嗜肺军团菌复制液泡成熟为酸性内分泌器官

巨噬细胞培养。

如前所述，准备A/J小鼠（杰克逊实验室）骨髓衍生巨噬细胞培养物8.

显微镜。

2.0 × 10⁵每个12毫米玻璃盖玻片的巨噬细胞在37°C下感染1小时L（左）.嗜肺菌在含有10%热灭活FCS（RPMI/FCS）的RPMI 1640中，感染倍数（MOI）为0.5，在培养基中洗涤三次，然后培养至含有100μg/ml胸腺嘧啶核苷的RPMI/FCC中所示的时间。为了分析内吞体酸化的作用，巨噬细胞被感染1小时L（左）.嗜肺菌，在RPMI/FCS中洗涤三次，然后在含有25 nM巴非霉素A1（BFA；Calbiochem）的培养基中培养指定时间。细胞在含有5%蔗糖的周期性赖氨酸-甲醛中固定0.5小时8，在含有5%蔗糖的PBS中清洗一次，然后用每毫升PBS中1 mg Zwittergent（Roche）渗透1分钟。为了减少抗体的非特异性结合，使用含有5%蔗糖和2%山羊血清的PBS预培养细胞并进行抗体稀释，如下所示：兔抗–L（左）.嗜肺菌（马萨诸塞州波士顿霍华德·休斯医学院和塔夫茨大学医学院拉尔夫·伊斯伯格博士赠送的礼物），1:1000；大鼠抗溶酶体相关膜蛋白1（LAMP-1）（1D4B；发育杂交瘤库），1:100；兔抗组织蛋白酶D（日本山梨医科大学横田佐木博士赠送），1:100；兔抗胰蛋白酶D23, 1:20; 和大鼠抗BiP（密歇根州安阿伯市密歇根大学David Bole赠送），1:200；所有荧光二级抗体（分子探针）稀释为1:2000。将细胞与抗体在37°C下孵育1小时，然后在含有5%蔗糖的PBS中洗涤三次。L（左）.嗜肺菌被抗-L（左）.嗜肺性抗体或0.1μM的核酸染料4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；分子探针）。

使用配备100×Plan-Neofluar物镜、数值孔径1.3、过滤器487901、487910和487900的蔡司Axioplan 2表观荧光显微镜分析样品。50个液泡含有L（左）.嗜肺菌每个盖玻片都有记分，每个细胞的液泡数不超过三个。当管腔内检测到荧光时，液泡的可溶性标记物为阳性。对于膜标记物，只有在液泡周围观察到完整的荧光环时，液泡才被定义为阳性；这个严格的标准可能低估了含有LAMP-1的液泡的比例。由于每个液泡中超过20个细菌无法准确计数，因此得分为>20。然而，它们的大小表明成熟的液泡能容纳50多个细菌。

获取胞内物质。

为了荧光标记溶酶体，巨噬细胞与100μg德克萨斯红卵清蛋白（TR-OV）或德克萨斯红右旋糖酐（TR-DEX）培养0.5小时，每毫升RPMI/FCS 10 kD（分子探针），清洗，在未标记培养基中培养0.5小时后感染L（左）.嗜肺菌MOI为0.5。对于脉冲追踪实验，感染巨噬细胞与250μg/ml TR-OV孵育15分钟，未标记RPMI/FCS孵育5–120分钟，然后固定、渗透、DAPI染色，并如上所述进行评分。

pH值测量。

为了测定6小时以下吞噬体的pH值，首先用比例荧光团对细菌进行表面标记。要么L（左）.嗜肺菌或E类.大肠杆菌在PBS中清洗一次，用1mg NHS-羧基荧光素/ml PBS（pH 8）标记，在4°C下持续0.5 h，然后在RPMI/FCS中清洗三次。培养在25毫米盖玻片上的巨噬细胞感染了L（左）.嗜肺菌在MOI为0.5且E类.大肠杆菌MOI为2时，持续1-2小时。根据菌落形成情况，表面标记不会影响细菌的生存能力，只会受到轻微影响L（左）.嗜肺菌贩运：感染后2小时，平均有20%的标记细菌与溶酶体融合，而对照细菌只有10%。

还测量了可通过内胚体途径进入的病原体液泡的pH值。巨噬细胞被感染L（左）.嗜肺菌在0.5的MOI下培养1小时，清洗，然后培养指定的时间。在每个终点前2 h，巨噬细胞用荧光素葡聚糖，10 kD（分子探针）以200μg/ml孵育0.5 h，然后在未标记的RPMI/FCS中孵育1.5 h。为了测试巨噬细胞质子ATP酶活性是否影响空泡pH值，在终点前用1μM BFA处理巨噬细胞1小时。为了标记细胞内细菌，在终点之前将DAPI添加到0.3μM中30–45分钟。DAPI不影响空泡pH值：含有L（左）.嗜肺性荧光素标记的表面与荧光素和DAPI标记细菌的pH值相似。

真空pH值是通过Tsang等人的方法测量的。24使用Metamorph软件（Universal Imaging Corp.）。用37°C Ringers缓冲液（155 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl）清洗感染的巨噬细胞两次₂，1 mM氯化镁₂，2 mM NaH₂人事军官₄10 mM Hepes和10 mM葡萄糖，pH值7.2），安装在37°C的盖玻片支架上，并在带有Quantix Photometrics相机（普林斯顿仪器公司）的尼康日食TE300显微镜上进行可视化。含有L（左）.嗜肺菌在405-nm激发（450-nm发射）下通过DAPI荧光进行鉴定，然后在440-和485-nm激发下收集获得右旋糖酐的病原体液泡图像（520-nm辐射）。屏蔽DAPI图像以定义细菌像素区域，并记录440 nm和485 nm图像中相应像素的平均灰度区域。每个液泡的pH值计算为485-nm强度（pH敏感）与440-nm强度（pH不敏感）的比值。按照Beauregard等人的描述，使用经黑精和等渗钾缓冲液处理的细胞，对每个实验中的单个荧光粒子进行原位校准。25年轻吞噬体通过掩蔽440-nm图像进行分析，然后按上述方法计算比率。作为对照，如上所述用荧光素右旋糖酐标记未感染巨噬细胞的溶酶体，掩盖440-nm图像，然后如上所述计算现场所有囊泡的比率。

细胞内嗜肺L.的存活率。

构建质粒pMMB-GRN，通过L（左）.嗜肺菌可由异丙基硫代-β诱导-d日-吡喃半乳糖苷（IPTG；Sigma）。pGFPmut3的SmaI–HindIII片段26编码GFP的基因与P连接3′_战术通信pMMB-Gent的启动子，赋予庆大霉素耐药性13.消除其对L（左）.嗜肺菌复制27,mobA公司和暴徒B通过用AgeI消化pMMB-GRN，然后进行分子内连接来删除。pMMB-GRN转移至L（左）.嗜肺菌通过电穿孔和在含有10μg/ml庆大霉素的CYET板上进行选择。肉汤培养物分析表明，在IPTG处理4小时或大约两个世代后，可以检测到GFP的表达（数据未显示）。

为了评估GFP的表达，感染的巨噬细胞在2 mM IPTG中培养1.5小时，在TR-OV和IPTG内培养0.5小时，然后在含有IPTG的未标记RPMI/FCS中培养2小时。固定和DAPI染色后，对空泡内的TR-OV和GFP荧光进行评分。或者，巨噬细胞感染1 h，清洗，再培养13–17 h，用2 mM IPTG处理4 h，然后按照上述方法对其LAMP-1进行染色。

细胞内生长。

10⁵48个组织培养皿的每孔巨噬细胞感染1小时L（左）.嗜肺性MOI为0.5，用RPMI/FCS清洗三次，然后在含有或不含25 nM BFA（Calbiochem）的培养基中培养指定时间。为了量化每个孔的CFU，收集培养上清液，在含有0.05%皂苷（PBS/皂苷）的冷冻PBS中研磨单层，然后在CYET琼脂上培养4份10倍稀释液的等分上清液和裂解液3-4天。

用50或500 nM BFA处理24小时对L（左）.嗜肺菌根据其未能抑制细菌复制、运动或毒性来判断（数据未显示）。为了确保巨噬细胞是活的，并且其内吞网络不会被BFA不可逆转地改变，在感染前用25 nM BFA处理吞噬细胞24小时，在无药物的培养基中培养0.5小时，然后让吞噬细胞每毫升RPMI/FCS内吞100μg TR-OV 0.5小时。巨噬细胞吞噬后L（左）.嗜肺菌，如上所述，定量每个孔的CFU和细菌液泡中内吞探针的积累。几乎100%的吞噬细胞内吞TR-OV，但在L（左）.嗜肺菌观察摄取情况。然而，细胞内L（左）.嗜肺菌复制过程与未经处理的巨噬细胞相同，特征是在感染后期与内吞网络融合，24小时内CFU增加10-20倍（数据未显示）。

要确定每个液泡中的细菌密度（参见图4)，巨噬细胞感染1 h，然后在指定的时间内用或不用25 mM BFA孵育。固定后，如上所述对与LAMP-1共定位和每个液泡的细菌数量进行评分。

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图4

含有LAMP-1（黑条）或缺乏LAMP-1的液泡中的细菌密度（白条）。（A） 固定并处理指定时期感染的巨噬细胞，以进行LAMP-1和L（左）.嗜肺菌在指定的时间，对液泡中LAMP-1的存在和细菌数量进行评分。由于不可能在一个隔间中准确计数>20个细菌，因此评分>20。（B） 感染1小时后，用质子ATP酶抑制剂BFA处理巨噬细胞，培养指定时间，然后如上所述进行处理。在三个独立实验中的每一个实验中，在指定的时间对每种情况下的50个液泡进行了分析。为A分析的液泡数量与图1B类；分析B的液泡数量与图7.

嗜肺乳杆菌液泡是酸性的。

要评估L（左）.嗜肺菌通过一种独立的方法进行吞噬体成熟，我们将其pH值与传统吞噬溶酶体的pH值进行了比较。与Horwitz和Maxfield的结果类似2，含有NHS-羧基荧光素活性的3-6小时吞噬体-标记L（左）.嗜肺菌保持中性pH值（平均pH值7.4），而液泡具有类似的标记E类.大肠杆菌或热处理L（左）.嗜肺菌酸性pH值分别为5.5和5.6(表). 其次，成熟的pH值L（左）.嗜肺菌测量与内体通路融合的空泡。为此，感染的巨噬细胞被允许内吞荧光素-dextran，这一过程标记了近50%的成熟巨噬细胞L（左）.嗜肺菌液泡(图2); 剩余的细菌液泡无法评估。在感染后16至20小时，大多数荧光素提取物L（左）.嗜肺菌液泡呈酸性，平均pH值为～5.6，与未感染巨噬细胞溶酶体小泡的pH值相当(表).

溶酶体被质子ATP酶酸化33.确定是否酸化成熟L（左）.嗜肺菌空泡需要质子ATP酶，感染的巨噬细胞被一种特定的活性抑制剂BFA孵育34.经过1小时的处理，成熟L（左）.嗜肺性液泡的pH值为～7.3；同样，BFA处理后，未感染巨噬细胞中溶酶体小泡的pH值为7.4(表). 因此，巨噬细胞质子ATP酶活性是酸化成熟细胞所必需的L（左）.嗜肺菌液泡。

我们感谢Brenda Byrne的技术援助，感谢Albert Tsang和Ken Christianson的视频显微镜援助，感谢Tom Zahrt、Joe Vogel和Amrita Joshi批判性地审阅了这份手稿。非常感谢Joel Swanson使用他的视频设备，以及在编写这份手稿时提出的深思熟虑的意见。

这些研究得到了美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所的支持，拨款R29 A140694-01BM。S.Sturgill Koszycki是密歇根大学微生物病原体分子机制培训项目的博士后，拨款T32AI07528。