKR体内小鼠PKR的去除应能完全恢复Δ34.5病毒的致死性。因此，通过测量小鼠经静脉或角膜感染后的存活率来评估Δ34.5和对照病毒的毒性。鉴于PKR的激活和抗病毒活性取决于IFN及其受体，我们首先评估了Δ34.5和对照病毒在感染IFNR后的致死性−/−老鼠。静脉注射对照病毒后，129个野生型干扰素-αβR的百分之百−/−和干扰素-αβγR−/−小鼠在感染后4天内死亡（图。A类). 干扰素-αβR感染−/−和干扰素-αβγR−/−Δ34.5的小鼠在感染后3天内死亡100%，但129只野生型小鼠仅死亡20%（图。B类). PKR感染后获得类似数据−/−老鼠。经静脉注射对照病毒后，129/B6野生型和PKR的百分之百−/−小鼠在感染后6天内死亡（图。C类). 静脉注射Δ34.5病毒后，PKR 100%−/−小鼠在感染后5天内死亡，但129/B6野生型小鼠中没有一只死亡（图。D类). 上述所有实验均以2×10的输入剂量重复进行4pfu。在2×10剂量下进行的多次实验中获得了相同的结果5pfu（未显示数据）。这些数据表明，干扰素受体或PKR的缺失可以恢复ICP34.5缺失突变的毒力。
野生型、IFN受体缺陷型和PKR缺陷型小鼠脑内感染后的存活率。脑内感染后，对照病毒显示野生型129（封闭方块）、干扰素-αβ受体缺陷（开放钻石）和干扰素/αβγ受体缺陷（封闭钻石）小鼠的存活率(A类)和Δ34.5(B类). 对照病毒显示野生型129/B6（闭合方块）和PKR缺陷（开放三角形）小鼠的存活率(C类)和Δ34.5病毒(D类). 在两次实验中使用了至少10只小鼠来生成显示的数据。对照病毒和Δ34.5均在17号菌株的背景中。
我们考虑了这样一个假设，即删除其他独立于PKR的依赖IFN的抗病毒途径，可以将毒力恢复到Δ34.5。因此，我们检测了核糖核酸酶L中Δ34.5和对照病毒的毒力−/−小鼠（图。). 控制病毒杀死所有小鼠（RNase L−/−或C57BL/6J野生型）（图。A类). 相反，感染Δ34.5后，所有小鼠均存活（图。B类). 这一结果表明，依赖于ICP34.5的神经毒力不能通过RNase L的缺失来恢复。我们认为进一步的警告是，PKR的缺失可以恢复对缺乏ICP34.5以外基因的弱毒的毒力。为了检验这一警告，PKR−/−野生型小鼠被一种无毒重组病毒感染tk公司（17Δtk）和一种标记拯救的控制病毒（17△tkR）。这两种病毒都在HSV-1 17 syn株的背景中+因此与Δ34.5同基因。注入17ΔtkR后，100%PKR−/−而80%的129/B6小鼠死亡，而注射17Δtk后没有小鼠死亡（图。 C类和D类). 这些数据表明，PKR的缺失不会恢复缺乏与ICP34.5无关基因的病毒的毒力。
脑内感染后野生型、RNase L缺陷型和PKR缺陷型小鼠的存活率。脑内感染后，对照病毒显示野生型C57BL/6（开放三角形）和RNase L缺乏（闭平方）小鼠的存活率(A类)和Δ34.5(B类). 17Δtk显示野生型129/B6（闭合方块）和PKR缺乏（开放三角形）小鼠的存活率(C类)和17ΔtkR病毒(D类). 在两次实验中使用至少10只小鼠来绘制每条曲线。对照病毒Δ34.5、17Δtk和17ΔtkR均在17号菌株的背景中。
最后，我们希望研究是否可以通过使用更生理学的感染途径，通过外周来证明通过PKR缺失将毒力恢复到Δ34.5。对照病毒感染角膜后，野生型或PKR的存活动力学−/−小鼠无法区分，70-90%的小鼠在21天内死亡（图。A类). 相比之下，没有野生型小鼠在感染Δ34.5后死亡，但90%的PKR−/−感染Δ34.5的小鼠在21天内死亡（图。B类). 因此，毒力的恢复与感染途径无关。此外，野生型和PKR存活曲线的相似性−/−感染对照病毒的小鼠表明，ICP34.5是PKR抗病毒作用的高效灭活剂。综上所述，这些数据表明，PKR或IFN受体的缺失，而不是RNase L的缺失，逆转了Δ34.5突变株的弱毒力表型，并且表型恢复是针对缺乏ICP34.5的病毒的。
角膜感染后野生型129和PKR缺陷小鼠的存活率。对照病毒显示野生型129（闭合方形）和PKR缺陷（开放三角形）小鼠的存活率(A类)和Δ34.5(B类). 在两次实验中使用至少10只小鼠来绘制每条曲线。对照病毒和Δ34.5均在17号菌株的背景中。
讨论
我们的结果表明了双重遗传方法的可行性，包括病原体和宿主的突变，以确定疾病的途径和精确的分子靶点。因此，我们提出了未来此类定义的三个一般标准。首先，在缺乏突变病毒基因靶点的宿主中，必须根据生长和毒性恢复特异性突变病毒的衰减。第二，在缺乏独立于上述途径的其他病毒抗性途径的宿主中，不能恢复特异性突变病毒的生长和毒性。第三，与所述病毒无关的基因突变的减毒病毒株必须在被分析的耐药因子缺失的宿主中保持减毒。第二和第三个标准对于证明特异性特别重要。它们确保特定缺陷宿主不会将每一种弱毒病毒恢复到完全毒力，并且该宿主的毒力恢复特定于特定的毒力决定簇。应该注意的是，以前提出了三个证明基因具有免疫调节功能的标准(25). 首先，病毒基因的突变不应影响生长在体外第二，重组病毒的目标回复体应与野生型无表型差异。这一特定标准是病毒遗传学研究的公认标准，在该标准中，对突变病毒进行标记拯救，以确保其表型仅由预期突变引起，而不是由某些次要的意外突变引起。本研究中使用的所有突变病毒均符合这一标准。第三，由于缺乏免疫调节功能而引起的衰减应在不能发挥突变病毒基因靶向抗性的宿主中进行表型补充。因此，我们在此报道的研究补充并显著扩展了这些先前的标准，为确定微生物毒力机制提供了重要的遗传标准体内.
我们加入了控制来解决另外两个重要问题，即病毒株和小鼠株对我们观察到的结果的可能贡献。通过包括在相同背景下构建的减毒突变病毒17Δtk（菌株17syn+)作为研究中的Δ34.5突变体，我们排除了PKR缺失恢复所有17株衍生病毒毒力的可能性。我们还考虑了PKR中生长和毒力恢复到Δ34.5的假设−/−这些小鼠是由于129和B6小鼠株之间的次级宿主基因不同所致。然而，我们观察到，Δ34.5在129、B6和129/B6 F中衰减1杂交，表明没有任何基因或基因组合可以使Δ34.5病毒的生长或毒力正常化。这一发现使我们得出结论，PKR的缺失对ICP34.5突变病毒的减毒表型的恢复特别负责。
以前已经进行了许多研究，试图或通过去除或耗尽这些毒力基因的假定宿主靶点来逆转缺乏某些毒力基因病毒的衰减(25–29). 在其中一项研究中(26)，研究表明，缺乏Fc受体基因的减毒鼠巨细胞病毒株在抗体缺乏的小鼠中没有显示出预期的毒力恢复，这表明需要谨慎体内宿主-病原体相互作用的遗传分析。其他研究已成功显示小鼠巨细胞病毒和HSV-1突变体的毒性恢复，但未达到上述第二和第三标准，因此缺乏有关病毒与宿主因子相互作用特异性的绝对证据(25，27，29). 相反，在一项研究中，通过CD8的缺失，HSV-1 ICP47缺陷病毒（而非糖蛋白E缺陷病毒）的毒力得以恢复，该研究符合所有标准+，但不是CD4+T细胞(28)尽管ICP47可能靶向的特定途径TAP转运体在所用动物中没有突变。在本研究中，我们发现PKR的缺失，而不是RNase L的缺失，逆转了HSV-1 ICP34.5无效突变的衰减表型，恢复了生长和神经毒力。在PKR缺陷小鼠中，无关病毒毒力基因中的无效突变体的生长和毒力没有恢复。这一结果与IFN受体缺陷小鼠的先前结果形成对比，在IFN受体缺陷小鼠中，几个突变体的生长显著增强(13). 因此，PKR的缺失并不能非特异性地恢复所有减毒病毒的毒力。此外，我们证明，宿主中缺乏PKR通路并没有导致控制病毒的复制增强或毒力增强。这表明ICP34.5是PKR抗病毒作用的高效灭活剂。这些数据正式表明PKR途径是ICP34.5的特定靶点体内并验证ICP34.5突变体的衰减机制。
