自噬体的形成需要特定的早期Sec蛋白，液泡融合需要NSF/SNARE

亚细胞分离和蛋白酶K处理

如前所述制备细胞裂解物(哈丁等。, 1995)，稍作修改。电池（外径200₆₀₀U） 在YPD培养基（OD）中培养₆₀₀=1）或SD（-N）中等（OD₆₀₀=2）收获，用100 mM Tris-HCl（pH 9.0，40 mM 2-巯基乙醇）洗涤，并在添加有1 M山梨糖醇和20 mM Tris-HCl（PH7.5）的10 ml YPD中重新悬浮，用于生长细胞，或在添加了1 M山梨醇和20 M M Tris-HCl（pH 7.5）的SD（-N）中悬浮，用于饥饿细胞。在添加1 mg酶100T后，轻轻摇晃细胞悬浮液30 min。收获球状体，用1 M山梨醇洗涤，在30 OD下重新悬浮₆₀₀/ml放在裂解缓冲液（20 mM 1,4-哌嗪二乙基磺酸（PIPES）-KOH，pH 6.8，200 mM山梨醇，1 mM苯甲基磺酰氟[PMSF]和蛋白酶抑制剂鸡尾酒）中，并在冰上培养5分钟。在500×克5分钟。以13000×克分离颗粒（LSP）15分钟，上清液再次以100000×克持续1小时以生成颗粒（HSP）和上清液（HSS）。将LSP和HSP各自重悬于体积等于原始裂解物的裂解缓冲液中。用于轻度细胞溶解（图​（图2B），2B） 细胞在1.4 M山梨醇、20 mM Tris-HCl、pH 7.5和SD（-N）中转化为球形体，并在含有1 M山梨糖醇、0.5%Ficoll 400和1 mM MgCl的裂解缓冲液中重新悬浮₂在这些条件下，大多数细胞没有被溶解。球体悬浮液通过带有3-μm孔的聚碳酸酯过滤器（Nucleopore，Whatman，Maidstone，United Kingdom），在500×克5分钟以清除细胞碎片，并按上述方法分馏。

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图2

自噬体在第18秒和vti1型突变体。（A） 自噬体和Cvt囊泡的分离。Δ埃及7细胞在YPD中生长或Δ埃及7单元格和Δypt7Δapg7在SD（-N）中饥饿的细胞转化为球形体并裂解。在500×克5分钟，然后在13000×克持续15分钟以生成LSP。上清液以100000×克分离HSP和HSS 1小时。用100μg/ml蛋白酶K（PK）处理每个组分，加入或不加入1%Triton X-100（TX），然后用API抗血清进行免疫印迹分析。（B） 自噬体的生化检测第18秒和vti1-11型.Δ埃及7和Δypt7Δapg7细胞在37°C下培养第18秒和vti1-11型在23或37°C的SD（-N）中培养3 h。按照材料和方法中的描述，在较温和的条件下进行细胞裂解、亚细胞分离和蛋白酶处理。每个样品都进行SDS-PAGE和抗API血清免疫印迹。指出了API的前体（pro）和成熟形式（m）。d、 proAPI的蛋白酶K消化产物。

为了检测蛋白酶K敏感性，将每个组分在不含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中稀释两倍，并用100μg/ml蛋白酶K在冰上处理30分钟，加入或不加入1%Triton X-100。样品用10%三氯乙酸沉淀，用冰镇丙酮洗涤一次，再悬浮在SDS-PAGE样品缓冲液中，并用SDS-PACE进行分析。

密度梯度离心

OptiPrep溶液在补充有1mM MgCl的裂解缓冲液中制备₂从下到上制备密度梯度，如下所示：0.5 ml 50%，1 ml 40%，1 ml 30%，1.5 ml 25%，2 ml 20%，2 ml 15%，1.5 ml 10%（wt/vol.）。在梯度顶部分层一毫升LSP部分，并在174000×克P40ST转子在4°C时（日本东京日立）。从梯度顶部各收集了26滴，得到14个分数。用SDS-PAGE样品缓冲液溶解每个组分，并用SDS-PAGE进行分析。

碱性磷酸酶测定

如前所述进行碱性磷酸酶（ALP）检测(Noda和Ohsumi，1998年).

福洛辛B染色

如前所述用Phloxine B对细胞进行染色(Tsukada和Ohsumi，1993年).

细胞标记和免疫沉淀

在23°C的SC（-Met）中预培养的细胞在5 OD时悬浮₆₀₀/在0.6 ml SC（-Met）中培养10或60 min。通过添加100μCi[³⁵S] 37°C下蛋氨酸培养20分钟。细胞培养用含有8 mM蛋氨酸和4 mM半胱氨酸的SC（-Met）进行五倍稀释，并在37°C培养。在饥饿条件下，细胞培养用含有相同浓度蛋氨酸和半胱氨酸的SD（-N）稀释。收集细胞，清洗一次，并用玻璃珠（425-600μm；Sigma，St.Louis，MO）在200μl的TEN中的1%十二烷基硫酸钠（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，5 mM EDTA和150 mM NaCl）中打碎细胞。将粗裂解物在95°C下培养5 min，用800μl 2%Triton X-100在TEN中稀释，并在15000×克持续10分钟，去除不溶性物质。在添加抗API血清和10μl蛋白A-Sepharose珠后，将样品在室温下培养2 h。依次用IP缓冲液（0.2%SDS和1%Triton X-100 in TEN）清洗珠子两次，用尿素缓冲液（IP缓冲液中的2 M尿素）清洗两次，再用高盐缓冲液（500 mM NaCl in IP缓冲液）清洗一次，再用TEN清洗一次。用SDS-PAGE样品缓冲液洗脱蛋白质，并通过SDS-PACE和生物图像分析仪（日本东京富士胶片公司BAS2000）进行分析。

为了检测培养基中的蛋白质分泌，细胞被标记为[³⁵S] 含100μg/mlα的SC（-Met）中的蛋氨酸₂-巨球蛋白和300μg/ml牛血清白蛋白。用最终浓度为10%的三氯乙酸沉淀培养基中的蛋白质，在10%三氯乙酸中洗涤两次，在冰镇丙酮中洗涤一次。在液体闪烁计数器中测量蛋白质中的合并放射性。

自噬体的生化检测

在自噬过程中，膜融合事件可能需要几个步骤，例如膜延伸的分离、隔离膜的密封以及自噬体与液泡的融合。因此，我们试图确定在上述突变体中哪个融合步骤受到影响。为了检测积累的自噬体，我们尝试通过亚细胞分离来分离自噬小体（图​（图2A）。2A） ●●●●。自噬体是一种瞬时结构，能立即与液泡融合，但在Δ埃及7它们在饥饿条件下积累的细胞(基里萨科等。, 1999). 我们已经通过电子显微镜报道，在饥饿条件下，proAPI优先被隔离在自噬体中(爸爸等。, 1997)允许使用API作为该细胞器的标记。

Δ埃及7细胞裂解液通过差速离心分离。在LSP中以13000×克在HSS中为100000×克LSP中proAPI的量在饥饿时增加了大约五倍。在YPD和SD（-N）培养基中培养的细胞LSP中的ProAPI对蛋白酶K完全耐药，但在Triton X-100存在下被消化，产生部分消化产物，表明其被包裹在膜结合结构中。据报道，在无镁的情况下进行细胞分离时，与膜外周结合的原API被释放²⁺，尽管它是在含有镁的缓冲液中的LSP中回收的²⁺(基姆等。, 1999). 与此一致，proAPI在LSP中从Δ埃及7细胞对蛋白酶K有抵抗力，而HSS中的细胞被镁消化²⁺-缓冲区不足。使用Δslp1/vps33细胞，也积累自噬体(爸爸等。, 1994). 自噬体/Cvt囊泡的形成在Δypt7Δapg7单元格(基姆等。, 1999;谷多等。, 1999)，无法从LSP中恢复任何proAPI。根据这些结果，我们得出结论，来自饥饿细胞的LSP中proAPI的量反映了积累的自噬体的存在。

Sec18p和Vti1p介导自噬体与液泡的融合

我们通过亚细胞分离鉴定了需要Sec18p的自噬步骤（图​（图2B）。2B） ●●●●。当细胞在37°C饥饿条件下培养时，LSP中的蛋白酶抗性原API从Δ埃及7细胞，而LSP中没有从Δypt7Δapg7细胞。在第18秒细胞在23°C的饥饿培养基中培养，几乎所有的API都是成熟的。成熟的API在LSP中被回收，表明API是针对液泡的，尽管如前所述，液泡膜破裂在HSS中回收了一些成熟的蛋白质(维达和格哈特，1999年). 当细胞在37°C饥饿条件下培养时，可检测到蛋白酶K抗性proAPI，并在LSP组分中回收，这表明自噬体在第18秒在非允许温度下突变细胞。这表明Sec18p在自噬体与小泡融合过程中起作用，但在自噬体形成过程中不起作用。

在饥饿条件下培养的野生型细胞在37°C的PMSF存在下进行电子显微镜检查，发现液泡中存在自噬体（图​（图3A，三A、 箭头）。在第18秒细胞，液泡中未发现自噬体，细胞质中检测到许多形态正常的自噬小体（图​（图3，三、B和C、箭头以及D和E）。

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图3

细胞自噬体的电子显微照片第18秒突变体。野生型（A）和第18秒（B和C）细胞在含有PMSF的SD（-N）中37°C培养2.5 h，并按照材料和方法中所述的冷冻替代技术固定。自噬体的高倍图像第18秒如D和E箭头所示，为自噬体；箭头，自噬体；五、 液泡。条形，500 nm（A–C）；100 nm（D和E）。

我们还探索了vti1型突变体。细胞分离后vti1-11型^时间在非允许温度下在SD（-N）中培养的突变细胞，在LSP中恢复了蛋白酶抗性原API（图​（图2B）。2B） ●●●●。因此，Vti1p是自噬体液泡融合的另一个重要因素。该步骤还需要真空t-SNARE Vam3p(达尔索等。, 1997). 连同这些结果，Vti1p作为v-SNARE，Vam3p作为t-SNARE可能构成SNARE因子，与Sec18p一起作用于自噬体与液泡的融合。

自噬中COPII亚单位的要求

众所周知，分泌途径中的阻滞会直接或间接导致一些细胞缺陷，如内吞、核糖体生物生成和核转运(瑞塔和华纳，1994年;希克等。, 1997;楠杜里等。, 1999). 在分泌途径中，Sec18p在介导ER衍生囊泡与高尔基复合体的融合以及分泌囊泡与质膜的融合中起着重要作用(贝克尔斯等。, 1989;Kaiser和Schekman，1990年;Graham和Emr，1991年). 在这里，我们发现自噬体的形成可能发生在第18秒突变体（图​（图22和​和3）三)阻断内质网到高尔基体或高尔基体到质膜的转运可能不会影响自噬体的形成。接下来我们研究了晚期分泌突变体的自噬活性。自噬在后期未被诱导秒突变体，秒4和第15秒电池，37°C；然而，与其他温度相比，当转移到允许温度时，ALP活性没有恢复秒突变体（图​（图1B1B和​和4B）。4B） ●●●●。限制温度为34°C，在此温度下不会形成菌落，一般分泌物减少至20%（in秒4）和30%（英寸秒15）选择野生型细胞，研究其自噬活性。因此，在这些后期没有发现缺陷秒这种情况下的突变体（图​（图4D）；4D） ；因此，自噬不一定需要晚期Sec蛋白。

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图4

COPII突变体中的自噬活性。（A） 表达Pho8的细胞Δ60p（野生型[wt]，第12页，第16秒、第13秒、第31秒、第23秒，或第24秒)在23°C（开放栏）的YPD中培养，在23°C（阴影栏）或34°C（灰色栏）或37°C的SD（-N）中培养3 h（填充栏），裂解并评估ALP活性。（B） 自噬的时间进程秒12和第13秒第12秒和第13秒细胞生长在23℃的YPD中，在23℃（圆形）、34℃（方形）或37℃（三角形）的SD（-N）中培养。在SD（-N）中培养3h的细胞从23°C转变为34°C（开环），从34转变为23°C（方形），从37转变为23℃（三角形）。（C）第12页携带pRS316（载体）、pSHY6-4（pCEN-SEC12）或pANY2-7（p2μ-SAR1）的细胞生长于23°C的SC（-Ura）中，在23°C（开杆）的YPD中培养4小时，然后在23°C（阴影杆）或34°C（填充杆）的SD（-N）中培养4个小时。（D） 野生型（wt），秒12，或秒4在23°C（开条）的YPD中生长的细胞在23°C（阴影条）或34°C（填充条）的SD（-N）中培养2 h。按照材料和方法中的描述测量裂解液的ALP活性。

然后研究了自噬中早期Sec蛋白的需求。从内质网形成COPII囊泡对于囊泡向高尔基复合体的转运至关重要(Kaiser和Schekman，1990年;巴洛维等。, 1994). 在温度敏感型第13秒或第31秒突变体(萨拉马等。, 1997)，自噬在非允许温度下正常进行（图​（图4A），4A） 尽管空泡酶羧肽酶Y从内质网的转运受到严重损害。分泌膜从内质网经COPII囊泡流向高尔基体，显然与自噬无关。

出乎意料的是，另一个对温度敏感的COPII突变体，秒12，在34和37°C的非许可温度下表现出缺陷自噬（图​（图4A）。4A） ●●●●。从允许温度变为34°C阻止了碱性磷酸酶活性的增加（图​（图4C）。4C） 。约80%（34°C时）或70%（37°C时秒12细胞在SD（-N）中孵育3小时后仍能存活。随后从34或37℃降至23℃，自噬活性立即恢复。这些结果表明，自噬缺陷一定是第12页突变。Sec12p是一个GDP/GTP交换因子，与Sar1p GTPase一起发挥作用(Nakano和Muramatsu，1989年;巴洛维等。, 1994). Sec12p似乎在自噬过程中通过Sar1p功能发挥作用，类似于其在ER-Glgi转运步骤中的作用(Nakano和Muramatsu，1989年)，因为秒12通过多拷贝质粒过量生产Sar1p，在34°C下恢复突变（图​（图44B） ●●●●。

此外，秒16(Espenshade公司等。, 1995)，第23秒，和第24秒(巴洛维等。, 1994)还显示了温度敏感性自噬缺陷（图​（图4A）。4A） ●●●●。Sec13p和Sec31p在COPII涂层中形成一个亚复合物，而Sec23p和Sec24p则构成另一个亚复合体(巴洛维等。, 1994;萨拉马等。, 1997). 这些结果表明，COPII装置中的某些因子是自噬所必需的。

Sec12p对自噬至关重要，但对Cvt途径则不重要

据报道，Cvt途径在秒12突变体(克利恩斯基等。, 1992)，我们在本研究中证实了这一发现（图​（图5A，5A、 左）。在秒12在37°C条件下发生突变，API在富培养基中的成熟率与野生型细胞中的成熟速率无法区分。即使在37°C下预孵育1小时秒12与野生型细胞相似（图​（图5B）。5B） ●●●●。这些结果表明，自噬需要Sec12p，而Cvt途径则不需要。

此外，即使在37°C的饥饿条件下，proAPI在秒12突变和野生型细胞（图​（图5A，5A、 右侧）。确定Cvt途径是否在饥饿状态下进行第12页细胞，我们构建了一个双突变体，秒12Δcvt9（图​（图6）。6). Cvt9p对Cvt途径至关重要，但对自噬不重要(哈丁等。1996年;卡马达等。, 2000;基姆等。, 2001). 什么时候？秒12细胞在YPD或SD（-N）中在非允许温度下培养，检测到成熟形式的API，这与图中的结果一致​图5。5然而，在秒12Δcvt9突变细胞，API在任何一种营养条件下都无法在非允许温度下成熟。因此，API在饥饿状态下的成熟第12页细胞依赖于Cvt9p的功能。这些结果增加了即使在饥饿条件下，Cvt途径也有可能在秒12突变细胞。

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图6

年API运输受损秒12Δcvt9细胞。（A） 野生型（wt），Δcvt9，秒12Δcvst9、和秒12在23°C的YPD中生长的细胞在37°C的YPD或SD（-N）中培养3h，裂解，并用抗API血清进行免疫印迹分析。（B） 将A中的突变细胞在23°C（开条）的YPD中培养，在23°C（阴影条）或34°C（填充条）的SD（-N）中培养3 h，裂解并评估ALP活性。

密度梯度离心法分离Cvt囊泡中的自噬体

在上述分级方案后，在LSP组分中回收了自噬体和Cvt囊泡（图​（图2）。2). 为了进一步分析，我们建立了一种通过平衡密度梯度离心法从Cvt囊泡中分离自噬体的方法（图​（图7）。7). LSP分数来自Δ埃及7将培养在YPD或SD（-N）中的细胞分层在10–50%OptiPrep梯度上，并在174000×克持续16小时（图​（图7A，7A、，Δ埃及7). 对于饥饿的细胞，在组分3和4中检测到的proAPI最强，在较重的组分中也检测到一小部分。对于生长细胞，除分数3和4外，在分数9-11中检测到proAPI。这些组分中proAPI的出现完全取决于APG公司基因（图​（图7A，7A、，Δypt7Δapg7). 所有这些级分中的ProAPI必须包含在膜结合结构中，因为它对蛋白酶K处理具有抗性（图​（图7C）。7C） 。我们比较了不同营养条件下这两个峰值中proAPI的含量。在饥饿条件下，轻馏分的含量增加了7倍以上，而重馏分的变化不明显（图​（图7B，7B、 proAPI）。在Δypt7Δcvt9在生长条件下，两种组分中均未检测到proAPI，而在饥饿条件下，在轻组分中检测到了proAPI。然后，我们检查了这些组分中细胞溶质标记蛋白的共定位（图​（图7B）。7B） ●●●●。自噬体非选择性地隔离细胞质成分；另一方面，Cvt囊泡选择性地包围Cvt复合体并排除胞质溶胶(爸爸等。, 1997). 在饥饿条件下，轻组分中Pho8Δ60p的含量在Δ埃及7个单元格，但不在Δypt7Δapg7细胞。相反，饥饿后这些细胞的重组分中没有检测到这种增加。另一种细胞溶质标志蛋白Bmh1p也在饥饿条件下的轻组分中被回收Δ埃及7单元格（图​（图7C），7C） 根据这些观察结果，我们得出结论：轻组分（3和4）富含自噬体，而重组分9-11含有Cvt小泡。这种密度梯度离心可以将自噬体从Cvt囊泡中分离出来。

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图7

通过密度梯度离心分离自噬体和Cvt囊泡。（A）Δypt7，Δypt 7Δapg7，和Δypt7Δcvt9细胞在30°C的YPD或SD（-N）中培养。LSP组分的制备如图所示​图22并在10–50%OptiPrep梯度上加载，在174000×克.从试管顶部收集了14个馏分。用抗API血清对等量的每一组分进行免疫印迹。作为对照，使用了六分之一的细胞裂解液（总量）和一半的LSP。空泡（蛋白酶B，PrB）、内胚体（Pep12p）和线粒体（F1β）的器官标记通过饥饿小鼠的免疫印迹检测Δ埃及7并通过密度测定法进行评估。（B） 通过免疫印迹法及其各自的抗血清测定了A组分3和4或组分9–11密度梯度中proAPI和Pho8Δ60p的相对含量。（C） 将来自饥饿细胞（AP）的组分3和4或来自YPD-生长细胞（Cvt）的组份9–11汇集到A中，用蛋白酶K（PK）处理，加或不加Triton X-100（TX），然后用抗API或抗Bmh1p抗血清进行免疫印迹。

这个第18秒通过密度梯度离心分析突变体（图​（图8B）。8B） ●●●●。什么时候？第18秒细胞在37°C的SD（-N）中培养，轻组分中的proAPI有效回收，如Δ埃及7细胞。这也证实了第18秒突变细胞在饥饿条件下积累自噬体。

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图8

自噬体形成第12页和第18秒细胞。（A）Δypt7秒12细胞在37°C的YPD或SD（-N）中培养3 h。如图所示进行分馏和蛋白酶处理​图2。2.（B）Δypt7，秒18，和Δypt7秒12在23°C的YPD中预培养的细胞在37°C的YPD或SD（-N）中培养3 h。如图所示进行密度梯度离心和免疫印迹​图7：。7作为对照，还分析了细胞总裂解物的十分之一和LSP的一半。

Cvt囊泡自噬体的分离

我们首次建立了从酵母细胞中分离自噬体的方法。密度梯度离心会产生两个围绕proAPI的膜结构峰。光峰似乎含有自噬体部分，原因如下：1）该峰中proAPI的量因饥饿而增加，2）该峰还发现其他对蛋白酶K有抵抗力的细胞溶质蛋白，以及3）从该峰中恢复原API和细胞溶质蛋白取决于活性Apg蛋白的存在。Aut7p/Apg8p与自噬体及其中间结构有关(基里萨科等。, 1999). 正如预期的那样，在光峰部分检测到了一部分Apg8p（石原和Ohsumi，未发表的结果）。重峰似乎包含Cvt小泡，因为它在生长细胞中可检测到，并且与细胞溶质蛋白无关。这两种结构的密度差异可能反映了它们的含量；自噬体含有细胞质，Cvt囊泡含有致密的Cvt复合物(爸爸等。, 1997). 我们相信，我们的方法将有助于酵母自噬体的进一步生化表征。

NSF/SNARE与自噬体形成和液泡融合

根据电子显微镜，自噬体并不是由先前存在的细胞器形成的(爸爸等。, 1994). 最近，我们发现可以通过检测Apg8p来追踪自噬体的形成，Apg8p是一种定位于中间膜结构和自噬小体上的特异性标记物。在隔离膜旁边的区域发现了这种含有Apg8p的结构，这表明自噬体是由一些小的膜结构组装而成的(基里萨科等。, 1999). 在这里，我们清楚地表明，Sec18p（NSF）对自噬体形成过程中发生的事件是不需要的，例如隔离膜的延伸或自噬小体的封闭（图​（图22和​和3）。三). 迄今为止，已经报道了一些非NSF依赖的膜融合事件，如极化细胞的顶端转运(低等。, 1998)，非极化细胞中的同源通路(吉森等。1996年)有丝分裂哺乳动物细胞中高尔基体池的生长(拉布耶等。, 1995)酵母内质网膜的同型融合(Latterich（锁存器）等。, 1995). Cdc48p与NSF有关，在ER膜融合中起作用，但对温度敏感cdc48突变体在自噬方面是正常的（图​（图1）。1). 某些特定的融合因子不同于一般的融合机制，可能在自噬体的形成中发挥作用。

我们在这项研究中表明，Sec18p和Vti1p对于自噬体-小泡融合是必要的（图​（图11和​和2）。2). 在这里，我们总结了我们目前关于SNARE分子在自噬和Cvt途径中的知识。Vacuolar t-SNARE，包括Vam3p和Vam7p，在各种途径的液泡融合步骤中发挥作用，包括自噬和Cvt途径(达尔索等。, 1997;佐藤等。, 1998); 然而，在这两种途径中，胞内t-SNARE Pep12p是可有可无的(阿贝利奥维奇等。, 1999). 真空v-SNARE Nyv1p被证明对Cvt途径不重要(菲舍尔·冯·莫拉德和史蒂文斯，1999年); 我们证实了Δnyv1细胞正常进行自噬。最近，人们发现t-SNARE Tlg2p对Cvt囊泡的形成至关重要，但对自噬不起作用(阿贝利奥维奇等。, 1999). v-SNARE Vti1p对Cvt途径至关重要(菲舍尔·冯·莫拉德和史蒂文斯，1999年)和自噬（图​（图1）。1). Vti1p与Vam3p结合(霍特威斯等。, 1998)这表明这两个SNARE在自噬体和液泡的融合过程中形成复合物。Sec18p、Vti1p和Vam3p将促进自噬体外膜与液泡的异型融合，可能与Rab蛋白Ypt7p和含有Vps18p和Slp1p/Vps33p的C类液泡蛋白分选（Vps）蛋白复合物一起。Vti1p最有可能位于自噬体膜上，但由于其多个定位位点，很难明确证明(菲舍尔·冯·莫拉德等。, 1997). Vti1p转运到自噬体和/或Cvt囊泡的方式是下一个必须解决的问题。

COPII因子亚群在自噬中的作用

我们发现在早期分泌突变体中自噬体的形成正常进行，第13秒、第31秒、，和第18秒（图​（图22和​和4），4)这表明从内质网到高尔基体的膜流动与自噬体的形成无关。此外，最近秒突变体，秒4和第15秒，虽然分泌受到严重影响，但在34°C时没有出现自噬缺陷，这支持了自噬体的形成并不直接需要分泌膜流动的观点。

在这项研究中，我们还证明了Sec12p是自噬体形成所必需的（图​（图4，4，​,8,8、和​和9）。9). 中的缺陷秒12通过Sar1p的过度表达恢复，表明Sar1p在自噬中也与Sec12p一起发挥作用。Sec12p是一个调节因子，调节Sar1 GTPase的活性，这是COPII囊泡从内质网中萌发所必需的(Nakano和Muramatsu，1989年). ER-Glgi贩运所需的一些因素也在自噬体形成中发挥作用。

有趣的是，尽管早期Sec蛋白中的六种Sec12p、Sec13p、Sec16p、Sec23p、Sec24p和Sec31p参与了COPII囊泡的形成，但这些突变体对自噬有明显的影响（图​（图3）。三). 最近的研究表明，非经典的类COPI因子参与了非必要的膜组织过程。Lst8p是Sec13p的同源物，被证明在从高尔基体到质膜的氨基酸渗透酶的分选步骤中发挥作用(罗贝里等。，1997年a，b条). Iss1p与Sec24p具有惊人的相似性，在囊泡形成中与之互换作用(栗原市等。, 2000). Lst1p也与Sec24p同源，与Sec23p形成复合物，并在内质网形成专门的小泡以运输Pma1p中发挥作用(罗贝里等。, 1999). 我们假设Sec12p、Sec16p和由Sec23p和Sec24p组成的外壳亚复合物在形成对自噬体形成至关重要的特殊囊泡中发挥作用。进一步研究COPII因子在自噬中的作用可能进一步阐明自噬体膜的起源。

我们感谢A.Nakano博士（RIKEN）、R.Schekman博士（加州大学伯克利分校）、T.Stevens博士（俄勒冈州大学）、M.Latterich博士（索尔克研究所）、D.J.Klinsky博士（密歇根大学）、M.Sakaguchi博士和K.Mihara博士（九州大学），以及N.Mizushima博士和T.Kirisako博士（NIBB）提供菌株、质粒、，或抗体，Y.Hayashi博士、M.Kondo博士和T.Notomi（NIBB）为EM分析提供技术支持。这项工作得到了日本教育、科学、体育和文化部艾滋病补助金的部分支持。