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.1999年9月；73(9):7641-57.
doi:10.1128/JVI.73.9.7641-7657.1999。

小鼠肝炎病毒非结构蛋白的定位和RNA合成表明晚期内体在病毒复制中的作用

Y van der Meer先生 1, E J斯奈德, J C多布, S Schleich公司, M R丹尼森, W J西班牙, J K更衣室
附属公司

小鼠肝炎病毒非结构蛋白的定位和RNA合成表明晚期内体在病毒复制中的作用

Y van der Meer先生等。 J维罗尔. 1999年9月.

摘要

本研究的目的是确定冠状病毒小鼠肝炎病毒（MHV）的复制位点。针对来自基因1多聚蛋白的几种蛋白的抗体，包括3C-like蛋白酶（3CLpro）、假定聚合酶（POL）、解旋酶和最近描述的来自开放阅读框1a蛋白（CT1a）C末端的蛋白（p22），用于通过间接免疫荧光（IF）探测MHV感染细胞和电子显微镜（EM）。在感染早期，所有这些蛋白都通过IF显示出明显的点状标记。核衣壳蛋白抗体也显示出点状标记，主要与复制酶蛋白共定位。当用5-溴尿苷5'-三磷酸（BrUTP）对感染细胞进行代谢标记时，IF显示病毒RNA合成的位点与CT1a和3CLpro共定位。如EM所示，CT1a定位于LAMP-1阳性的晚期内体/溶酶体，而POL主要聚集在多层结构中，并出现内吞载体小泡。这些后一种结构也在一定程度上标记有抗CT1a和LAMP-1抗体，并可填充液相内吞示踪剂。当EM用于确定BrUTP在感染早期并入病毒RNA的位点时，病毒RNA也定位于晚期内胚体膜。这些结果表明，MHV复制发生在晚期内胚体膜上，来自基因1多聚蛋白的几个非结构蛋白可能参与病毒复制复合物的形成和功能。

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数字

图1
图1
冠状病毒基因1的表达和处理。基因1的示意图显示了ORF1a和ORF1b的组织结构，包括许多重要的结构域：木瓜蛋白酶样蛋白酶1（PLP-1）、3C样蛋白酶（3CLpro）、疏水结构域（MP1和MP2）、RNA依赖性RNA聚合酶（Pol）和解旋酶（Hel）。箭头表示MHV-A59中PLP-1和3CLpro确认的（黑色）或预测的（白色）劈理。示意图下方的黑线表示用于提高本研究中所用抗体的蛋白质序列的位置。这些是合成肽（3CLpro、Pol和Hel）或表达为细菌融合蛋白（抗CT1a）的一部分。
图2
图2
对固定在5（A、C、E和G组）和7（B、D、F和H组）H p.i.的MHV感染细胞中的非结构蛋白进行间接IF分析。固定细胞用抗3CLpro（96.6；A和B）、抗CT1a（C和D）、抗POL（778；E和F）和抗HEL（96.8；G和H）标记。
图3
图3
用复制酶抗血清3CLpro（B）和POL（D）在p.i.5 h时对MHV N蛋白（A和C）进行IF双重标记。分别在A和B组中对N和3CLpro的标记在很大程度上重叠。面板C和D显示了N和POL的双重标记，也清楚地显示了同位化。
图4
图4
LAMP-2（A和C）、晚期内体和溶酶体的标记物以及MHV复制酶蛋白CT1a（B）和POL（D）的IF双重标记。LAMP-2（A）和CT1a（B）之间存在大量重叠。在面板C和D中，标记最鲜明的LAMP-2（C）阳性斑点显示与POL共定位，而POL血清也标记LAMP-2阴性结构。
图5
图5
EM显示CT1a的定位。将感染MHV的细胞固定在5（B和C）和7（A）h p.i.，并用CT1a抗体（箭头）标记解冻冰冻切片。在面板A中，请注意具有多泡外观的结构上的广泛标记（星形）。在面板B中，CT1a阳性膜连接到液泡结构（星形），其周围的膜也标记较弱（箭头）。图C显示了CT1a阳性（箭头）多泡膜（星形）的另一侧面。注意细胞外部被CT1a显著标记的膜结构（大箭头）（箭头）。P、 质膜。棒材，100 nm。
图6
图6
用CT1a和LAMP-1以及内化16-nm金-牛血清白蛋白对MHV感染细胞进行双重标记。图A显示了以5h p.i.固定并用CT1a（小箭头，5-nm金）和LAMP1（箭头，10-nm金）双重标记的MHV感染的细胞的冰冻切片。在这个特殊的剖面图中，CT1a阳性膜非常接近质膜（P）。B组显示L细胞内充满16纳米金-BSA（大箭头），在MHV感染前一夜被追逐到晚期内体/溶酶体中。细胞在p.i.5 h固定，并用CT1a抗体（箭头，10-nm金）双重标记。棒材，100 nm。
图7
图7
通过电镜观察RNA依赖性RNA聚合酶的定位。将MHV感染的L细胞解冻冷冻切片固定在5 h p.i.，并用抗POL血清（箭头，10-nm金）标记。请注意面板A中的两个多层结构，一个强烈标记为POL（箭头），另一个没有标记（星形）。在面板B中，可以在内部（星形）看到一个强标记的POL（10-nm金，箭头）阳性结构，而在细胞外部可以看到另一个标记的膜结构（大箭头）。在C组中，POL阳性膜显然正在从质膜（P）分泌（大箭头）。在面板D中，MHV感染细胞在下午5小时固定前30分钟内填充5-nm金-BSA。POL阳性膜（10-nm金，箭头）明显填充5-nm黄金-BSA（小箭头）。棒材，100 nm。
图8
图8
用POL和CT1a双重标记MHV感染细胞。将感染MHV的细胞固定在p.i.5 h，冰冻切片用POL（5-nm金，小箭头）和CT1a（10-nm金，箭头）抗体双重标记。在面板A中，几个膜结构显示两个标记的共定位。在面板B和面板C中，对POL标记较多的典型多层膜结构也在一定程度上标记为CT1a。面板D显示了标记为POL和CT1a的配置文件（也包含16-nm金–BSA），该配置文件似乎正在退出电池。P、 质膜。棒，100纳米。
图9
图9
用POL和LAMP-1对感染MHV的细胞进行双向标记。面板A显示了标记POL（10-nm黄金，箭头）和LAMP-1（5-nm黄金，小箭头）的几个结构。面板B显示了LAMP-1（10-nm金色，箭头）的广泛标记区域，该区域也在一定程度上标记了POL（5-nm金色，小箭头）。特别注意右下角的膜结构（小星星），其中LAMP-1阳性膜似乎围绕着标记有大量POL的膜。在面板C中，可以看到标有LAMP-1的类似区域（10-nm金色箭头）。一个强标记的POL（5纳米金，小箭头）多层结构似乎被LAMP-1阳性膜包围。棒材，100 nm。
图10
图10
通过IF观察BrUTP在MHV感染细胞中的定位。BrUTP（A和C）和复制酶抗血清3CLpro（B）和CT1a（D）的双重标记。感染MHV的细胞在5h p.i.转染BrUTP，1h后固定。在面板A和B中，显示了BrUTP和3CLpro的标签。面板C和D代表BrUTP和CT1a的双重标签。在两个双层标签中，亮点明显重叠。
图11
图11
如EM.L细胞所示，用16nm金–BSA填充BrUTP定位2小时，随后将其整夜追赶至晚期内体/溶酶体。这些细胞感染了MHV，在每次4小时用BrUTP标记，1小时后固定，并准备冷冻切片。在面板A和B中，可以看到两个罕见的BrUTP标签轮廓。面板A显示了一个POL（5-nm金，小箭头）-阳性结构，在一定程度上用抗BrUTP（10-nm金，箭头）标记，而在面板B中，内部化的16-nm金-BSA（大箭头）聚集的隔间用CT1a（10-nm黄金，箭头）和抗-BrUTP（5-nm黄金，小箭头）标记。面板C和D显示了BrUTP标签的典型轮廓（用面板D中的大箭头标记）。附着在16nm金–BSA聚集的膜上的管状囊泡结构（大箭头）被强烈标记为抗BrUTP（面板C中的5-nm金，小箭头；面板D中的10-nm金箭头）。面板C中的CT1a（箭头，10-nm金）和面板D中的POL（小箭头，5-nm金）也在一定程度上标记这些BrUTP阳性膜。N、 核心。棒材，100 nm。
图12
图12
MHV感染细胞的冷冻切片，标记有BrUTP或抗N。面板A显示了抗POL（5纳米金，小箭头）和BrUTP（10纳米金）的双重标记。这张图片展示了一个罕见的BrUTP标签片段，每分钟5小时，典型的图案为每小时7小时（见正文）。BrUTP标记的斑块明显随机分布在细胞上，但偶尔与ER的细胞溶质侧和晚期内体（大箭头，16nm金）相关。还要注意POL和BrUTP在细胞某些区域的共定位。面板B和C显示了感染早期（每次5小时）N的标签（小箭头）。请注意，N标记与附着在16nm金-牛血清白蛋白（大箭头）晚期内体/溶酶体上的膜有明显的关联。P、 质膜；N、 核心。棒材，100 nm。
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