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.2001年10月；75(20):9808-18.
doi:10.1128/JVI.75.20.9808-9818.2001。

细胞COPII蛋白参与形成脊髓灰质炎病毒复制复合体的囊泡的产生

钢筋混凝土锈蚀 1, L兰德曼, R戈瑟特, B L唐, W Hong公司, H P Hauri公司, D艾格, K Bienz公司
附属公司

细胞COPII蛋白参与形成脊髓灰质炎病毒复制复合物的囊泡的产生

R C锈蚀等。 J维罗尔. 2001年10月.

摘要

脊髓灰质炎病毒（PV）与感染细胞细胞质中的膜泡一起复制其基因组。为了阐明PV小泡的起源和形成方式，在BT7-H细胞中用针对病毒小泡标记蛋白2B和2BC的抗体以及内质网（ER）、顺行运输小泡和高尔基复合体的细胞标记进行免疫荧光标记。共焦激光扫描显微镜获得的光学切片经过去卷积处理，以提高分辨率和信噪比，并允许标记膜结构的三维表示。从形态学角度来看，PV小泡的形成方式与未感染细胞中顺行膜交通小泡的生成相似。两种类型的囊泡均排除了ER受体膜标记物，发现COPII组分Sec13和Sec31均位于囊泡表面，表明存在功能性COPII涂层。感染早期PV囊泡的形成与高尔基复合体无关。PV蛋白2BC或整个P2和P3基因组区域的表达导致产生携带COPII外壳的囊泡，并显示出与PV感染后产生的囊泡相同的形成模式。这些结果表明，PV囊泡是通过细胞COPII出芽机制在内质网形成的，因此与顺行膜转运途径的囊泡同源。

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图1
图1
Cy2和Cy3检测通道之间的信号串扰。（a和b）用抗p63和Cy2标记的抗物种抗体标记Mock感染细胞。从Cy2检测（a）到Cy3检测（b）通道中未发现信号渗出。（c和d）用抗2B和Cy3标记的抗种抗体标记PV感染细胞。未观察到从Cy3检测（d）到Cy2检测（c）通道的出血。棒材，2μm。
图2
图2
未感染BT7-H细胞内质网顺行运输小泡的形成。（a和b）ER标记蛋白p63（绿色）和COPII成分Sec31（红色）的检测。（a） 共焦显微镜获得的44个光学截面的去卷积图像堆栈的最大强度投影。N、 核心。棒材，2μm。（b） 面板a中概述的区域的三维视图（等值面）。Sec31-涂层囊泡（红色）从内质网膜中萌芽（绿色）。p63和Sec31的结肠化（黄色）仅限于内质网和囊泡之间的衣领样过渡位点。条形图，1μm（由于透视关系，条形图大小仅适用于图像的前景）。（c） 标记为Sec13（绿色）和Sec31（红色）的细胞部分的等值面重建，显示两种COPII成分的高度共定位（黄色）。条形，1μm（前景）。（d） 从标记为p63（绿色）和Sec31（红色）的细胞中提取的光学切片堆栈的直方图。携带绿色或红色信号的像素根据其强度沿各自轴分布在两个不同的群体中。（e） 标记为Sec13和Sec31的单元格的直方图。大多数像素同时携带这两种信号。在面板d和e中，任一通道的背景在整个信号强度范围内为6%（标记为B的线）。串扰随着信号强度的增加而增加，绿色通道中的串扰最大为17%，红色通道中的最大为10%（标记为X的线）（参见材料和方法中的解释）。
图3
图3
在PV感染的细胞中，PV小泡在内质网形成。（a）标记为p63（绿色）和2B（红色）的细胞部分的等表面图片。标记物的共定位仅限于扁平的黄色斑块（箭头），代表2B标记蛋白与内质网的结合位点，以及内质网和囊泡之间的环状过渡位点（箭头；另见面板c）。虚线限定了面板c.Bar中显示的区域，1μm。（b） 高倍等表面视图显示了标记为MERG的细胞的一部分，即一系列ER滞留蛋白（绿色）和2B（红色）。它们与2B的共定位（黄色）仅位于过渡位点，如面板a中的p63和2B。Bar，0.5μm（前景）。（c） 通过图3a（虚线）所示细胞区域的连续光学截面。通过沿着出现的囊泡通过截面（箭头），可以看到抗原p63（绿色）和PV 2B（红色）共定位（黄色），形成环状结构，并演化为红色囊泡。光学部分的厚度为70 nm。棒材，1μm。（d） 标记为p63（绿色）的ER中出现了一簇2B阳性小泡（红色）。条形，200 nm（前景）。（e） EM图片显示了与ER（箭头）相关的一组可比较的囊泡（箭头），部分携带核糖体。囊泡的大小和排列与共焦显微镜发现的囊泡相似。条形，200 nm。（f） 等表面图片显示在PV感染的细胞中从ER（绿色）（p63）出芽的抗Sec31-标记的囊泡（红色）。条形，2μm（前景）。（g和h）用抗2B抗体（红色）和抗Sec13（g）或抗Sec31（h）标记囊泡。两种COPII组分大部分与2B共定位（黄色）。棒材，2μm（前景）。
图4
图4
最高强度投影的高对比黑白打印。（a） 对PV感染细胞进行Sec13和2B染色。不规则大小的共定位信号集中在核周区。（b） Sec13和Sec31的未感染细胞染色。均匀的信号在细胞质中分布相当均匀。N、 核心。棒材，2μm。
图5
图5
单独或在所有非结构PV蛋白的情况下表达PV蛋白2BC的细胞中形成囊泡。（a至c）转染pTM-PV2BC的细胞的等表面照片，转染后6小时固定。（a和b）对细胞进行p63（绿色）和2B（红色）染色。2B阳性小泡的出现与PV感染后观察到的小泡相似，p63和PV 2BC的共定位仅在衣领状结构中（与图3相比）。条形图（前景），2μm（a）和0.5μm（b）。（c） 在pTM-PV2BC转染的细胞中，Sec13（绿色）和2B（红色）染色后，观察到两个标记的高度共定位（黄色）。棒材，0.5μm（前景）。（d） 用质粒pE5PVΔP1转染细胞（编码P2和P3基因组区域的所有蛋白质），并在转染后8 h对p63（绿色）和2B（红色）进行染色。囊泡的形成与PV感染或2BC单独表达期间的囊泡形成相当。棒材，0.5μm（前景）。（e和f）PV感染的细胞，用抗坏血素MAb（红色）和FITC-标记的抗2B MAb染色，用二级抗FITC-Alexa 488 Ab（绿色）增强。（e） 最大强度投影。PV囊泡与顺式-高尔基体内侧隔室。棒材，2μm。（f） 在相应的直方图中，这两个信号基本上是分开的。
图6
图6
PV感染细胞的常规双荧光显微镜。（a） FITC-标记的抗2B MAb染色，二级抗FITC-Alexa 488 Ab染色(顺式-内侧高尔基隔室）。这两种信号在细胞中的分布完全不同。棒材，10μm。
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