The gamma(1)34.5 protein of herpes simplex virus 1 complexes with protein phosphatase 1alpha to dephosphorylate the alpha subunit of the eukaryotic translation initiation factor 2 and preclude the shutoff of protein synthesis by double-stranded RNA-activated protein kinase

doi:10.1073/pnas.94.3.843

.1997年2月4日；94（3）：843-8。

doi:10.1073/pnas.94.3.843。

单纯疱疹病毒1的γ（1）34.5蛋白与蛋白磷酸酶1alpha复合，使真核翻译起始因子2的α亚基去磷酸化，并阻止双链RNA活化蛋白激酶阻断蛋白质合成

B他¹, M总, B罗伊兹曼

附属公司

PMID： 9023344
预防性维修识别码： 1996年1月
内政部： 10.1073/pnas.94.3.843

单纯疱疹病毒1的γ（1）34.5蛋白与蛋白磷酸酶1alpha复合，使真核翻译起始因子2的α亚基去磷酸化，并阻止双链RNA活化蛋白激酶阻断蛋白质合成

B他等。美国国家科学院程序. 1997.

.1997年2月4日；94(3):843-8.

doi:10.1073/pnas.94.3.843。

作者

B他¹, M总, B罗伊兹曼

附属

¹美国伊利诺伊州芝加哥大学马乔里·科夫勒病毒肿瘤实验室，邮编60637。

PMID： 9023344
预防性维修识别码： PMC19601型
内政部： 10.1073/pnas.94.3.843

摘要

在感染单纯疱疹病毒1的人类细胞中，双链RNA-依赖性蛋白激酶（PKR）被激活，但仅在感染γ（1）z34.5-突变体的细胞中观察到真核翻译起始因子2（eIF-2）α亚基磷酸化和蛋白质合成完全阻断。γ（1）34.5蛋白的羧基末端64 aa与MyD116、小鼠生长停滞和DNA损伤基因34（GADD34）蛋白的相应结构域同源，这两个结构域在感染细胞中功能上可以互换。本报告表明：（i）MyD116的羧基末端与酵母中的蛋白磷酸酶1alpha相互作用，MyD116和γ（1）34.5在体外与蛋白磷酸酶1 alpha交互作用；（ii）磷酸酶1抑制剂冈田酸强烈抑制感染细胞的蛋白质合成；和（iii）纯化的体外磷酸化eIF-2中的α亚单位被野生型感染细胞的S10组分特异性去磷酸化，去磷酸化率是模拟感染细胞的3000倍，而γ（1）34.5病毒感染细胞的eIF-2alpha-P磷酸酶活性低于模拟感染细胞。eIF-2alpha-P磷酸酶活性对抑制剂2敏感。与eIF-2alpha-P磷酸酶活性相反，模拟感染细胞的提取物在[32P]磷酸化酶上的磷酸酶活性是感染细胞提取物的2倍。这些结果表明，在感染细胞中，γ（1）34.5与磷酸酶相互作用，并将其重定向至去磷酸化eIF-2alpha，从而使蛋白合成得以持续，尽管存在活化的PKR。GADD34蛋白在真核细胞中可能具有类似的功能。针对双链RNA积累提出的蛋白质合成维持机制与迄今为止对病毒的描述不同。

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数字

图1
PP1α与γ的结合₁34.5和MyD116。(一个)在含有10mM Hepes（pH 7.6）、250mM NaCl、10mM MgCl的裂解缓冲液中收获复制的HeLa细胞培养物₂模拟感染或感染10 pfu HSV-1（F）或R8300后18小时，1%Triton X-100、0.5 mM苯甲基磺酰氟和2 mM苯甲脒。在湿冰上放置30分钟并低速离心以去除细胞核后，用GST珠对上清液进行预处理，然后在4°C下与GST磷酸酶1结合珠反应过夜。经过大量漂洗后，将结合到珠子上的蛋白质在含有50 mM Tris·HCl（pH7.0）、5%2-巯基乙醇、2%十二烷基硫酸钠和2.75%蔗糖的破坏缓冲液中煮沸溶解，在变性12%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，并转移到硝化纤维板上，用抗γ抗体检测印迹₁34.5血清（1）。γ的位置₁34.5蛋白和嵌合蛋白γ₁显示34.5–MyD116。(B类)将与珠子结合的GST–PP1α融合蛋白的等分试样与25个单位的凝血酶（Sigma）在PBS中在室温下反应。8小时后，在台式离心机中旋转混合物，然后将含有PP1α的上清液与裂解缓冲液进行透析，并与GST、GST–MyD116反应_C类或GST-γ₁34.5_C类绑定到珠子并按中所述进行处理一个PP1用抗磷酸酶1α抗体检测（Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY）。

图2
(一个)电泳分离的放射自显影图像[³⁵S] 在冈田酸（OA）存在或不存在的情况下，感染指示病毒的细胞裂解液中的蛋氨酸标记蛋白质。SK-N-SH细胞被模拟感染或感染20 pfu的HSV-1（F）、R3616或R8300。暴露于病毒后2小时，用添加或不添加冈田酸（25 ng/ml）的培养基199V（1）覆盖细胞。感染后14小时，用1毫升缺乏蛋氨酸的199V培养基覆盖细胞1小时，但补充50μCi[³⁵S] 蛋氨酸（比活性，>1000 Ci/mmol；Amersham）保持1小时，然后收获，溶解，在变性12%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，转移到硝化纤维素片中，并按照所述进行放射自显影（6）。(B类)硝酸纤维素片的免疫印迹一个用反γ探测₁34.5抗体（1）。

图3
纯化、电泳分离的eIF-2与不同数量的模拟感染或感染HSV-1（F）、R3616或R8300的HeLa细胞S10组分反应后的放射自显影图像。按照说明进行分析。S10馏分的用量显示在顶部。标有α和β的箭头表示eIF-2的α和β亚单位的位置；标记为39K的箭头表示与eIF-2α无关的微量39-kDa蛋白的位置。

图4
每个细胞模拟感染或感染20 pfu HSV-1（F）、R3616或R8300的HeLa细胞S10组分的磷酸酶活性。按照说明执行程序。(一个)eIF-2α中残余放射性的分数-³²与模拟感染或感染细胞中不同数量的S10组分反应后P。(B类)抑制剂2对eIF-2α脱磷速率的影响-³²P通过S10组分中的磷酸酶活性计算。结果表示为未添加抑制剂2的重复样品中的相对活性率。(C类) [³²P] 磷酸化酶磷酸酶活性。程序与中的相同一个除了脱磷[³²P] 通过S10组分分析磷酸化酶。结果是两次测定的平均值，表示为[³²P] 与零时间样本相比，剩余的磷酸化酶。(D类)抑制剂2对相对速率的影响[³²P] 磷酸化酶磷酸酶活性。按照中所述进行分析B类.

图5
γ调节蛋白质合成的示意图₁感染细胞中为34.5。如文中所述，PKR在感染HSV-1的细胞DNA合成开始后被激活。在没有γ的情况下₁34.5，eIF-2α磷酸化，蛋白质合成停止。γ₁34.5与PP1α结合并去磷酸化eIF-2α。尚不清楚γ₁34.5–PP1复合物足以或需要额外的因子去磷酸化eIF-2α。因为GADD34替代了γ₁可以想象，GADD34的功能之一是通过类似的机制阻止蛋白质合成的停止。

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