Disruption of cellular translational control by a viral truncated eukaryotic translation initiation factor 2alpha kinase homolog

doi:10.1073/pnas.95.8.4164

.1998年4月14日；95（8）：4164-9。

doi:10.1073/pnas.95.8.4164。

病毒截短真核翻译起始因子2alpha激酶同源物对细胞翻译控制的干扰

T E开发¹, R斯里普利亚, J R McLachlin公司, J Lu先生, J R费边, S R金宝, L K米勒

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病毒截短真核翻译起始因子2alpha激酶同源物对细胞翻译控制的干扰

T E开发等。美国国家科学院程序. 1998.

.1998年4月14日；95(8):4164-9.

doi:10.1073/pnas.95.8.4164。

作者

T E开发¹, R斯里普利亚, J R McLachlin公司, J Lu先生, J R费边, S R金宝, L K米勒

附属

¹美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家儿童健康与人类发展研究所真核基因调控实验室，邮编：20892-2716。tdever@box-t.nih.gov（邮箱）

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摘要

真核生物翻译起始因子2alpha（eIF2-alpha）的磷酸化是限制应激条件下蛋白质合成的常见细胞机制。杆状病毒PK2类似于蛋白激酶结构域的C末端一半，被发现可以抑制人类和酵母eIF2α激酶。感染野生型而非pk2缺失型杆状病毒的昆虫细胞表现出eIF2α磷酸化降低和翻译活性增加。人类蛋白激酶RNA-regulated（PKR）是一种eIF2α激酶，它对病毒产生的负调节作用被PK2抵消，表明杆状病毒已经进化出一种独特的策略来干扰宿主应激反应。在体内发现PK2与PKR复合并阻断激酶自身磷酸化，这表明激酶抑制机制是由截短的和完整的激酶结构域之间的相互作用介导的。

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数字

图1
野生型感染但未感染的昆虫细胞中eIF2α磷酸化降低*公钥2*-删除杆状病毒。(一个)PK2、PKR和GCN2蛋白的比较。激酶亚域（1，2）显示，ATP结合位点显示为方框。PKR[dsRNA-结合域（dsRNA-BD）]和GCN2[Histidl-tRNA合成酶样域（HisRS）]的调控域显示为浅阴影方框。GCN2-TK是GCN2的截短版本，大小与PK2相对应，仅包含GCN2激酶亚结构域V–XI（氨基酸779–996）；PKR的相应区域从氨基酸残基357延伸到551。(B类)昆虫细胞中eIF2α磷酸化的分析。感染野生型（L1）或*公钥2*-用IEF凝胶电泳分析缺失（vKINdel）杆状病毒或模拟感染（未感染）的杆状病毒，然后用eIF2α单克隆抗体进行免疫印迹。指出了磷酸化和非磷酸化eIF2α的迁移位置，并通过定量密度测定法测定了磷酸化eEF2α的百分比，显示在1–3车道下方。

图2
杆状病毒的表达*公钥2*减轻人类PKR和酵母GCN2激酶对酵母细胞生长的毒性作用。(一个)PK2对PKR的抑制。表达质粒*公钥2*在酵母的控制下*GAL-CYC1型*杂交启动子（pC201，*公钥2*)或将载体pEMBLyex4单独（载体）引入菌株H2544(垫子一*ura3–52 leu2–3，-112 trp1–63*〈*GAL-CYC1-PKR*/*LEU2级*（24）和转化子被复制到葡萄糖（SD）培养基中，其中PKR和*pk2型*表达被抑制，或半乳糖（SGal）培养基，其中PKR和*公钥2*诱导表达。将平板在30°C下培养2（SD）或3（SGal）天。(B类)抑制过度活跃*通用条款2*^c（c）等位基因。表达质粒*公钥2*（第C201页，*公钥2*)或*gcn2厚度*（第C203页，*gcn2-tk公司*)在*GAL-CYC1型*将杂交启动子或载体pEMBLyex4单独（载体）引入等基因垫子α*ura3–52 leu2–3，-112 ino1 HIS4-lacZ*表达野生型的菌株*通用条款2*（H1402）（40）或过度活跃*通用条款2*^c（c）*-E532K-E1522K型*（H1613）（31）。将转化物在葡萄糖（SD）或半乳糖（SGal）培养基上划线，并将平板在30°C下培养2（SD）或者4（SGal。

图3
酵母细胞中eIF2α磷酸化的抑制*公钥2*PK2与PKR共沉淀。(一个)eIF2α磷酸化分析。质粒编码*公钥2*或*gcn2-tk公司*或将空载体（v）引入表达野生型PKR的酵母菌株*GCN2型*，过度活跃*通用条款2*^c（c）*-E532K-E1522K型*(*通用条款2*^c（c）)，或没有eIF2α激酶(*通用条款2*)，如图所示。制备粗蛋白提取物，并在聚丙烯酰胺平板凝胶上进行IEF凝胶电泳，然后用酵母eIF2α特异性抗血清进行免疫印迹。如图所示，Ser-51上磷酸化的eIF2α聚焦于缺乏Ser-51磷酸化的蛋白质之上。Ser-51磷酸化的eIF2α百分比通过定量密度测定法测定，并在每条车道下方显示。(B类)PKR表达分析。（泳道1和2）PKR在图1所示菌株中的表达一个如图所示，通过免疫印迹50μg全细胞提取物并用酵母eIF2α特异性抗血清或人PKR单克隆抗体进行检测，对第1条和第2条通道进行分析。（通道3-5）如图所示，表达PKR、PK2或PKR-K296R的eIF2α-S51A酵母菌株的粗蛋白提取物在7.5%凝胶上进行SDS/PAGE，然后用人PKR单克隆抗体进行免疫印迹。如图所示，磷酸化形式的PKR（PKR*）迁移速度慢于非磷酸化形式（PKR）。与非活性PKR-K296R相比，野生型PKR在SDS/PAGE中的流动性较慢，这是由于野生型蛋白的广泛自磷酸化。用磷酸酶处理野生型PKR可增加其流动性，并使野生型PKR-K296R与非磷酸化PKR-K266R结合（参考P.Romano和A.Hinnebusch，个人通信）。(C)PKR和PK2的共沉淀。表达PKR-K296R（PKR）和c的酵母菌株的粗蛋白提取物-*myc公司*表位标记的*公钥2*如图所示，（PK2-myc）与结合蛋白A琼脂糖珠的抗PKR多克隆抗血清孵育；沉淀后，对起始材料（I）、颗粒（P）和上清液（S）的部分进行SDS/PAGE，然后用人PKR或c-myc单克隆抗体进行免疫印迹，如图所示。

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1. Hanks S K，Quinn A M，Hunter T.科学。1988;241:41–52.-公共医学
1. Hanks S K，Hunter T.FASEB J.1995；9:576–596.-公共医学
1. 克莱门斯·M·J·英：翻译控制。Hershey J W B、Mathews M B、Sonenberg N，编辑。纽约州普莱恩维尤：冷泉港实验室出版社；1996年，第139-172页。
1. Hinnebusch A G.Sem细胞生物学。1994;5:417–426.-公共医学
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[5] 克莱门斯·M·J·英：翻译控制。Hershey J W B、Mathews M B、Sonenberg N，编辑。纽约州普莱恩维尤：冷泉港实验室出版社；1996年，第139-172页。

[6] 克莱门斯·M·J·英：翻译控制。Hershey J W B、Mathews M B、Sonenberg N，编辑。纽约州普莱恩维尤：冷泉港实验室出版社；1996年，第139-172页。

[7] Hinnebusch A G.Sem细胞生物学。1994;5:417–426.-公共医学

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[9] Hinnebusch A G.In：翻译控制。Hershey J W B、Matthews M B、Sonenberg N，编辑。普莱恩维尤：冷泉港实验室出版社；1996年，第199-244页。

[10] Hinnebusch A G.In：翻译控制。Hershey J W B、Matthews M B、Sonenberg N，编辑。普莱恩维尤：冷泉港实验室出版社；1996年，第199-244页。

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