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比较研究
.2000年11月1日；19(21):5720-8.
doi:10.1093/emboj/19.21.5720。

LC3是酵母Apg8p的哺乳动物同源物，加工后定位于自噬体膜

Y卡贝亚 1, 北水岛, 上野县, 山本, 基里萨科, T野田佳彦, E科米纳米, Y Ohsumi先生, T吉森
附属公司
比较研究

LC3是酵母Apg8p的哺乳动物同源物，加工后定位于自噬体膜

Y卡贝亚等。 欧洲工商管理硕士J. .

勘误表in

  • EMBO J.2003年9月1日；22(17):4577

摘要

关于哺乳动物细胞自噬体膜的蛋白质成分知之甚少。在这里，我们证明大鼠微管相关蛋白1轻链3（LC3）是酵母自噬所必需的Apg8p的同源物，与加工后的自噬体膜相关。两种形式的LC3，称为LC3-I和-II，在不同的细胞中翻译后产生。LC3-I是胞质的，而LC3-II是膜结合的。从饥饿大鼠肝脏制备的自噬空泡部分富含LC3-II。LC3的免疫电镜显示，除了细胞质标记外，还对自噬体膜进行了特异性标记。LC3-II在自噬体内外均存在。突变分析表明，LC3-I是通过从新合成的LC3中去除C末端22个氨基酸，然后将LC3-I的一部分转化为LC3-II而形成的。LC3-II的数量与自噬体形成的程度相关。LC3-II是第一个与自噬体膜特异相关的哺乳动物蛋白。

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数字

无
图1。细胞内不同位置产生并发现两种形式的LC3。(A类)用抗LC3多肽抗体对大鼠脑（左车道）和PC12细胞（右车道）的裂解液进行免疫印迹分析。(B类)将由饥饿的HeLa细胞（T）制备的细胞匀浆通过在100000下离心分离成上清液（S）和沉淀（P）克使用LC3、醛缩酶（细胞溶质标记物）和转铁蛋白受体（膜蛋白标记物）抗体进行免疫印迹分析。分别在（A）和（B）中使用15%和12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
无
图2。LC3-II富含自噬液泡组分。如材料和方法所述，从饥饿的大鼠肝脏中获得亚细胞器组分。使用LC3抗体（顶部面板）和每个细胞器标记抗体（底部六个面板）对每个部分进行免疫印迹分析。PC12，PC12细胞的总裂解物，作为LC3-I和LC3-II位置的对照；饥饿大鼠肝脏的总裂解物；PNS，其核后上清液。线粒体的标记物是CPS（氨甲酰磷酸合成酶1）；内体/溶酶体的lgp 120；质膜Na/K-ATP酶；胞浆醛缩酶；内质网的核黄素；高尔基复合体的58K蛋白。
无
图3。除了细胞质外，LC3还与自噬体膜有关。(A类–E类)转染GFP–LC3的HeLa细胞在37°C和10 mg/ml HRP存在下培养8 h，并在37°CHanks溶液中培养60 min。细胞固定并用DAB染色以检测内吞HRP。然后，用抗GFP抗体的银增强免疫金电镜检查GFP–LC3在细胞中的定位。（A–E）中的箭头和箭头分别表示自噬体和含有HRP的自溶体。棒材，1µm。(F类和G公司)ES细胞在37°C的Hanks溶液中培养1h并固定。使用针对LC3的抗体通过银增强免疫金电子显微镜检查内源性LC3的定位。开放箭头和闭合箭头分别表示LC3与自噬体的内膜和外膜相关。棒材，1µm。
无
图4。GFP–LC3不与巴非霉素a中溶酶体蛋白lamp1共定位1-饥饿条件下处理的细胞。将转染GFP–LC3的HeLa细胞在37°C下在含有0.1µM巴非霉素A的Hanks溶液中培养90分钟1用lamp1抗体和罗丹明结合的第二抗体进行免疫荧光共聚焦显微镜分析。(A类)GFP–LC3标签(B类)lamp1染色和(C类)示出了相同场的合并图像。棒材，10µm。
无
图5。LC3-II分布于孤立的自噬液泡内外。从饥饿的大鼠肝脏中获得自噬空泡部分，并在0°C下在0.8 mg/ml蛋白酶E不存在（第1道）或存在（第2道和第3道）的情况下培养40分钟。在3号通道中，还增加了0.2%的Triton X-100。用LC3或BHMT抗体对样本进行免疫印迹，以检测LC3-II和BHMT的p44亚单位（自噬性货物标记物）。
无
图6。LC3的翻译后处理。(A类)LC3及其同系物C末端片段的氨基酸序列比对。与LC3相同的残留物用黑色阴影表示。雷诺数，褐家鼠; Hs、，智人; 理科，酿酒酵母; 在，拟南芥; 总工程师，秀丽隐杆线虫; 磅，双色拉卡菌从EST克隆（au96a10.y1）推导出HsLC3的序列。(B类)（C）中使用的蛋白质的结构。显示了N端的Myc表位标签、C端的HA表位标签和假设的裂解位点Gly120残基。建造LC3G120A型，LC3中引入了一个单点突变，导致氨基酸在120位从甘氨酸替换为丙氨酸。构建LC3ΔC22，22个C末端残基被PCR删除。生命周期3ΔC22、G120A也通过LC3的定点突变产生ΔC22ΔC22突变体仅在N-teminus用Myc表位标记。(C类)HeLa细胞瞬时转染Myc-LC3-HA（1-3区和13-15区）、Myc-LC3G120A型-HA（4-6车道和16-18车道）、Myc-LC3ΔC22（泳道7-9）或Myc-LC3ΔC22、G120A（10–12车道）。细胞被标记为[35S] 蛋氨酸/半胱氨酸4分钟，在37°C下追逐0、6和90分钟。细胞裂解物用抗Myc表位抗体（1-12道）或抗HA表位抗体进行免疫沉淀（13-18道），免疫沉淀用SDS-PAGE和生物图像分析仪进行分析。
无
图7。LC3-II数量的变化对应于自噬体的形成。(A类)HeLa细胞在37°C下，在含有以下试剂的10%FCS/DMEM（通道1）或Hanks溶液（通道2-6）中培养90分钟：1%二甲基亚砜（对照，通道1和2）；0.1µM沃特曼（车道3）；10 mM 3-甲基腺嘌呤（车道4）；0.1µM巴非霉素A1（车道5）；和50µM长春碱（车道6）。在另一个实验中，HeLa细胞在37°C的温度下在10%FCS/DMEM（第7道）或Hanks溶液（第8道）中培养120分钟，然后在10%FCS/DMEM中再培养120分钟（第9道）。孵育后，用LC3抗体对细胞进行裂解和免疫印迹分析。展示了用重复的盘子重复两次的典型实验。(B类)HeLa细胞（带实线的方形开口细胞）和ES细胞（带虚线的圆形开口细胞）在Hanks溶液中孵育指定时间，并使用LC3抗体对部分细胞进行免疫印迹。通过密度测定法（左纵轴）定量LC3-II的量。剩余的HeLa细胞用2.5%戊二醛固定，用于常规电子显微镜检查。在电子显微照片上测量自噬体/自溶体切片的面积，并以条形（右纵轴）表示。(C类)瞬时转染Myc-LC3的HeLa细胞在10%FCS/DMEM（a）或Hanks溶液（b）中37°C培养90分钟。使用抗Myc表位抗体和罗丹明结合二级抗体将细胞固定并渗透用于免疫荧光共聚焦显微镜。棒材，20µm。
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