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.2001年10月;114(第20部分):3619-29。
doi:10.1242/jcs.114.20.3619。

一种研究自噬的新方法:氨基酸剥夺对自噬体空泡大小的调节

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一种研究自噬的新方法:氨基酸剥夺对自噬体空泡大小的调节

D B Munafó等。 细胞科学杂志. 2001年10月.

摘要

自噬是一种正常的降解途径,涉及细胞质部分和细胞内细胞器在称为自噬体的膜液泡中的螯合。这些小泡与溶酶体融合,隔离的物质被降解。由于自噬途径的复杂性以及外部探针的不可接近性,对高等真核细胞中调节自噬的分子机制知之甚少。我们使用自荧光药物单丹酰尸胺(MDC),一种特定的自噬体标记物,在分子水平上分析自噬过程中涉及的机制。我们开发了一种形态学和生化分析方法,以研究活细胞中基于MDC掺入的自噬性。通过该试验,我们观察到MDC的积累是由氨基酸剥夺引起的,并被3-甲基赖氨酸(自噬途径的经典抑制剂)抑制。此外,在早期阻断自噬的PI3-激酶抑制剂沃特曼抑制了MDC在自噬空泡中的积聚。我们还发现,用N-乙基马来酰亚胺(NEM)(一种已知可抑制多种囊泡转运事件的试剂)处理细胞时,完全阻断了MDC的掺入,表明形成自噬空泡需要NEM敏感蛋白。相反,长春碱是一种微管解聚剂,通过阻止自噬液泡的降解而诱导其积累,它增加了MDC的积累,并改变了自噬空泡的分布和大小。我们的结果表明,在长春碱存在下,主要在饥饿条件下积累了非常大的MDC空泡,表明氨基酸剥夺上调了自噬体的扩张。此外,这些MDC液泡被LC3标记,LC3是酵母蛋白Apg8/Aut7的哺乳动物同源物之一,在自噬体的形成中起着重要作用。

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