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.2003年12月8日；163(5):1123-31.
doi:10.1083/jcb.200309161。

沙门氏菌蛋白通过诱导自噬导致巨噬细胞死亡

洛林·D·埃尔南德斯 1, 马克·皮帕特, 理查德·弗拉维尔, 豪尔赫·加兰
附属公司

沙门氏菌蛋白通过诱导自噬导致巨噬细胞死亡

洛林·D·埃尔南德斯等。 J细胞生物学. .

摘要

肠炎沙门氏菌是食物中毒和伤寒的病原体，它诱导巨噬细胞的程序性细胞死亡，这一过程被发现依赖于III型蛋白质分泌系统和SipB，SipB是一种具有膜融合活性的蛋白质，通过该系统输送到宿主细胞中。当在培养细胞中表达时，SipB导致形成并定位于异常的多膜结构。这些结构类似于自噬体，包含线粒体和内质网标记。一种缺乏膜融合活性的SipB突变体，定位于线粒体，但不诱导膜结构的形成。巨噬细胞感染沙门氏菌后，在线粒体中发现SipB，线粒体肿胀且无基督。沙门氏菌感染的巨噬细胞表现出明显的自噬小泡积聚。我们认为沙门氏菌通过SipB的作用，通过破坏线粒体杀死巨噬细胞，从而诱导自噬和细胞死亡。

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图1。
图1。
安鼠伤寒沙门氏菌缺乏SPI-1 TTSS效应蛋白的菌株能够诱导巨噬细胞的程序性细胞死亡。来自野生型（A）或caspase-1的BMDPM−/−（B） 小鼠（Kuida等人，1995年）感染了野生型鼠伤寒沙门氏菌或突变衍生物，要么缺乏所有TTSS效应蛋白（无效应），要么由于该系统的基本成分发生突变而导致TTSS分泌缺陷(投资G). 感染后6h，通过乳酸脱氢酶释放或末端脱氧核苷转移酶（TUNEL）染色评估细胞毒性。乳酸脱氢酶释放值表示至少三个独立测量值的平均值。在多次重复这些实验中获得了等效结果。
图2。
图2。
半胱氨酸蛋白酶-1在BMDPM中瞬时表达SipB −/− 小鼠导致细胞死亡。表达与YFP融合的SipB、SipC或SipD的质粒从caspase-1导入BMDPM−/−如材料和方法部分所示。然后固定巨噬细胞，用DAPI染色（以显示染色质），并在荧光显微镜下观察。表达SipC或SipD的细胞没有任何细胞毒性迹象。相反，表达SipB的细胞表现出明显的细胞毒性和染色质凝集迹象。箭头表示转染细胞的细胞核。
图3。
图3。
SipB在COS-2细胞中的瞬时表达。（A） 将表达YFP标记的SipB的质粒转染COS-2细胞，并在共聚焦显微镜下对其定位进行检测。（B） SipB与转染细胞中的线粒体标记物共定位。用编码SipB-CFP（顶部）或SipB-YFP（底部）的质粒转染COS-2细胞。转染细胞用MitoTracker染色®Red（Molecular Probes，Inc.）对线粒体进行可视化，并通过共焦显微镜进行检查。SipB诱导的结构易于用线粒体标记物染色（顶部）。线粒体也包含在SipB诱导的结构中（底部）。（C） 用ER标记Sec-61标记SipB诱导的结构。用编码SipB-YFP和Sec61-CFP的质粒共同转染COS-2细胞，并用共焦显微镜检查转染细胞。
图4。
图4。
SipB转染的COS-2细胞的免疫电镜。用表达SipB-YFP的质粒转染COS-2细胞，转染24小时后，用GFP特异性抗体和金标抗兔抗体固定细胞并制备免疫-EM。SipB定位于由紧密相连的膜组成的结构，这些膜通常与线粒体（A）非常接近。线粒体通常明显融合到SipB诱导的膜结构中（B，见顶部插图中的箭头；C，右插图）。线粒体常与SipB诱导的膜结构（D）结合。棒材，250 nm。
图5。
图5。
非致溶血性SipB428–593突变体定位于线粒体，但不形成多泡结构，并干扰野生型蛋白的活性。（A） 用表达YFP标记的SipB的质粒转染COS-2细胞428–593，用线粒体蛋白CoxIV，亚单位VIc（Molecular Probes，Inc.）抗体染色，并用共焦显微镜检查。唾液B428–593-YFP定位于线粒体，在野生型蛋白表达后未诱导形成多泡结构。（B） COS-2细胞与表达SipB的质粒共转染428–593-在共聚焦显微镜下对YFP或SipB-CFP和转染细胞进行检测。SipB的表达428–593-YFP阻止野生型SipB-CFP形成多泡结构（注意，泡状结构仅在SipB不存在时才明显，而在SipB-CFP存在时不明显428–593-YFP；右侧）。
图6。
图6。
这个鼠伤寒沙门氏菌SPI-1 TTSS–分泌蛋白SipB定位于感染巨噬细胞的线粒体。（A） 骨髓来源的巨噬细胞感染了任一野生型鼠伤寒沙门氏菌或TTSS易位缺陷刀槽花纹感染倍数为50的突变株。感染后3小时，收集巨噬细胞，并使用金标抗体进行免疫-EM处理。在感染野生型（A和B）的巨噬细胞中可以很容易地检测到SipB，但在感染小口D突变菌株（C）。棒材，100 nm。（B） 或者，从感染的巨噬细胞中分离出线粒体，并存在SipB或常驻线粒体蛋白CoxIV亚单位IV，并使用特异性抗体通过Western免疫印迹分析进行检测。
图7。
图7。
鼠伤寒沙门氏菌-感染的巨噬细胞表现出自噬细胞增多的迹象。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1−/−BMDPM感染野生型鼠伤寒沙门氏菌或者是等基因易位缺陷小口D突变体。感染后6小时，巨噬细胞用MDC染色以标记自噬体（I）或处理EM（II），如图3图例所示。感染野生型的巨噬细胞鼠伤寒沙门氏菌（但不是那些感染了小口D突变体）显示出大量用MDC（I）染色的囊泡结构。电镜下（II），巨噬细胞感染野生型沙门氏菌表现出类似于自噬体（A-D）的多泡结构。通常，在多泡结构（B-D）中容易观察到电子致密物质，可能是受损的细胞器。相反，感染III型分泌物的巨噬细胞小口D突变体在野生型感染细胞中没有观察到大量的多泡结构。棒材（A和E）500 nm；（B、C、D和F）250纳米。
图8。
图8。
这个鼠伤寒沙门氏菌-诱导巨噬细胞死亡不需要caspase活性。BMDPM感染野生型鼠伤寒沙门氏菌或TTSS缺陷投资G在存在或不存在50μM泛酶抑制剂Z-VAD的情况下发生突变，如图1图例所示测量细胞死亡。
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