美国国家科学院院刊。2004年1月20日；101(3): 841–846.
多个基板嗜肺军团菌通过细菌间蛋白转移鉴定Dot/Icm系统
马萨诸塞州波士顿哈里森大道150号塔夫茨大学医学院霍华德·休斯医学院分子生物学和微生物学系，邮编02111
由马萨诸塞州波士顿哈佛医学院John J.Mekalanos编辑，2003年11月21日批准
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支持信息
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摘要
嗜肺军团菌是一种在宿主细胞内的特殊液泡中繁殖的细胞内病原体。这个液泡的生物发生需要Dot/Icm IV型蛋白质易位系统。通过使用Cre/液氧磷-基于蛋白质易位分析，我们发现Dot/Icm复合物跨宿主吞噬体膜易位的蛋白质也可以从一个细菌细胞转移到另一个细菌。该系统的灵活性允许识别由Dot/Icm复合物转位的几个蛋白质家族。当用免疫荧光显微镜进行分析时，通过该程序鉴定的一种蛋白质SidC被证明穿过吞噬体膜转移到细胞的细胞质表面嗜肺军团菌吞噬体。大量这些底物的鉴定，以及缺乏任何一种底物很少导致细胞内生长出现强烈缺陷的事实，表明Dot/Icm易位靶点之间存在显著的功能冗余。
关键词：细菌发病机制、蛋白质移位、质粒接合
主动修改宿主细胞功能对于细菌病原菌成功感染至关重要。这种修饰通常是通过特殊的蛋白质分泌系统将效应物注入宿主细胞质来介导的(1). 在这些系统中，接合适应性转运体，也称为IV型分泌系统（TFSS），已在许多细菌病原体中鉴定出来(2). 其中许多TFSS是专用的DNA转移设备，而其他TFSS允许革兰氏阴性细菌病原体将蛋白质底物直接转移到真核细胞的胞浆中。只有少数转移到宿主细胞的TFSS蛋白底物被鉴定出来(2).
嗜肺军团菌是导致退伍军人病的细胞内病原体。在被巨噬细胞吞噬后，细菌在一个最初与内吞途径分离的特殊液泡中繁殖(三，4)可能是通过拦截早期分泌囊泡(5). 这种复制性吞噬体的生物发生需要称为Dot/Icm的TFSS转运蛋白(6，7). 据信，由该设备运输的底物直接促进细菌液泡的靶向途径(8). 其中两种底物RalF和LidA已被鉴定(9，10). RalF是多种Arf蛋白的鸟嘌呤核苷酸交换因子(9)LidA的生化活性未知(10). 很明显，Dot/Icm还有其他未知底物，因为特异性消除LidA的突变导致细胞内生长的缺陷可以忽略不计拉尔夫精通细胞内复制(9，10). 对Dot/Icm装置移位的效应器的特性和功能的综合分析对于确定这种细菌如何建立复制液泡至关重要。我们在这里报告说，从细菌转移到宿主细胞的蛋白质也可以在细菌细胞之间转移，从而能够识别通过Dot/Icm装置转移的大量蛋白质。
材料和方法
细菌菌株和生长条件。全部嗜肺军团菌本研究中使用的菌株是野生型菌株Lp02的衍生物(thyA，hsdR、和转速L) (11). Lp03是等基因的dotA公司–突变体(12). 所有菌株都生长在酪蛋白氨基酸酵母提取物胸苷（CYET）平板上或N个-（2-乙酰氨基）-2-氨基乙磺酸酵母提取物（AYE）肉汤(11). 按照说明制备骨髓源性巨噬细胞(11). 检测A/J小鼠巨噬细胞内的细胞内生长(11)或在阿米巴宿主内盘状网柄菌(13),嗜肺军团菌根据细菌运动能力和细胞密度（OD）判断，菌株生长到指数后期600= 3.3–3.7).
质粒构建。pBRR1MCS的衍生物暴徒–（抄送对) (14)，适用于报告细菌间蛋白移位（称为pZL184；)，是在涉及多个步骤的克隆过程中构建的。使用的寡核苷酸序列、基因盒来源和克隆细节见支持方法，作为支持信息发布在PNAS网站上。为了表达Cre融合，我们首先构建了pZL180（Amp对和蒂亚+)，其中包含cre公司在转移缺陷型RSF1010质粒pJB908（J.Vogel，华盛顿大学医学院，圣路易斯分校）上，构建融合子如下：通过PCR扩增整个ORF，并融合到3′端cre公司在pZL180上，对于小于2kb的基因，而对于大于2kb基因，编码每个ORF的500或700个氨基酸的3′区域融合到cre公司.
在没有DNA转移的情况下，通过Dot/Icm系统进行细菌间蛋白移位。(一个)细菌间蛋白质转移检测。通过移除位于供体细菌菌株之间的漂浮转录终止子来测量Cre杂交蛋白的易位trc公司发起人和npt II型（看）R（右）)受体菌株携带质粒pZL184上的基因。携带完整报告者的细菌无法在含有卡那霉素和蔗糖的培养基上生长。Cre杂交蛋白移位到受体菌株中，通过在液氧磷赋予蔗糖敏感性的DNA片段的位点(sacB公司)和功能的重建loxP-npt II型平移融合。S.D.，Shine–Dalgarno序列；npt II型新霉素磷酸转移酶；红钻石，转录终止因子。箭头表示信托收据发起人和液氧磷地点。(B类)RSF1010融合产物的细菌间转移mobA公司基因。这个mobA公司基因融合到cre公司和RP4依赖性蛋白移位到受体大肠杆菌应变是用大肠杆菌第17–1节(15)作为供体选择卡那霉素耐药性并筛选庆大霉素敏感性。黑条，S17–1 Trb+捐赠者；点画条，大肠杆菌DH5αTrb–捐赠者。(C类). 携带Cre融合的质粒不能转移到受体细胞。表达指定蛋白的质粒存在于大肠杆菌S17–1（Trb+)或嗜肺军团菌Lp02（点/Icm+; 裁判。11)，质粒转移效率通过使用任一受体进行测量大肠杆菌或嗜肺军团菌菌株。作为阳性对照，相同的质粒具有完整的oriT公司和暴徒该系统用于证明供体菌株的转移能力。黑条，供体菌株大肠杆菌S17–1（Trb+); 灰色条，供体菌株嗜肺军团菌Lp02（点/Icm+; 裁判。11). (D类)在细菌细胞之间转移易位的Dot/Icm底物。蛋白质转移按照材料和方法，通过使用Lp02（点/Icm+)或Lp03(dotA公司–)表达指定的融合蛋白作为供体菌株。灰条，供体菌株嗜肺军团菌Lp02（点/Icm+); 斑点条，供体菌株嗜肺军团菌Lp03（磅）(dotA公司–).
细菌双杂交筛选。第一，拉尔夫翻译融合到片段T18的3′端百日咳杆菌pUT18上编码腺苷酸环化酶的基因(15).绍3AI生成的基因组DNA片段来自嗜肺军团菌应变Lp02(11)从800到5kb的碱基对被插入到pKT25中(15)，从而生成一个嗜肺军团菌融合到C末端的蛋白质百日咳鲍特菌腺苷酸环化酶T25片段。大肠杆菌菌株BTH101(15)，表示塞浦路斯::拉尔夫（C），通过在含有40μg/ml X-Gal的LB培养基或合成的M63培养基上筛选来鉴定RalF-相互作用蛋白(15)以乳糖为唯一碳源。根据检测到的Lac的存在，鉴定出具有功能性腺苷酸环化酶蛋白的菌株+这些培养基上的表型。通过使用DotF或DotF（28-123）作为诱饵，以类似的方式鉴定了与DotF相互作用的蛋白质。
细菌交配和细胞间蛋白转运。对于RP4-Trb介导的Cre:：MobA杂种易位，≈2.5×108来自S17-1（Trb）饱和培养物的细胞+) (16)或DH5α（Trb–)表达在LB肉汤中生长的融合蛋白的菌株与携带pZL184的受体菌株XL1Blue的15倍过量菌株混合。将混合物点在0.45μm硝化纤维过滤器上，放置在LB板上，并在37°C下孵育3小时。在含有5%蔗糖和30μg/ml卡那霉素的LB培养基上选择兴奋剂。
对于嗜肺军团菌到嗜肺军团菌易位，Lp02(11)或Lp03dotA公司–(12)含有表达适当Cre融合的质粒在AYE肉汤中生长到指数后阶段。为了进行混合，首先将0.45-μm硝化纤维素膜置于含有100 nM异丙基β的CYET培养基上-d日-硫代半乳糖苷（IPTG）和平板在37°C下孵育1h，然后用≈3.5×10的混合物斑点8供体和受体Lp03的15倍过剩（pZL184）。交配板在37°C下孵育14小时，并在CYET上选择激发剂–5%蔗糖，30μg/ml卡那霉素，这会杀死双亲。每次交配均进行三次，并至少重复三次。转移频率表示为每个供体细菌的兴奋剂（对卡那霉素和蔗糖有抗性，但对庆大霉素敏感）的数量，并且通过计数来自交配前接种到CYET培养基上的适当稀释的供体细胞的菌落形成单位来确定供体细菌的数量。
对于质粒转移，通过将蛋白质易位配对混合物电镀到含有100μg/ml氨苄西林和30μg/ml氯霉素（对于大肠杆菌)或放在含有5μg/ml氯霉素的木炭酵母提取物上（选择Thy+和CmR（右）)用于转入嗜肺军团菌). 作为阳性对照，野生型RSF1010衍生物pKB5(11)在两者中都使用了大肠杆菌和嗜肺军团菌交配(6).
框架内缺失的构建和缺失突变体的补充。帧内删除嗜肺军团菌基因通过描述的两步等位基因交换策略进行(17). 在每种情况下，缺失结构的设计都是这样的，即完整的基因被一个ORF取代，该ORF被预测为表达一种由基因的前10个氨基酸和最后10个氨基酸组成的20-aa多肽。为了对缺失突变体进行互补性研究，通过PCR扩增感兴趣的基因并插入pJB908或pBBRMCS2(14).
蛋白质纯化和抗体制备。SidC的预测ORF被插入到pQE30中，得到的His6-SidC融合蛋白纯化自大肠杆菌使用Ninitrilotriacetic acid树脂（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）。兔多克隆血清由Pocono兔场（宾夕法尼亚州加拿大人；参考文献。10). 使用含有纯化（His）的基质对抗体进行亲和纯化6-SidC共价偶联到Affigel-10珠（Bio-Rad）(18).
Western Blot和免疫荧光染色。总计嗜肺军团菌如前所述，将SDS/PAGE分离的蛋白质转移到Immobilon-P膜（Millipore）上，并通过Western blotting进行检测(16). 用亲和纯化的抗SidC抗体（稀释1:5000）或抗-枯草芽孢杆菌异柠檬酸脱氢酶多克隆抗体（稀释1:5000；塔夫茨大学医学院L.Sonenshein博士赠送的礼物）。用亲和纯化兔抗（His）抗体进行免疫荧光染色6-SidC抗体之后是德克萨斯州红结合山羊抗兔抗体（分子探针）。按照说明进行固定和探测技术(10). 后核武器嗜肺军团菌吞噬体按照描述进行分离(10).
结果
斑点法细菌间蛋白转运/图标。为了鉴定Dot/Icm易位体的底物，设计了一种筛选策略，允许我们使用Cre直接检测蛋白质易位/液氧磷噬菌体P1的系统（有关审查，请参阅参考。19). 以前的工作(20)证明Cre的存在不会干扰TFSS底物VirE2和VirF在根癌农杆菌构建了一个适合于监测两个原核细胞之间Cre融合蛋白易位的报告子，其中表达了npt II型该基因依赖于切除由庆大霉素耐药基因组成的漂浮盒sacB公司基因和转录终止子(). 通过使用此系统，大肠杆菌和嗜肺军团菌可以转移一种杂交蛋白cre公司融合到mobA公司质粒RSF1010的基因(). 当Cre:：MobA杂交蛋白从缺乏转移来源的质粒中表达时(oriT公司)在中大肠杆菌应变S17–1(16)，将融合蛋白转移到另一个大肠杆菌通过删除塞子序列和卡那霉素抗性的表达可以检测到菌株(以及图6，作为支持信息发布在PNAS网站上）。当Trb–缺乏共轭转移功能的菌株DH5α被用作供体，或当质粒具有cre公司单独进行了测试(). 此外，没有将质粒转移到受体，这表明在没有DNA转移的情况下发生了融合蛋白的移位(; Cre:：MobA或Cre）。嗜肺军团菌也能够以Dot/Icm依赖的方式转移杂交蛋白(; Cre:：MobA），表明Dot/Icm系统能够在没有DNA转移的情况下在细菌间转移蛋白质(). 质粒Mob蛋白，如RSF1010的MobA，被认为以蛋白质-单链DNA复合物的形式转移到受体细胞(21). 然而，我们的结果表明，诸如Trb和Dot/Icm等接合系统能够在没有DNA转移的情况下转移MobA（以及可能类似的蛋白质）。该结果与ColIb-P9 SogL蛋白的观察结果相似(22).
通过这种策略，两种已知的从细菌细胞转移到哺乳动物细胞的蛋白质也可以在细菌间转移。全长拉尔夫和3′半盖子A[已调用盖子A（C） ]翻译融合到cre公司并对杂交后代进行细菌-细菌易位检测。我们发现了野生型嗜肺军团菌基于受体菌株切除漂浮DNA片段并表达卡那霉素耐药性的能力，但不是Dot/I缺陷菌株可以转移Cre:：RalF或Cre:：LidA（C）[; Cre:：RalF和Cre:：LidA（C）]。然而，Cre本身不能被野生型转移嗜肺军团菌(). Cre:：LidA（C）的易位熟练度表明，靶向信息存在于蛋白质的C末端，至少对于细菌间转移而言。我们通过分别测试Dot/Icm-介导的Cre:：RalF（C）和Cre:：RalF（N）易位来检验这一发现是否也适用于RalF。只有Cre:RalF（C）易位频率可检测(). 这些观察结果与有关A.肿瘤病毒蛋白，其中分泌信号定位于底物的C端(20，23).
圆点基底的识别/Icm运输车。由于易位蛋白LidA和RalF可以在细菌间转移，因此我们使用细菌易位试验来鉴定由该转运体转移的蛋白质。为了简化随机生成的融合库的筛选，我们选择通过预选的候选底物池进行筛选。我们假设一些易位底物可能与Dot/Icm复合物的特定成分相互作用。因此，细菌双杂交筛选(15)用于识别嗜肺军团菌与RalF羧基部分特异性相互作用的蛋白质。从41个测序阳性克隆中，DotF被预测为Dot/Icm复合体的内膜成分，被独立鉴定了9次。有趣的是，在所有情况下，只获得了跨氨基酸28-123的DotF部分。全长DotF也给出了一个正的双混合读数，尽管读数略低(). 然后，通过使用Cya融合蛋白进行细菌双杂交研究嗜肺军团菌DotF或其衍生物DotF的基因和诱饵（28–123）。从≈150000个候选基因中，我们分离出148个表现出高于背景水平的相互作用的克隆，并对这些克隆进行了测序和分析。尽管很明显，一些菌株几乎没有检测到β-半乳糖苷酶活性，而且其意义值得怀疑，但这种策略大大减少了需要分析的菌株数量。这些基因的完整ORF从嗜肺军团菌基因组数据库(http://genome3.cpmc.columbia.edu/~军团)共鉴定出68个基因。在这些基因中，有20个候选基因被剔除，主要是因为它们的高疏水性，这可能导致了与DotF的非特异性相互作用。随后对48个候选基因进行了细菌间转移测试（参见表2，该表作为PNAS网站上的支持信息发布，以获取来自单个实验的17个候选基因的数据）。显示了八个克隆体通过使用Cre发出阳性信号/液氧磷报告系统。我们将这些蛋白质指定为Icm/Dot转运蛋白（Sid）的底物(). 细菌间转移的效率不同，从10–6到10–5每个输入供体细胞的激发剂。此外，所有这些蛋白质的转移都依赖于Dot/Icm装置，因为与点A–表达这些融合的菌株未能导致去除漂浮的DNA片段并随后表达卡那霉素抗性标记().
DotF与RalF和SidC的C末端之间的相互作用。大肠杆菌菌株BTH101(14)将含有所示质粒的培养物在28°C的LB中培养过夜，并在含有100 nM IPTG的相同培养基中稀释20倍。培养物培养14小时，然后取出适当体积进行β-半乳糖苷酶分析。测试菌株如下：（A列）BTH101（pKT25dotF，pUT18C）；（B列）BTH101（pKT25，pUT18CRalF（C））；（C列）BTH101（pKT25dotF，pUT18CRalF（C）；（D列）BTH101（pDotF（28–123），pKT25RalF（C）；（E列）BTH101[pDotF（28-123），pSidC300（C）]k；和（F列）酵母GCN4蛋白的亮氨酸拉链结构域(14)作为BTH101（pKT25Zip，pUT18CZip）的阳性对照。β-半乳糖苷酶活性以Miller单位表示。实验分三次进行，每次独立进行三次。所示数据来自一个具有代表性的实验。
表1。
嗜肺军团菌本研究中通过Dot/Icm系统在细菌细胞间转位的蛋白质
sid基因的特征。序列分析表明，除了sidB公司，的侧面基因库NR数据库中没有显著的直向同源物(). SidB含有一个在一些脂肪酶中发现的假定活性位点，并且显示出一个类似于来自霍乱弧菌(24). 相比之下，这些蛋白质中的许多在嗜肺军团菌基因组(). Paralog之间的相似性来自几乎相同的预测蛋白质(E类=0）到相当松散的相似性(E类= 5e（电子）–2至2e（电子）–8;). 有趣的是，在某些情况下，Paralog的子集被组织成连续的ORF。例如，sidC公司及其同系物sdcA公司仅相隔150个碱基对，而sdeA、sdeB、和sdeC公司紧密聚集在一起(). 此外侧线E(sdeD公司)位于操作子编码的上游sidC公司(). 有趣的是，两个假定的基因orf1和orf3位于sidA公司和sdeC公司地区非常相似(E类= 0;)虽然这些基因在最初的双杂交试验中没有被鉴定出来。
的群集侧面基因，它们进入操作类结构的并行，以及sidC公司.(一个)sidC公司及其同系物sdcA公司只有150 bp的间隔，这两个基因与侧线E(sdeD公司). (B类)的三个旁系侧线E是包含五个重要ORF的染色体相邻区域的一部分。(C类)生长阶段调节sidC公司.细菌在AYE肉汤中培养至任一OD600=1.8（指数）或3.7（指数后），采集并通过SDS/PAGE和亲和纯化抗（His）免疫印迹分析6-SidC公司。显示Lp02(点/国际货币基金组织完整的；裁判。11)，Lp03(dotA公司–; 裁判。12)和Lp02（ΔsdcA公司，ΔsidC公司)，删除了Lp02导数sidC公司及其上游段。异柠檬酸脱氢酶（ICDH）蛋白通过检测针对枯草杆菌ICDH公司。
SidC被点转换/进入宿主细胞的细胞质。为了验证在我们的检测中鉴定的蛋白质是否转移到哺乳动物细胞中，亲和纯化的抗His抗体6-SidC用于分析SidC的表达和易位嗜肺军团菌如预测的那样，在两个样本中都检测到≈110 kDa的蛋白质点/国际货币基金组织+应变和adotA公司–的突变体嗜肺军团菌，但不是在缺失的突变体中sidC公司和它的paralogsdcA公司[Δ（sdcA-sidC）](). 此外，在生长到指数期后的细胞中，SidC的表达被诱导≈7倍(). 易位底物RalF和LidA也在指数期后表现出诱导表达（参考文献。9以及G.M.Conover和R.R.I.，未发表的观察结果），大量证据表明嗜肺军团菌受到类似监管(25，26). 当感染的巨噬细胞通过间接免疫荧光显微镜检测SidC时，我们发现摄取后1 h，约为86%嗜肺军团菌吞噬体SidC染色阳性()，蛋白质定位在吞噬体膜上(). 在某些情况下，来自吞噬体表面的蛋白质存在不对称扩散，大多数感染细胞仅在吞噬体附近区域显示蛋白质().
SidC被嗜肺军团菌Dot/Icm系统与宿主细胞相连，位于吞噬体膜附近。(一个)A/J小鼠骨髓源性巨噬细胞感染Lp02(点/国际货币基金组织完整），Lp03(dotA公司–)或分别表达GFP的Lp02（ΔsdcA-ΔsidC）菌株。感染后一小时，细胞按规定固定(10)SidC被反（His）调查6-SidC抗体和德克萨斯州红色标记的二级抗体。通过计数抗-（His）阳性染色的吞噬体，对染色巨噬细胞的SidC易位进行评分6-SidC公司。所示数据来自两个独立的实验，共进行了三次，其中每个盖玻片至少有100个吞噬体得分。(B类)PNS上的SidC染色嗜肺军团菌-感染U937细胞时没有通透性。样品制备、免疫染色和数据收集如参考文献所述。10或在中一个(C类)SidC的DotA依赖性易位。(左侧)表达GFP的细菌与骨髓源性巨噬细胞相关。所用菌株为Lp02(点/国际货币基金组织完整的；上部)和Lp03(dotA公司–;下部). (居中)抗（His）感染细胞的免疫检测6-SidC公司。(对)GFP和anti-（His）的合并图像6-SidC染色。(D类)SidC的有限扩散嗜肺军团菌吞噬体。所示为Lp02的图像(点/国际货币基金组织完整）用小鼠骨来源的巨噬细胞。(E类)SidC跨吞噬体膜转运。所示为Lp02的PNS图像(点/国际货币基金组织完整）-受感染的巨噬细胞。细菌和SidC如上所述进行检测，细菌标记为GFP，抗SidC标记为红色。
由于上述策略仅检测SidC的分泌，而不显示吞噬体膜的易位，因此采用了第二种方法(10). 为了证明SidC通过Dot/Icm转运体跨吞噬体膜转位，我们从培养的巨噬细胞中制备了核后上清液（PNS）嗜肺军团菌并在不存在透化试剂的情况下探测完整的吞噬体中的SidC。约85%的吞噬体对SidC呈阳性染色()而<5%的抗体呈阳性染色-嗜肺军团菌血清，证明吞噬体膜完整。少于0.3%的巨噬细胞含有嗜肺乳酸杆菌dotA–SidC阳性菌株染色()，这与我们的数据一致，该蛋白的细菌间易位需要Dot/Icm装置。同样，在PNS中，没有包含dotA公司–SidC阳性菌株染色(). 抗体反应是特异性的，因为没有巨噬细胞携带缺乏sidC公司并且其上游旁系对该蛋白呈阳性染色[; Δ（sdcA-sidC）]，巨噬细胞也没有感染sidC公司（未显示数据）。这些结果表明，在感染期间，SidC通过Dot/Icm系统转位到哺乳动物细胞中，并且转位发生在吞噬体膜上。因为Cre中其他蛋白质的转移频率/液氧磷系统与SidC相似，我们假设这些蛋白也通过Dot/Icm转运体靶向宿主细胞。
嗜肺杆菌高效细胞内生长需要SdeC。为了检验Sid蛋白在嗜肺军团菌发病机制，我们在其中一些基因中构建了框架内缺失，并测试了骨髓源性巨噬细胞细胞内生长的突变体(10). 单个删除sidA、sidD、sidF，或侧线G，在可用的嗜肺军团菌数据库中，产生了难以与野生型菌株区分的具有细胞内生长特性的菌株。此外，一个缺乏sidC公司及其上游paralogsdcA公司熟练增长（数据未显示）。最后，一个四倍突变缺乏sidB公司并且它的三个同系物在细胞内生长方面有缺陷，但这一结果与缺失的突变体没有显著差异sdbA公司单独（数据未显示），表明功能冗余超出了特定的基质家族。然后，我们构建了缺乏以下个体同源序列的帧内缺失突变体sidE公司并检测了这些突变体在骨髓衍生或D.盘状体。出乎意料的是，只删除了单个paralogsdeC公司有明显的生长缺陷(). 在D.盘状体，通过使用嗜肺军团菌携带质粒载体的菌株，培养48小时后活菌计数的产量因缺乏突变而降低了3倍sdeC公司(). 缺陷生长可通过含有sdeC公司(). 在巨噬细胞中也观察到这种突变的类似生长缺陷（数据未显示）。相反，突变体缺失侧面E，sdeA，或标准设计数据库分别在骨髓源性巨噬细胞中没有可检测到的生长缺陷（数据未显示）。正如预期的那样，在细菌细胞之间发现了Cre:：SdeC融合().
sdeC公司是有效细胞内生长所必需的。D.盘状体细胞感染了0.05倍的感染，并按所述监测了细菌的生长(13). 在指定的时间从单个微孔中清洗细菌细胞总数，并将适当的稀释液涂敷在木炭酵母抽提物平板上，以获得菌落形成单位。生长倍数是通过将给定时间点的克隆形成单位除以输入的细菌细胞数得到的。测试应变如下：黑条，Lp02（完好点/国际货币基金组织); 灰色条，Lp02（ΔsdeC公司); 条纹条，Lp02（ΔsdeC公司)承载ORF的pZL192安全数据中心。所示数据来自两个独立的实验，一式三份。
讨论
通过使用cre公司/液氧磷系统中，我们最终证明了Dot/Icm TFSS转运体可以对已知靶向哺乳动物细胞的蛋白质进行细菌间转移，我们利用这一观察结果鉴定了大量易位蛋白质。我们鉴定的大多数蛋白质在数据库中没有显著的同源序列，这表明嗜肺军团菌复制室可能涉及不同于其他生物体的机制，例如沙眼衣原体和分枝杆菌属spp.，位于类似的细胞内液泡中。或者，在不同微生物物种中具有相似功能的蛋白质可能彼此独立进化，彼此之间的序列相似性很小。许多易位的蛋白质在体内有平行排列嗜肺军团菌，通常编码在Dot/Icm易位底物表达的染色体区域(). 这些基因可能已经被组织起来，以确保在暴露于最适合启动细胞内生长的环境条件期间的适当表达。
细胞内缺乏生长缺陷嗜肺军团菌缺少易位底物的突变体让人联想到嗜肺乳酸杆菌突变体，在细胞内生长方面与亲本野生型菌株没有区别(9). 尽管如此拉尔夫突变体无法将Arf1募集到复制吞噬体的表面，这一特性可能在生物体的生活方式中发挥一些未知的作用(27). 消除此处确定的一些基因可能会导致吞噬体的形成，吞噬体的形态或宿主蛋白含量发生变化，而这些变化对培养细胞的生长几乎没有影响。或者，这些蛋白质发挥的作用可能被Dot/Icm的其他底物取代，或者这些蛋白质中的一些可能对某些未测试的宿主细胞的生长很重要。
细菌病原体编码许多效应器是很常见的，但在同一生物体中，只偶尔会发现特定易位效应器的多个副作用(28–30). 一个家族中蛋白质之间的密切相似性表明存在功能冗余，这可能解释了以前在细胞内生长缺陷细菌突变体的基因筛查中未能识别这些蛋白质的原因。如果是sidB公司然而，家族的功能冗余明显超出了已识别的同源序列，序列或功能上几乎没有相似性的蛋白质可能是冗余的。每一个旁系可能只适合于促进特定宿主细胞的生长，这是有道理的。因为嗜肺军团菌作为一种与环境中非常多样的宿主相互作用的多功能病原体，建立成功的细胞内复制生态位可能只需要易位底物的一个子集，其中一个子集适用于特定的宿主细胞类型。
从细胞内复制所需的易位蛋白中筛选出最少的补体将是未来的挑战，因为根据除了原Cre中确定的基因产物之外/液氧磷化验和sdeC公司，我们已经测试了四种Sid蛋白的副产物，用于细菌间转移，所有副产物都能促进Cre的转移（数据未显示）。基于这一发现，我们推测可能所有的Paralog都有易位的能力。此外，在另一项研究中，我们发现了另外一个可以转移的四种蛋白质家族（S.M.VanRheenen、Z.-Q.L.和R.R.I.，未发表的结果）。总之，这使得由嗜肺军团菌至24。事实上，可能还有更多的蛋白质被Dot/Icm转位，因为DotF相互作用屏幕没有达到饱和。基因库需要框架内融合到绍3AI限制位点，可能并不存在于编码易位底物的所有基因中。此外，这里描述的屏幕只关注DotF相互作用子的子集，在本试验中，似乎并非所有易位底物都能以可检测的水平结合DotF。
这里发现的Dot/Icm易位系统的另一个显著特征是易位的蛋白质体积大。本研究中确定的许多蛋白质>90kDa，其中一个预测>240kDa。似乎TFSS已经进化为运输大分子，如DNA-蛋白质复合物，这些转移系统可能是高分子量底物的首选转运体。
总之嗜肺军团菌TFSS是一种具有惊人灵活性的运输系统。它能够促进细菌结合和蛋白质从细菌转移到哺乳动物细胞，以及在细菌菌株之间运输这些相同的蛋白质。虽然细菌间蛋白质转移的效率似乎比从细菌转移到巨噬细胞的效率低很多个数量级(和图。和)，该属性允许我们识别Dot/Icm系统的基板。了解这些蛋白质的功能应该有助于阐明嗜肺军团菌-复制吞噬体。最后，我们在这里描述的方法可以推广到识别所有TFSS转移的哺乳动物效应器。
致谢
我们感谢M.Tang在蛋白质纯化方面的协助；S.Farrand、D.Ladant、A.Vergunst和J.Vogel提供质粒；伊斯伯格实验室进行有益的讨论；以及Carol Kumamoto博士、Michael Malamy、Susan VanRheeven、Marion Shonn、Isabelle Derre和Matthias Machner博士审查文本。这项工作得到了霍华德·休斯医学研究所的支持。Z.-Q.L.是霍华德·休斯医学研究所生命科学研究基金会研究员，R.R.I.是霍瓦德·休斯医疗研究所研究员。
笔记
本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。
缩写：TFSS，IV型分泌系统；Sid，Icm/Dot转运体基底。
数据保存：本文中报告的序列已保存在GenBank数据库中（登录号AY504668–AY504485）。
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