叶片衰老和饥饿诱导的黄化加速拟南芥自噬基因的破坏¹

的标识第9-1页，T-DNA插入突变体

研究自噬在高等医学中的生理作用植物，我们筛选了Kazusa DNA研究所（日本千叶）T-DNA插入线AtAPG公司突变体。用于分析自噬缺陷植物突变体AtAPG公司基因它们在基因组中以单个拷贝的形式存在是理想的。有了这些标准，拟南芥系携带T-DNA插入在APG9基因鉴定。

这个亚太地区G9cDNA包含假定的开放阅读框编码866个氨基酸的疏水性蛋白质。图​图3三显示了在拟南芥和其他生物体中发现的Apg9同源基因。我们注意到有一个高度保守的区域对应于AtAPG9Trp-206-Gly-549。酵母Apg9p被认为是一个完整的膜蛋白质(Noda等人，2000年)和APG9的亲水性分析正交测井显示，保守区与中部区域的多膜跨域（数据未显示）。另一方面，NH₂-和COOH端子亲水结构域在物种之间有些不同。基于关于预测的二级结构的相似性，AtAPG9是可能是酵母Apg9p的对应物。

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图3

AtAPG9及其同源序列的氨基酸比对。使用DNASTAR通过CLUSTAL V方法对每个蛋白质进行比对。符合共识的残留物以黑色阴影显示。At，拟南芥；Sc，酵母；总工程师，秀丽隐杆线虫; Dm，果蝇；和Hs，人类(智人).

携带T-DNA基因组的基因组PCR产物的测序连接显示T-DNA被插入第三内含子属于亚太地区G9而三分之一亚太地区G9迷路了并被T-DNA取代（图。​（图4A）。4A） ●●●●。这个抗生素耐药性的分离模式表明该品系携带单个T-DNA插入，这一假设得到了利用T-DNA插入的内部序列进行南方位点分析作为探针（未显示数据）。我们指定了这条线第9-1页.对亚太地区G9基因依据T-DNA插入第9-1页由进一步确认南部地块分析使用亚太地区G9作为探针（图。​（图4B）。这个4B） ●●●●。The band pattern of第9-1页与之完全不同属于野生型。每个测试的限制性内切酶表明亚太地区G9是一个拟南芥生态型Wassilewskija基因组中的单拷贝基因。于基因组测序项目完成，缺乏其他Apg9拟南芥生态型哥伦比亚基因组中的同源序列得到了确认。收件人调查器官亚太地区G9表示，我们使用器官特异性RNA样本进行RT-PCR。AtAPG9在所有测试的野生型器官中都检测到转录物：叶、茎、，花和根（图。​（图4C）。4C） 。然后我们从植物中制备蛋白质样品并试图通过以下方式查看AtAPG9的表达西部片分析。重组AtAPG9抗体的制备识别出47 kD的波段，比预测的要小得多大小为野生类型，但不在第9-1页（图。​（图4D）。4D） ●●●●。这个抗体在酵母中识别出预测大小（99 kD）的条带裂解物取决于亚太地区G9表达式（图。​（图4E），4E） ，因此AtAPG9在样品制备过程中，蛋白质可能容易降解。之后连续三次回交到野生型纯合子数据表9-1为了进一步研究，对植物进行了繁殖。

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图4

突变体的鉴定第9-1页。A、 基因组结构亚太地区G9基因。线条表示内含子和框表示外显子；白色方框，未翻译区域；和黑盒、转换区域。T-DNA插入位点第9-1页等位基因用灰色方框表示。B、，南部地块分析亚太地区G9基因。拟南芥野生型（WT）和第9-1页突变植物被消化了巴姆HI（Ba），Bgl公司II（Bg），或生态RV（E），并将该印迹与亚太地区G9探查。C、 的表达式亚太地区G9在里面各种器官。从花、叶、茎和野生植物的根系水培1个月。RT-PCR是使用基因特异性引物进行亚太地区G9和用于肌动蛋白行动2基因。琼脂糖电泳后，凝胶用溴化乙锭染色。D、 植物中AtAPG9的免疫印迹裂解物。从野生型植物（WT）和第9-1页突变植物在100,000克持续1h，将颗粒置于使用抗AtAPG9的免疫印迹。AtAPG9可能的降解产物为以星号为标记。E、 酵母裂解物中AtAPG9的免疫印迹。酵母总裂解物由酵母Δ制备第9页细胞或Δ第9页表达AtAPG9的细胞，如“材料和方法”AtAPG9（预测分子质量=99kD）由箭头指示。

年，黄化加速第9-1页以下工厂碳饥饿

我们观察到第9-1页在下面营养素缺乏的条件。作为我们实验结果的保证were the direct effect of null mutation of the亚太地区G9基因，我们改变了第9-1页野生型植物亚太地区G9，包括其自己的发起人。不亚太地区G9通过RT-PCR检测纯合子中的转录物第9-1页植物，以及亚太地区G9在突变体中恢复含有野生型的植物亚太地区G9转基因（图。​（图5A）。5A） ●●●●。第一，碳增长观察到饥饿。为了减少碳饥饿，种植了7天的幼苗16小时光/8小时暗循环的岩棉被转移到24小时黑暗条件。图​图5B5B展示了之后的植物照片8天的碳饥饿。这个第9-1页子叶变黄了，而野生型植物的颜色保持苍白绿色。叶绿素含量在转移到黑暗条件（图。​（图5C）。5C） 。每鲜重的叶绿素含量野生型和第9-1页d 0时的植物，这意味着叶绿素合成不受突变的影响。在野生型植物，叶绿素含量开始下降，并且在d10分，是起始水平的一半。然而在中进行得更快第9-1页植物。该表型为通过与野生型互补恢复亚太地区G9,表明AtAPG9在碳保存条件。

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图5

AtAPG9表达于第9-1页抑制碳或氮缺乏引起的黄化。A、 逆转录聚合酶链反应属于亚太地区G9基因。从野生植物叶片中分离出总RNA类型，第9-1页、和第9-1页用转换在APG9基因。RT-PCR采用基因特异性底漆亚太地区G9和肌动蛋白动作2基因。之后琼脂糖电泳，凝胶用溴化乙锭染色。B、 15天历史的碳减排工厂俯视图。拍摄了植物碳饥饿8d后。C、 时间进程分析叶绿素含量。植物以光周期生长7天16小时光亮/8小时黑暗，之后将其保持在黑暗。当天从两个子叶中提取叶绿素转移到连续黑暗后显示条件。D、 24天历史的含氮植物俯视图。植物生长在含有7米营养液的培养基中米硝酸盐作用10天，然后转移到氮完全（0米米硝酸盐）培养基和水培14 d.E，叶绿素含量的时间进程分析。叶绿素当天从第一和第二个玫瑰花结叶子中提取诱导缺氮后显示。所有测量值均为由至少三株植物制成。

在氮饥饿条件下，黄化加速，种子开始发芽年生产受到影响第9-1页植物

还分析了保氮条件下的生长情况。对于氮饥饿，营养培养基中生长的10-d龄幼苗（7米米硝酸盐）转移到缺氮培养基（0米米硝酸盐）。硝酸盐是本研究中使用的培养基。氮气14天后饥饿、黄化早在第9-1页植物比野生型植物（图。​（图5D）。5D） ●●●●。时间进程分析表明叶绿素降解速率第9-1页第一第二个莲座叶比野生型叶高20%（图。​（图55E） ●●●●。

种子生产第9-1页根据保氮条件。因此，第9-1页植物没有像野生植物那样多的种子保氮条件。如图所示​图6A，6A、 野生型植物能耐受成熟即使在第五朵花和第六朵花中也是如此，而大多数第9-1页植物不能。大多数第9-1页植物只产四朵花，因此，成熟西力克的平均数量每株突变株的数量少于野生型（图。​（图6B）。6B） ●●●●。因为众所周知，拟南芥在分生组织阻滞；因此，每只西力克的种子数可能会增加第9-1页生产与野生型相同数量的种子植物。所以，我们检查了每株植物的种子数量。的数量种子产生于第9-1页植物（19.5±4.8）低于野生型植物（25.8±5.8）。学生的t吨测试或Mann-Whitney’su个测试表明种子的数量第9-1页明显不同与野生型相比(P（P）< 0.05). 这些表型在表达转基因野生型的突变植物中恢复在APG9数据表9-1中显示了西力克的数量和每株种子的数量氮气保护条件。

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图6

AtAPG9缺乏会损害有效种子在保氮条件下生产。A、 代表2个月龄的植物在氮保护下水培生长条件。B、 每株生长在保氮条件为2个月。进行了所有测量在至少四个单独的植物上。

抽薹和叶片自然衰老加速第9-1页

提供典型的营养液，第9-1页在发芽、子叶发育、根系伸长和花序茎和种子生产。然而，螺栓连接数据表9-1加速（图。​（图7A）。7A） ●●●●。在四个独立的实验中，第9-1页总是早于2或3天开始抽薹野生型植物（图。​（图7B）。7B） ●●●●。当时的平均玫瑰花瓣叶数螺栓连接减少了第9-1页(9.2 ± 0.9)与野生型相比（11.4±1.0）。这朵早花通过表达转基因野生型挽救表型亚太地区G9在里面第9-1页植物。

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图7

的表型数据表9-1低于正常值条件。A、 26日龄植物侧视图。野生型和第9-1页植物在22°C下生长16小时光照/8-小时暗循环，提供标准营养液。B、，锚杆支护的时程分析。包含至少一种植物的植物数量每日统计初生花序茎长大于5mm。全部对至少13株植物进行了测量。C、 自然叶片衰老。野生型，第9-1页、和第9-1页用野生型转换亚太地区G9基因在标准条件下生长，并在第17天和第35天拍摄发芽后。还显示了放大视图。

玫瑰花叶第9-1页植物衰老早于野生型植物（图。​（图7C）。7C） ●●●●。第9-1页莲座叶在形态学上与野生型难以区分对应物在发芽后17天，但这些边缘树叶开始变黄第9-1页第35天的植物，而野生型的叶子仍然是绿色的。自然衰老第9-1页植物从旧的下叶到年轻的上叶，如野生型植物。

的克隆AtAPG公司基因

与酵母同源的基因(酵母菌属酿酒)APG公司在中搜索拟南芥生态型哥伦比亚EST和使用BLAST的基因组数据库程序。AtAPG公司cDNA序列由不同的方法。通过RT-PCR扩增预测的编码区对于在APG3,-4a类,-4b个,-7,-第8页a,-8b个,-第8页c,-8天,-第8页,-第8页,-8克,-8小时,-8英寸,-9,-第12页、和-第12页b。每个cDNA都是使用马拉松cDNA扩增试剂盒（CLONTECH，加利福尼亚州帕洛阿尔托）和亚克隆pBluescript SK+（加利福尼亚州拉霍拉市斯特拉赫纳）。然后每个cDNA测序，并将序列存入DNA数据库日本/国家生物技术信息中心/EMBLAtAPG1a公司,AtAPG5公司、和AtAPG6，cDNA序列之前由其他组。对于AtAPG1b公司,-1c个,-2,-10,-13年、和-13个，基于拟南芥基因组DNA序列与几种APG的比较来自其他生物的直系生物。剪接位点预测程序是也使用了。

T-DNA插入系的筛选

我们使用了在Kazusa DNA研究所。The principles of the筛选方法已经过描述(McKinney等人。，1995).亚太地区G9-用于筛选的特异性引物为5′-ATGAGCAGTGGGCATAGGTCCAAATG-3′和5′-tcaccgtaatgtgtgctgtgtgtg-3′。T-DNA特异性引物为5′-TAGATCCGAAACTATCAGTG-3′和5′-ATAACGCTGCGGACATCTAC-3′。我们使用四个引物组合，每个组合由一个基因特异性引物组成底漆和T-DNA专用底漆。T-DNA插入物的位置通过对携带T-DNA基因组的PCR产物进行测序确定交叉点。

南部地块分析

从野生型和突变拟南芥中提取的总基因组DNA用各种限制性内切酶消化遵循DIG系统标准协议的南方地块分析（罗氏诊断公司，东京）。地高辛标记亚太地区G9探针在42°C的5×SSC中与膜结合DNA杂交（20×SSC=3米氯化钠和0.3米钠柠檬酸盐），0.1%（w/v）N个-月桂酰丝氨酸，0.02%（w/v）SDS、1%（w/v）封闭试剂和50%（v/v）甲酰胺。在68°C、0.1×SSC和0.1%（w/v）条件下进行清洗SDS和印迹进行化学发光分析。

酵母互补性试验自动发电机组带有AtAPG公司基因

为了在酵母中表达AtAPG蛋白AtAPG公司基因插入酵母表达载体的GAP启动子下pKT10型(田中等人，1990年). 酵母菌株在标准富液培养基中培养培养基（酵母蛋白胨葡萄糖）或所述饥饿培养基以前(Noda等人，2000年). 酵母菌株用于补体试验如前所述(Kirisako等人。，2000).

酵母全细胞裂解物是通过在0.2中破碎细胞制备的米NaOH和1%（v/v）2-巯基乙醇。然后通过加入三氯乙酸沉淀蛋白质；和离心后，用冷丙酮清洗样品至9%（w/v）聚丙烯酰胺SDS-PAGE，并通过如前所述，使用抗API抗体进行免疫印迹(Noda等人2000年).

AtAPG9的Western印迹

通过以下方法制备抗His标记AtAPG9的抗-AtAPG9抗体家兔免疫，亲和力纯化。生成His-taggedAtAPG9是亚太地区G9cDNA片段编码C-末端247氨基酸由Hin公司dIII型消化。将该片段克隆到表达载体pET28b中（威斯康星州麦迪逊诺瓦根）消化了Hin公司d三。这个结果质粒pHH20在大肠杆菌属大肠杆菌，His-tagged AtAPG9重组蛋白通过镍柱。

酵母全细胞裂解物的制备方法与“酵母补体测试自动发电机组带有AtAPG公司基因。”

植物蛋白样品的制备如下：300 mg植物天线在0.6 mL提取缓冲液（50）中均质部分米米HEPES-KOH，pH 7.5，10 m米科威特石油公司，1米米乙二胺四乙酸（EDTA），0.4米吸力，1米米二硫苏糖醇，2 m米苯甲基磺酰氟，以及5%（v/v）植物蛋白酶抑制剂混合物（P-9599，Sigma，St。路易斯）。将裂解液在4°C，1000下离心克，用于10分钟。丢弃颗粒，然后将上清液4°C超离心，100000克，持续1小时用SDS-PAGE分析颗粒，然后进行免疫印迹。

RT-PCR分析亚太地区G9表达式

使用ISOGEN从每个样品中提取总RNA（日本基因，东京），并使用ProSTAR RT-PCR生成cDNA套件（Stratagene）遵循制造商的说明。对于PCR，亚太地区G9-特异性引物（5′-TTGGATCTTTTGTCGAAAGGCTCTAC-3′和5′-AAAG-CTGCAAACATGGCCTACACC-3′）和拟南芥肌动蛋白2-特异性引物（5′-ATGAAGATTAAGGTGTTGCACCACC-3′和使用5′-CTTATACATTG-CAAAGAGTTCAAGG-3′）。PCR反应对于AtAPG9，包括30个94°C循环30 s，56°C循环30秒，72°C持续90秒。

RT-PCR分析发送1和YSL4型表达式人工诱导衰老期间

使用CsCl步骤从每个样品中提取总RNA梯度(Chirgwin等人，1979年)，并使用ProSTAR RT-PCR套件（Stratagene）遵循制造商的说明。使用10微克总RNA作为模板。对于聚合酶链反应发送1-特异性引物（5′-ATCACGAATTGAAACTGG-3′和5′-CTTCCTCCATCGGAAG-3′）和YSL4型-特异性引物使用（5′-GCTCGTGTTGACAG-3′和5′-TGGAGAAGACTATAGAACC-3′）。这个的反应发送1（30个循环）和YSL4型（28个循环）包括94°C持续30秒，52°C持续30s，和72°C持续30 s。循环次数确定为确保PCR产物未饱和。

花的过渡时间分析

这些植物是用蛭石作为土壤在岩棉上生长的。花的过渡时间是指花序芽伸长至5毫米。

叶片衰老的人工诱导

3周龄植物的第三和第四个莲座叶被分离并漂浮在去离子水中的12孔培养皿中，正面朝上(Oh等人，1996年). 叶片在22°C下孵育黑暗中。

人工诱导衰老过程中的蛋白质分析

蛋白质从冷冻粉末材料中提取以下提取缓冲区：50 m米三氯化氢，pH 6.8，2%（w/v）SDS和10%（v/v）甘油。裂解物被煮沸10分钟，然后在4°C、15000 rpm下离心10分钟然后用BCA测量上清液的蛋白质浓度（二辛酸盐）酸性蛋白检测试剂盒（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）以牛血清白蛋白为标准。

叶绿素含量的测定

叶绿素是从新鲜子叶中提取出来的，或者首先提取第二朵玫瑰花瓣在4°C下与甲醇混合1天。提取物分别在625、647和664进行分光光度测量纳米。叶绿素含量使用Moran方程计算(莫兰，1982).

的补充测试第9-1页

这个亚太地区G9基因，包括上游3kb从起始密码子开始，通过PCR从基因组DNA中扩增，使用两个5′-ACCGCTCGAGTTTT-CAACTGGTTCCTC-3′和5′-GCGGATCCCCAGAGAGCATGATG-3′或5′-TTGGATCTTTTTGTCGAAAGGCTCTAC-3′和5′-AGTCGAGTCTCACCG-TAATGTGCTTGA-3′。第一个扩增片段，使用前一组引物获得，克隆到pBluescript中KS+消化生态右心室。结果质粒pHH34为用…消化Nde公司我和囊我和然后用第二个扩增片段连接Nde公司我/囊I.接下来Xho公司我-囊我的片段被克隆到二进制向量pBI121Δ35S，pBI121的导数(Hayashi等人。，2000). 将产生的质粒pHH38导入根癌农杆菌应变C58C1Rif^第页,然后用来转化拟南芥第9-1页花浸法纯合突变体(Clough和Bent，1998年). 卡那霉素鉴定转基因植物阻力。选择了7株T1植物，T2代为筛选为3:1（抗性：非抗性）分离。其中两个T3代植株对卡那霉素表现出100%的抗性，这些被选为纯合株系。纯合T3和T4植物用于以下生理实验。

用γ-TIP-GFP分析液泡形态

用携带γ-TIP-GFP的二元载体转化植物(Saito等人，2002年)与补充测试相同数据表9-1对T3纯合植物进行显微观察。玫瑰花结叶的近轴表皮细胞荧光激光扫描共焦显微镜观察（LSM510，蔡司，耶拿，德国）。

软件程序

使用该程序进行氨基酸序列比对Megalign（威斯康星州麦迪逊市DNASTAR）。进行亲水性分析使用Protean（DNASTAR）。

我们感谢Richard D.Vierstra博士和Jed H.Doelling博士在发布之前共享结果。我们感谢Masaaki Ohto博士，Tomoo Shimada博士、Kenji Yamada博士，Gyung-Tae Kim博士，Chieko博士斋藤和中野明彦博士热情提供植物材料，质粒和有用的技术说明。我们还要感谢Yuji博士Moriyasu、Takashi Okamoto博士和Kiminori Toyoka的帮助评论。