用Apg5缺乏小鼠胚胎干细胞解剖自噬体形成

大多数细胞内短命蛋白质通过泛素蛋白体途径选择性降解(Hershko和Ciechanover 1998)而大多数长寿命蛋白质在溶酶体中降解。大自噬通常简称为自噬，是一种细胞内的大量降解系统，其中包括细胞器在内的细胞质成分通过膜介导的过程被导向溶酶体/液泡(Seglen和Bohley 1992年;邓恩1994). 细胞质成分首先被称为自噬体的双层或多层膜结构包围。最终，自溶体是由自噬体和溶酶体的外膜融合而产生的。溶酶体水解酶降解自噬体及其内膜的细胞质衍生内容物。自噬受营养素和激素调节，被认为对细胞内环境稳定至关重要(莫蒂莫尔和Pösö1987). 此外，自噬被认为对各种生理过程至关重要，例如细胞重塑(博伦德和威贝尔1973;Masaki等人，1987年)，差异化(Tsukada和Ohsumi 1993年)，生产肺表面活性物质(哈里里等人，2000年)和胚胎发生期间非凋亡细胞死亡(克拉克1990). 自噬缺陷可能与乳腺肿瘤的发病机制有关(Liang等人，1999年)和一种特殊类型的肌病(Nishino等人，2000年;Tanaka等人，2000年).

自噬体被认为来源于被称为隔离膜的帽状池。电子显微镜分析表明，分离膜呈弯曲伸长，最后接近形成直径几乎恒定的自噬体，直径为0.5–1.5μm(Pfeifer 1987年;Seglen和Bohley 1992年). 与其他已知的细胞膜动力学相比，池的发育是一个非常独特的过程。然而，关于杯状隔离膜是如何形成的，我们知之甚少。

在酵母中酿酒酵母，自噬缺陷(自动发电机组和自动装置)分离出突变体(Tsukada和Ohsumi 1993年;Thumm等人，1994年)，其中大多数被认为在自噬体形成方面存在缺陷(Klinsky和Ohsumi 1999). 我们最近发现一种新的蛋白质结合系统对酵母自噬至关重要(水岛等人，1998年a). 两种蛋白质，Apg12和Apg5，以类似于泛素结合系统的方式共价连接。Apg12的COOH末端甘氨酸与Apg5中赖氨酸残基的ε-氨基形成异肽键。这种结合反应需要ATP和两种酶：Apg7和Apg10(Kim等人，1999年;Shintani等人，1999年;Tanida等人，1999年;袁等.1999). 这些发现拓展了泛素样蛋白质结合系统的领域(Hochstrasser 2000年). Apg12-Apg5共轭物进一步与Apg16非共价相互作用(水岛等人，1999年). 分析apg5型空突变体和一个温度敏感突变体表明，Apg5是形成自噬体所必需的(George等人，2000年). 然而，其亚细胞定位和分子功能尚不清楚。

我们还证明了Apg12结合系统在人类中是保守的(水岛等人，1998年b). 在本研究中，为了检测Apg5的作用，我们使用小鼠胚胎干细胞（ES）通过基因靶向方法创建了一个Apg5缺失突变细胞。由此产生的克隆清楚地表明，Apg5对哺乳动物的自噬也是必不可少的。通过产生各种稳定的转化子，我们研究了Apg5的亚细胞定位和功能，以及Apg12对其修饰的作用。这项研究还使我们能够在早期识别隔离膜，并可视化其发育为自噬体。

根据表达的序列标签克隆（mv76e10.r1、me31a04.r1、mj23e09.r1）序列，通过逆转录-PCR获得小鼠Apg5 cDNA。cDNA序列保存在DDBJ/EMBL/GenBank数据库（AB048449）中，该数据库编码275个氨基酸的蛋白质，与人类Apg5的同源性为97%(哈蒙德等人，1998年;水岛等人，1998年b). 鼠标APG5（APG5）以小鼠Apg5 cDNA为探针，从129/Sv基因组文库中分离出基因组克隆。通过用pMCI-neo的新耐药盒替换5.6 kb BamHI-SpeI片段（包括假定的第二个（包含第一个ATG）和第三个外显子）构建靶向载体。将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因插入短臂的下游，针对载体的随机整合进行阴性选择（参见图1). 小鼠Apg5 cDNA也被亚克隆到哺乳动物表达载体pCI-neo（Promega）的SmaI位点。绿色荧光蛋白（GFP）标记的Apg5表达载体已在前面描述(水岛等人，1998年b). 使用快速更换定点突变试剂盒（Stratagene）将Lys130替换为Arg（K130R）。

R1 ES细胞（加拿大多伦多Samuel Lunenfeld研究所Andras Nagy博士慷慨捐赠）培养在丝裂霉素C处理的胚胎成纤维细胞、STO饲养细胞（Lexicon Genetics Inc.）或涂胶培养皿中，培养在完整的ES培养基中：添加20%FCS、2 mM的高糖Dulbecco改良Eagle培养基我-谷氨酰胺、1×非必需氨基酸（GIBCO BRL）、1μM 2-巯基乙醇、抗生素和1000 U/ml白血病抑制因子（Life Technologies，Inc.）。对于氨基酸饥饿，细胞在含有10 mM Hepes，pH 7.5（不含氨基酸和FCS）的Hanks溶液中培养。

将线性化靶向载体（30μg）转染到10⁷使用基因脉冲器（Bio-Rad实验室）在270 V和500μF下电穿孔R1 ES细胞。对0.25 mg/ml G418-和更昔洛韦选择的克隆（96个克隆）进行了检测，并在13个克隆中检测到同源重组。这些克隆还通过新探针的Southern blot分析进行了单整合测试。为了获得APG5（APG5）⁻/−单元格，一个APG5（APG5）^+/−克隆（#33）在含有8 mg/ml G418的ES培养基中生长。在123个克隆中，有3个是APG5（APG5）⁻/−（A11、B19、B22）。为了获得稳定的转化体，8×10⁶ES细胞用20μg圆形或线性表达载体电穿孔，必要时用2μg pPGKpurobpA电穿孔。在存在0.5–1 mg/ml G418或5–10μg/ml嘌呤霉素的情况下选择细胞。

用EcoRI消化基因组DNA，并按照前面所述进行Southern blot(Hatano等人，1997年). 中显示的1-kb探针图1用引物Pro1（5′-CAATGCTTAATTTCAACC-3′）和Pro2（5′-AGGCTACTTGGCAGTATC-3′）对地高辛进行PCR标记。

通过家兔免疫制备抗谷胱甘肽-S-转移酶融合人Apg5的抗Apg5抗体（SO4），并进行亲和纯化。针对与NH对应的合成肽的抗小鼠Apg12抗体（NM2）₂-如前所述，通过兔子免疫制备小鼠Apg12的14末端氨基酸和一个额外的Cys（MSEDSEVVLQLPSAC(Yoshimori等人，2000年)并进行亲和纯化。抗重组LC3的抗LC3抗体(Kabeya等人，2000年)，抗大鼠Lgp85抗体(Okazaki等人，1992年)和抗大鼠醛缩酶抗体(Kominami等人，1983年)之前已经描述过。免疫荧光显微镜使用荧光键Cy5标记的山羊抗兔IgG抗体（Amersham Pharmacia Biotech）。兔抗GFP多克隆抗体（CLONTECH Laboratories，Inc.）用于免疫电子显微镜。

用裂解缓冲液（2%NP-40，0.2%十二烷基硫酸钠，添加蛋白酶抑制剂的PBS）制备全细胞裂解产物。如前所述进行蛋白质印迹(水岛等人，1998年b).

如前所述进行常规电子显微镜检查(Yoshimori等人，2000年)除了在涂胶塑料盖玻片上生长的ES细胞外，将2.5%的戊二醛放在pH 7.4的0.1M二羧酸缓冲液中，放置2h。

对于免疫电子显微镜，如前所述执行预包埋银增强免疫金方法(Yoshimori等人，2000年)，稍作修改。将培养在涂有明胶的塑料盖玻片上的ES细胞固定在4%多聚甲醛中的0.1 M二羧酸缓冲液（pH 7.4）中2 h。将细胞在缓冲液中清洗三次，浸在含有15%甘油和35%蔗糖的磷酸盐缓冲液（PB）中，用液氮冷冻和解冻，然后在含有0.005%皂苷的PB中培养，10%牛血清白蛋白、10%正常山羊血清和0.1%冷水鱼皮明胶封闭30分钟。然后用兔抗GFP IgG（稀释500倍）在封闭溶液中处理细胞过夜。然后，将细胞在含有0.005%皂苷的PB中洗涤6次，每次10分钟，并与与胶体金（直径1.4纳米）结合的山羊抗兔IgG在封闭溶液中孵育2小时。细胞用PB洗涤6次10分钟，用1%戊二醛在PB中固定10分钟。洗涤后，使用银增强试剂盒在20°C的黑暗中增强金标记6分钟。在蒸馏水中洗涤后，将细胞固定在0.5%OsO中₄在4°C下保持90 min，在蒸馏水中清洗，用50%乙醇培养10 min，用2%乙酸铀酰在70%乙醇中染色2 h。用梯度系列乙醇进一步脱水细胞并嵌入环氧树脂中。超薄切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅双重染色。

用NIH图像软件进行形态计量分析。对30个细胞切片进行了分析。自噬体被定义为围绕未消化细胞质成分的双层或多层膜结构。自溶体被定义为在不同降解阶段含有细胞质成分的单膜结构。

根据标准方法测量长寿命蛋白质的降解(Ogier-Denis等人，1996年). ES细胞保存在涂胶板上，无饲养细胞，以2×10电镀⁵细胞/孔置于涂胶的24孔板中，并在完整的ES培养基中培养24小时。然后用含有1.5μCi/ml的相同培养基标记细胞24小时我-[¹⁴C] 缬氨酸（莫拉维克生物化学公司）。用PBS冲洗三次后，将细胞培养在完整的ES培养基或含有0.1%BSA和10 mM冷缬氨酸的Hanks溶液中。需要时，1 mM氯喹，0.1μM巴非霉素A₁或加入10mM 3-甲基腺嘌呤（3-MA）。培养1小时后，将培养基替换为相同的新鲜培养基，再培养2小时。将培养基沉淀在10%的TCA中，并测量TCA可溶性放射性。用0.1 M NaOH溶解后测量细胞总放射性。[¹⁴C] 缬氨酸释放量计算为TCA可溶性上清液中的放射性占总细胞放射性的百分比。

将涂胶盖玻片上生长的ES细胞固定，必要时用亲和纯化的抗小鼠Apg12抗体（200倍稀释）或抗LC3抗体（200×稀释）染色，然后在荧光激光扫描共聚焦显微镜LSM510（卡尔蔡司公司）下进行检查，如前所述(Yoshimori等人，2000年). 使用配备ΔTC3培养皿系统（Bioptechs）用于温度控制的DeltaVision显微镜系统（Applied Precision Inc.）在37°C下进行时间推移视频显微镜检查。

提供了一个补充图，其中亚细胞分馏分析表明大多数Apg12-Apg5结合物在细胞溶质部分中得到恢复（图S1）。QuickTime电影中的图像图7也可以使用A。APG5（APG5）⁻/−表达GFP-Apg5的细胞(视频1–3)或GFP-Apg5K130R(视频4)在Hanks的溶液中培养1小时，每3.8秒拍摄一次GFP图像。它们以15张图像/秒的速度进行动画制作。可以找到在线补充材料。

在小鼠中产生空突变APG5（APG5）基因，我们瞄准了老鼠APG5（APG5）R1 ES细胞的基因，使用如所示的靶向载体图1A.通过接受APG5（APG5）^+/−ES克隆（#33）在高浓度G418下生长选择，三个Apg5缺陷(APG5（APG5）⁻/−)获得了克隆（A11、B19和B22）(图1B） ●●●●。抗Apg5抗体识别野生型ES细胞中的56-kD蛋白(图1C） 。此外，在30 kD处观察到一条非常微弱的带，对应于Apg5单体。56kD条带也与抗小鼠Apg12抗体反应（数据未显示）。这些数据表明，在野生型ES细胞中，Apg5几乎完全以Apg12缀合的形式存在。杂合子中Apg12-Apg5结合物的数量减少(APG5（APG5）^+/−）突变，在三个独立的APG5（APG5）⁻/−克隆(图1C） 。综上所述，这些数据证实了靶向ES细胞在APG5（APG5）基因。

然后，我们用Apg5 cDNA转染A11细胞，生成了几个稳定的转化子(图1D） ●●●●。在两个含有野生型Apg5 cDNA的转化子（WT1和WT13）中，外源性Apg5的表达略弱于野生型细胞，几乎完全与Apg12结合。Apg5^K130R型突变体无法结合（KR27），证实了我们之前的观察结果，即Lys130是Apg12结合的受体残基(水岛等人，1998年b). GFP融合的Apg5以与野生型细胞相似的水平表达（GFP24），其中大部分与Apg12缀合。

APG5（APG5）⁻/−发现细胞生长速度与野生型细胞相同，并形成形态正常的集落（数据未显示）。从三岁开始APG5（APG5）⁻/−克隆（A11、B19和B22）表现出相似的表型，除非另有说明，否则我们使用A11进行进一步研究。

氨基酸饥饿可以很好地诱导野生型ES细胞的自噬(图2A） 作为其他培养细胞。氨基酸戒断后2h，自噬空泡占细胞质总量的～1.1%(图2E） ●●●●。自溶体的出现频率高于自噬体（自噬体0.33%，自溶体0.77%）。相反，在APG5（APG5）⁻/−细胞，即使在氨基酸饥饿的条件下(图2B和图E). 饥饿诱导了一些自噬体样结构(图2C和图D)，但这些结构的数量明显少于野生型细胞中的自噬体(图2E） ●●●●。其他细胞器，如线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体和多泡体，均正常。这些结果表明APG5（APG5）⁻/−细胞自噬降解不发生，自噬体形成受损。

自噬被认为是细胞质蛋白降解的主要途径。我们通过测量TCA可溶性的释放来评估长寿命蛋白质的整体降解[¹⁴C] 细胞中的缬氨酸。溶酶体蛋白降解是通过[¹⁴C] 用和不用溶酶试剂如氯喹和巴非霉素A处理的细胞释放缬氨酸₁，真空H⁺-ATP酶抑制剂。氨基酸饥饿诱导的溶酶体蛋白降解APG5（APG5）⁻/−细胞数量明显减少到APG5（APG5）^+/+和APG5（APG5）^+/−电池(图3A和图B). Apg5 cDNA转化子（WT1、WT13和GFP24）恢复了蛋白质降解，证实了Apg5缺陷的特异性(图3B） ●●●●。在富含营养的培养基中生长的细胞显示出非常低的基础溶酶体降解水平APG5（APG5）^+/+和APG5（APG5）⁻/−细胞。这些数据表明，自噬确实是溶酶体蛋白降解的主要途径。此外，在KR27克隆中，蛋白质降解没有恢复，这表明Apg5的Apg12结合对自噬降解至关重要。

3-MA，一种常用的自噬隔离抑制剂(Seglen和Gordon 1982年)在氨基酸缺乏期间，减少体积降解比破坏APG5（APG5）基因(图3A） ●●●●。此外，在自噬阴性中仍观察到3-MA的作用APG5（APG5）⁻/−这表明3-MA可能对蛋白质降解有一些除自噬以外的其他作用。

自从电子显微镜分析APG5（APG5）⁻/−细胞提示Apg5在自噬体形成的早期阶段发挥作用，我们检测了Apg5的亚细胞分布在野生型ES细胞中。Apg12-Apg5结合物主要在细胞溶质部分中回收，在膜部分中发现了很小的一部分（参见在线补遗中的图S1）。氨基酸饥饿后，Apg12-Apg5结合物的总量和亚细胞分布没有显著变化。

我们进一步通过共焦显微镜检查了Apg5的定位。散装蛋白质降解(图3B） 和自溶体形成（参见图6)在GFP24克隆中恢复，表明GFP-fused Apg5（GFP-Apg5）具有功能，并且可以通过观察GFP信号来指示Apg5的生理定位。在营养丰富的条件下，发现大多数GFP-Apg5均匀分布在细胞质中，很少有斑点(图4，0分钟）。用无氨基酸培养基替换培养基30分钟后，点状结构数量增加，持续时间分别为60和120分钟。这些GFP-Apg5点状斑点与抗Apg12抗体染色重叠，表明这些结构上的GFP-Apg 5与Apg12结合(图5A） ●●●●。3-MA和沃特曼宁（一种磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂，已知可抑制自噬）抑制了氨基酸剥夺过程中GFP-Apg5点的诱导(图4).APG5（APG5）^+/+仅稳定表达GFP的细胞仅显示细胞质染色（数据未显示）。

接下来，我们对内源性LC3进行复染，以用作自噬体的特异性标记物。LC3是Aut7/Apg8的哺乳动物同源物(Lang等人，1998年;Kirisako等人，1999年)并且是唯一被鉴定为定位于自噬体膜和胞质溶胶的哺乳动物蛋白质(Kabeya等人，2000年). 在完全培养基中生长的细胞中，LC3被染色为细胞质模式，细胞质中有非常精细的点状结构(图5B） ，如前所述(Kabeya等人，2000年). 氨基酸饥饿诱导LC3大点染色，这可能代表自噬空泡(图5C） 。在饥饿的细胞中，GFP-Apg5与LC3结构很好地共定位(图5，C–G），尽管一些GFP-Apg5斑点对于LC3染色非常微弱(图5F和图G，箭头）。另一方面，有许多LC3染色阳性但GFP-Apg5染色阴性的斑点。Apg5与部分LC3的共定位表明，Apg12-Apg5靶向自噬途径中的某些限制性结构。

为了更详细地检查Apg5的定位，我们使用抗GFP抗体进行了免疫电子显微镜检查。在非保存条件下，银增强金颗粒主要表现为细胞质分布（数据未显示）。在遭受2小时饥饿期的细胞中，发现金颗粒与隔离膜密切相关(图6A，图B、和图G). 它们的分布是不对称的；大多数金颗粒位于隔离膜的外侧，少数位于内膜上。与隔离膜相比，在自噬体和自溶体膜上几乎没有检测到GFP-Apg5信号(图6、A–C、I和J）。Apg5与接近完成循环的隔离膜相关(图6H） 表明Apg12-Apg5在自噬体形成完成之前或之后立即从膜上分离。

除了典型的隔离膜外，还有一些较小的结构，它们被金颗粒标记(图6B和图C、双箭头以及E和F）。这些单膜结合的隔室呈新月形，由氨基酸饥饿引起。偶尔在这些隔间内观察到小水泡。弯曲形态表明，这些结构代表了隔离膜发展的早期阶段。

为了确定隔离膜是否来自新生成的、与Apg5相关的小隔间，我们进行了延时视频显微镜检查。GFP-Apg5的小点出现并缓慢拉长，然后弯曲并形成半球形结构(图7A和视频1–3). 最后，当结构接近形成完整的球体时，GFP信号消失。这种发展模式与电子显微镜图像一致(图6，E–J）。延时显微镜显示GFP-Apg5斑点是短暂的，在氨基酸饥饿期间随机出现，循环前后立即消失，从未形成任何稳定的结构(图7B） ●●●●。GFP-Apg5结构的平均寿命为9.7±1.8分钟。

为了研究Apg5的Apg12共轭作用，我们生成了一个APG5（APG5）⁻/−表达GFP-Apg5的克隆^K130R型（GKR-1）。Western blot分析证实GFP-Apg5^K130R型未与Apg12结合（数据未显示）。在缺乏氨基酸的GKR-1细胞中，观察到大量点状GFP信号(图5H） 。GFP-Apg5^130克点的数量略有增加，大约是饥饿野生型（GFP24）细胞的两倍。Apg12未被招募到GFP-Apg5^K130R型点（未显示数据）。免疫电子显微镜显示生成新月形隔室，GFP-Apg5^K130R型本地化的(图6D） ●●●●。这些结果清楚地表明，Apg5的膜结合不需要Apg12偶联。然而，在饥饿的GKR-1细胞中未检测到自溶体。时间推移视频显微镜显示GFP-Apg5^K130R型-相关斑点未发育成杯状结构，基本上仍为点状斑点(图7A和视频4). 这些结果表明，Apg12结合是Apg5参与膜伸长形成杯状隔离膜和自噬体所必需的。这与KR27细胞中整体蛋白降解未恢复的数据一致(图3B） ●●●●。

我们在缺乏氨基酸的情况下观察到一些自噬体样结构APG5（APG5）⁻/−单元格(图2). 因此，我们确定LC3是否正常定位于这些膜。在缺乏氨基酸的野生型ES细胞中，在自噬体的内外膜上都观察到LC3染色(图8A和图B)和隔离膜（C）以及胞浆中。然而，在自噬体样结构上未检测到LC3染色APG5（APG5）⁻/−单元格(图8D和图E). 在免疫荧光显微镜下，在饥饿的小鼠中没有观察到LC3染色的大点APG5（APG5）⁻/负极单元格（未显示数据），与野生型单元格相反(图5C） 。我们还检测了LC3在GKR-1克隆中的定位。而GFP-Apg5^K130R型如上所述，LC3定位于点状斑点，与GFP-Apg5没有共定位^K130R型饥饿期间斑点和保持其细胞质染色(图5H） 。综上所述，这些结果表明，Apg5及其与Apg12的修饰在LC3向隔离膜的补充中起着重要作用。

我们之前已经证明，LC3经过翻译后修改以生成LC3-I，然后生成LC3-II。自噬液泡上的LC3为LC3-II型，而LC3-I为细胞溶质(Kabeya等人，2000年). 在缺乏氨基酸的ES细胞中，产生了大量LC3-II。然而，在中未检测到LC3-IIAPG5（APG5）^−/−电池(图8F） ●●●●。在含有野生型Apg5 cDNA的稳定转化子中，LC3-II的生成得到了恢复，但不含Apg5^K130R型突变体。这些生化数据证实，如果没有Apg12-Apg5，LC3就不能靶向细胞膜。

我们已经从基因上剖析了酵母的自噬过程，现在对这个过程有了更好的了解。然而，许多问题仍有待解决。隔离膜是如何形成的是一个重要但却鲜为人知的课题。在本研究中，我们证明了杯状隔离膜是由新月形的小膜室发展而来的，使用Apg5作为小鼠细胞中的标记分子。连续切片显示，新月形结构不是成熟隔离膜的组成部分（数据未显示）。除非用GFP-Apg5标记，否则这些结构从未被识别，但它们很可能是自噬体的直接前体，因为它们已成熟为杯状结构(图7). 我们首次能够实时可视化自噬体的形成。结果直接证明了隔离膜的伸长模型，该模型是迄今为止基于电子显微镜观察所假设的。视频显微镜分析清楚地表明，池膜伸长、弯曲并形成球形自噬体，这是细胞内一种非常独特的膜运动。这种膜动力学的分子机制令人感兴趣，对膜上Apg蛋白的研究将为我们提供进一步的见解。

自噬体前体的存在早在Seglen 1987年和Fengsrud等人，1995年他们通过常规电子显微镜在分离的肝细胞中观察到厚厚的嗜锇膜多层，并假设它们是自噬体前体。这些被称为吞噬细胞的结构在某些方面与Apg5相关的隔室在形态学上不同。然而，这两种结构可能在本质上是相同的，由于不同的固定方法和不同的细胞类型而存在差异。我们的直接证据表明，隔离膜是从小隔间中成熟的，而不是简单地从先前存在的大隔间中衍生出来的，尽管我们目前不知道小隔间是从头形成的还是从某些膜源衍生而来的。通过使用Apg5作为自噬体前体的标记物，许多关于自噬小体形成的问题将得到澄清。例如，我们的研究结果表明，磷脂酰肌醇3-激酶活性是产生Apg5相关小隔间所必需的，而不是其成熟为自噬体(图4). 这些隔室的分离和表征将为自噬体膜的起源提供证据，而自噬体膜一直是争论的主题(Hirsimäki和Reunanen 1980年;邓恩1990;Yamamoto等人，1990年;上野等人，1991年).

在隔离膜的开发过程中，Apg5的分布模式变得非常独特。大多数Apg5与隔离膜的外侧有关(图6)与LC3的对称分布相反(图8). 先前的冷冻复性超微结构分析指出了自噬体外膜和内膜之间的差异(Réz and Meldolesi 1980年;Hirsimäki等人，1982年;Baba等人，1995年). 内膜几乎没有膜内颗粒，而外膜有少量但显著的颗粒。Apg5的独特分布首次证明了两种膜的分子组成不同。它进一步表明，这种分子不对称性在自噬体形成完成之前就已经产生了。在自噬体形成之前或之后，Apg5必须立即从膜上分离，因为在自噬体和自溶体上几乎没有检测到Apg5(图9A） ●●●●。

基于Apg5的定位，我们假设Apg5在隔离膜的发育过程中起作用。Apg5缺失突变细胞的表型支持了这一假设：隔离膜和自噬体的数量减少，很少观察到的隔离膜和自噬体样结构没有用LC3标记。我们还通过生成只表达共轭缺陷型Apg5的稳定克隆来检测Apg12共轭的作用^K130R型一些泛素类修饰系统影响底物蛋白的细胞内定位。例如，蛋白质泛素化伴随着蛋白酶体靶向或内吞(Hershko和Ciechanover 1998). Ran-GAP1的SUMO-1修饰使其成为核孔复合体(Hochstrasser 2000年). 然而，我们的数据表明，Apg5的膜结合不需要Apg12。相反，Apg5的Apg12偶联是膜形态动态变化所必需的。我们得出的结论是，Apg5通过与Apg12形成共轭物，引导隔离膜从新月形小室中伸长(图9B） ●●●●。Apg5如何参与膜伸长尚不清楚，但至少有两种可能性。首先，Apg12-Apg5将膜或脂质从某处运输到隔离膜。其次，Apg12-Apg5与膜的结合调节额外膜的获得。在本研究中，我们发现细胞溶质LC3以Apg12-Apg5依赖性的方式靶向隔离膜(图9B） ●●●●。因此，膜伸长与LC3向膜的补充有关。Apg12-Apg5和LC3之间是否存在直接相互作用尚不清楚；迄今为止，这些分子的共免疫沉淀尚未成功（数据未显示）。

这项研究为我们提供了第一个具有遗传损伤自噬活性的哺乳动物克隆。虽然偶尔在APG5（APG5）⁻/负极细胞，LC3染色显示它们不是正常的自噬体，这表明自噬体形成受损导致自噬途径完全阻断。根据中的数据图3，自噬将占饥饿诱导ES细胞溶酶体蛋白降解的～60-70%。溶酶体降解仍然明显地因饥饿而加剧APG5（APG5）⁻/−细胞。对此负责的过程未知。到目前为止，除了宏自噬之外，至少有两种途径被提出用于将细胞质成分输送到溶酶体。一种是微自噬，通过溶酶体膜内陷将细胞质的一小部分隔离在溶酶体中(Marzella和Glaumann 1987). 另一种是伴侣介导的自噬，由骰子1990尽管仍有待确定，但这些途径可能解释了APG5（APG5）⁻/−细胞。无论如何，这个克隆将有助于研究哺乳动物自噬的生理意义，这将比单细胞真核生物更复杂。

总之，我们的研究表明，Apg12-Apg5定位于自噬体前体，并与LC3协同在自噬体内发挥重要作用。Apg5缺失突变细胞的建立不仅证明了Apg5的不可或缺的作用，还为我们提供了新的见解，使我们了解了自20世纪60年代发现自噬以来，酵母和哺乳动物对自噬体形成的早期阶段了解甚少。

我们感谢M.Kadowaki博士对蛋白质降解试验的有益讨论和建议，感谢A.Bradley博士捐赠pPGKpurobp1质粒。我们还感谢田中Y.Tanaka博士、Himeno M.和Kominami E.博士捐赠抗体，感谢冈本S.Okamoto博士制备抗体。

这项工作得到了日本教育、科学、文化和体育部科学研究补助金的部分支持。