介绍
帕金森病是一种常见的神经退行性疾病，目前尚无可用于治疗的疾病改良疗法[1]对家族性帕金森病的隐性形式的研究，如由E3泛素连接酶Parkin（基因ID:5071）或线粒体激酶PINK1（基因ID:65018）突变引起的隐性形式，可能揭示对这些家族以及散发性帕金森病患者的疾病发展重要的疾病机制。
虽然散发性帕金森病的病因可能很复杂，但有几条证据表明线粒体功能障碍与其发病机制有关。黑质内的线粒体（SN）是一个中脑区域，优先受帕金森病影响，其体细胞线粒体DNA（mtDNA）突变率高于所检测的大脑其他区域[2]SN中线粒体损伤增加，尤其是线粒体DNA，与散发性帕金森病有关[3]——[5]在罕见的多线粒体DNA缺失综合征患者和线粒体DNA表达降低的动物模型中，线粒体功能障碍足以导致帕金森综合征[6]——[8]此外，MPTP和鱼藤酮等毒素被认为能增加电子传递链复合物I中的活性氧物种，可在人类和动物模型中诱发帕金森综合征[9],[10]由于SN中的神经元是有丝分裂后的神经元，它们获得的任何线粒体损伤都可能在生物体的一生中积累，导致渐进性线粒体功能障碍，包括氧化应激增加、钙缓冲能力降低、ATP丢失，最终，细胞死亡，除非质量控制过程消除受损的线粒体。
最近的研究表明，Parkin和PINK1在维持线粒体完整性和功能的关键途径中存在关联。蛋白质损失果蝇属导致类似表型，线粒体损伤先于肌肉退化，精子发生受阻，多巴胺能神经元死亡[11]——[15]有趣的是，Parkin的过度表达可以部分补偿PINK1的缺失，但PINK1.的过度表达不能补偿Parkin缺失，这表明PINK1-在Parkin上游以共同的途径发挥作用。此外，Parkin或PINK1基因缺失的小鼠表现出纹状体（接受多巴胺能神经元的投射）氧化损伤增加和线粒体功能降低[16],[17]；Parkin或PINK1功能丧失突变患者的原代细胞也有类似的异常[18]——[20]这些发现共同表明，Parkin和PINK1可能在进化上保守的通路中发挥作用，对维持线粒体完整性和功能至关重要。我们最近报道，Parkin被选择性地招募到膜电位低的功能失调线粒体中，并随后促进其自噬降解[21]这表明Parkin可能通过一种途径来限制线粒体损伤，该途径可识别并消除线粒体网络中受损的线粒体。然而，线粒体功能障碍如何向Parkin发出信号尚不清楚。
在这里，我们表明全长PINK1选择性地聚集在功能失调的线粒体上，Parkin向去极化线粒体的募集以及随后Parkin诱导的有丝分裂严格依赖于PINK1's线粒体靶向信号和去极化诱导的聚集。总之，这些结果有力地支持了PINK1和Parkin之间针对线粒体损伤的信号传递的新模型。在该模型中，线粒体PINK1通过蛋白质水解在生物能量耦合良好的线粒体上快速翻转，但在低膜电位的线粒体上选择性稳定。PINK1在受损线粒体上的选择性积累会招募Parkin，Parkin反过来会诱导受损线粒体的降解。在这个模型中，PINK1和Parkin形成了一条从线粒体网络感知和选择性消除受损线粒体的途径。PINK1和/或Parkin的致病突变以不同的步骤破坏了该通路，这与该通路对预防早发性帕金森综合征的重要性一致。
结果
线粒体去极化后PINK1积累
帕金被选择性地招募到失去膜电位的受损线粒体，但帕金如何区分膜电位低的功能失调线粒体和健康线粒体尚不清楚。由于PINK1在基因上是Parkin的上游，我们测试了PINK1's活性是否可能被线粒体去极化激活。值得注意的是，内源性线粒体PINK1水平强烈响应线粒体膜电位的变化。当用CCCP处理HeLa细胞时，CCCP通过增加H的膜通透性使线粒体去极化+30分钟后，内源性全长PINK1（～63 kDa）显著增加，并持续至少3小时(). 与CCCP不同，缬氨霉素通过使线粒体膜通透性达到K，从而使线粒体去极化+(图S1A). 相反，CCCP去极化后，细胞溶质部分无谱带增加(图S1B).
PINK1选择性地聚集在去极化的线粒体上。（A） 在时间点0用血清中的10µM CCCP处理稳定表达YFP-Parkin的HeLa细胞，进行分馏，并提取碳酸盐。富含完整线粒体蛋白的碳酸盐提取颗粒在SDS凝胶上运行，并对内源性PINK1和线粒体蛋白VDAC进行免疫印迹。我们在最初的实验中使用了稳定表达YFP-Parkin的HeLa细胞，因为不清楚PINK1的稳定性是否会像之前报道的那样受到Parkin缺失的影响[29]（B）用20µM CCCP处理血清中稳定转导对照shRNA或PINK1 shRNA的M17人神经母细胞瘤细胞，并进行分馏。富含线粒体的膜级分在SDS凝胶上运行，并如（A）中那样进行免疫印迹。（C） 用PINK1-V5转染E18大鼠皮层神经元（体外7 d）。第二天，用1µM CCCP处理细胞6 h。在SDS页面凝胶上运行全细胞裂解液，并按照（A）中的方法进行免疫印迹。（D） 转染PINK1-YFP（绿色）的HeLa细胞的活细胞成像在时间点0用血清中的10µM CCCP处理。在用CCCP去极化之前，用线粒体追踪红（MTR）（红色）脉冲标记线粒体。（E） 转染PINK1-YFP（绿色）的Mfn1/2空MEF。所有线粒体均用抗细胞色素c抗体（Cyto c；白色）染色，生物能量耦合线粒体用脉冲细胞Mitotracker Red（MTR）（红色）染色。（F） 在两个独立实验中，分别在八个或更多细胞中测量了PINK1阴性线粒体（PINK1−Mito）和PINK1阳性线粒体（PINK1+Mito）的平均MTR强度/像素。给出了一个典型实验的数据。a.u.，任意单位。（G） 用PINK1-YFP（绿色）转染HeLa细胞，并用2 mM百草枯处理16 h。用MTR（红色）对细胞进行脉冲处理，固定，并对细胞色素c（白色）进行免疫染色。（H） 在两个独立的实验中，测定了八个或更多细胞的PINK1-YFP强度和细胞色素c强度之间的皮尔逊系数指数，以及PINK1/YFP密度和MTR强度。给出了一个典型实验的数据。（一） 用CFP-Parkin（红色）和PINK1KD-YFP（绿色）转染HeLa细胞，作为内源性PINK1积累的报告细胞，并用2 mM百草枯处理16 h。细胞用MTR（白色）脉冲处理并固定。（J） 在两个独立的实验中，测定了7个或更多细胞的PINK1 KD-YFP强度与CFP-Parkin强度、PINK1KD-YFP强度与MTR强度之间的皮尔逊系数指数。给出了一个典型实验的数据。
为了验证～63-kDa带实际上是PINK1，我们对用对照短发夹RNA（shRNA）或PINK shRNA稳定转导的M17细胞的内源性PINK1.我们发现对照shRNA细胞经CCCP处理后，～63-kDa带增加，但PINK1-shRNA细胞中不增加，证明此～63-kDa带是内源性PINK1(). PINK1中也发现了类似的结果−/−PINK1-myc转染或未转染的细胞(图S1C). 我们还测试了CCCP去极化后，PINK1是否在大鼠原代皮层神经元中同样积累。尽管我们（和其他人）未能用现有的商业抗体检测内源性大鼠或小鼠PINK1([22]1µM CCCP治疗6小时后，我们观察到皮层神经元PINK1-V5增加(). CCCP治疗后，PINK1在初级神经元中的积累速度可能比在HeLa细胞中慢，因为与HeLa电池不同[23]，神经元几乎完全依赖于ATP生成的氧化磷酸化[24].
为了探索PINK1在单细胞水平上的积累动力学，我们将YFP融合到PINK1，并用CCCP去极化后成像细胞存活。与Western blotting的结果一致，我们发现PINK1-YFP表达从第一次检测到增加的1–5分钟开始稳定增加，直到至少70分钟(和视频S1).
PINK1在单个细胞去极化线粒体上优先积累
为了检测单个细胞内未偶联线粒体PINK1积累的选择性，我们首先研究了其在线粒体融合蛋白丝裂原-1和丝裂原-2（Mfn1/2）缺失的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中的表达。Mfn1/2空MEF具有异质的线粒体群体，其中一些线粒体生物能量不耦合，而另一些线粒体耦合良好[25]我们发现，与YFP-Parkin类似[21]，PINK1-YFP在低膜电位的线粒体上选择性积累，表明PINK1在生物能量多样的线粒体群体中选择性地稳定在去极化线粒体上().
百草枯是一种与帕金森综合征有关的杀虫剂，使用百草枯治疗也会导致线粒体的异质性，这可能是由于活性氧物种随机损伤线粒体所致[26]我们用高剂量百草枯（2 mM）处理HeLa细胞过夜。与之前报告的Parkin结果相似[21]我们发现PINK1-YFP优先在膜电位低的受损线粒体上积累(). 虽然PINK1-YFP与细胞色素c共定位，细胞色素c存在于所有线粒体中（平均皮尔逊系数=======================================================================================================0.58±0.11），PINK1-YFP与MTR（平均皮尔逊系数=======================================================================================================0.26±0.13），仅在具有生物能量活性的线粒体中积累(第页-PINK1/细胞色素c与PINK1/MTR的值<0.001，配对学生t吨-测试）。这些数据表明PINK1-YFP选择性地聚集在氧化应激损伤的去极化线粒体上().
接下来，我们检查百草枯治疗后Parkin是否被招募到积累PINK1的去极化线粒体。这种关系很难直接测试，因为PINK1的过度表达似乎会加速Parkin向线粒体募集的动力学（如下文所示）[27]，所以我们使用了激酶缺陷型PINK1（PINK1KD）[28]作为HeLa细胞内源性PINK1积累的报告人。我们发现PINK1 KD的表达受线粒体电压的调节，类似于野生型PINK1(图S1D); 但与野生型PINK1不同，PINK1KD在过度表达时不会增强Parkin的招募（如下文所示）。用百草枯隔夜治疗后，我们发现PINK1 KD选择性地聚集在去极化的线粒体上，其模式类似于野生型PINK1(). 此外，大量积累PINK1 KD的线粒体亚群（很可能也积累了内源性PINK1）招募了Parkin(). 尽管Parkin和PINK1 KD在百草枯处理的细胞中共定位（平均皮尔逊系数=======================================================================================================0.45±0.13），PINK1KD与MTR不共存（平均皮尔逊系数=======================================================================================================0.22±0.13;第页-价值=======================================================================================================PINK1 KD/Parkin与PINK1KD/MTR的对比为0.002）().
综合考虑，这些结果表明PINK1选择性地聚集在功能失调的低膜电位线粒体上。
PINK1断裂被膜电位损失抑制，导致其在线粒体外膜上积聚
在转录或翻译水平上调节PINK1的表达可能对线粒体亚群没有选择性，因此我们评估了受损线粒体上PINK1表达的增加是否是通过从功能线粒体中选择性去除PINK1.全长PINK1（～63kDa），它锚定在线粒体膜上，被蛋白质水解分解成一个可被蛋白酶体降解的～52-kDa细胞溶质片段[22],[28]——[30]为了测试CCCP处理后PINK1的积累是否是由于其蛋白水解裂解受到抑制，我们评估了CCCP洗脱对PINK1.裂解的影响。用载体（DMSO）或CCCP处理HeLa细胞3小时，然后将CCCP冲洗掉或再保留30分钟。在处理的最后一小时，添加或不添加环己酰亚胺，以控制冲洗期间PINK1的从头合成。在连续存在CCCP的情况下，PINK1累积3小时后，添加放线菌酮1小时对全长PINK1的丰度几乎没有影响，这表明一旦其累积，在去极化的线粒体上，～63-kDa PINK1相对稳定(，车道4与车道6）。然而，在CCCP洗脱30分钟内，～63-kDa PINK1丰度急剧下降，这与极化、未受损线粒体上其被裂解并保持低丰度一致(，4–7车道与8–11车道）。CCCP洗脱后残留的全长PINK1主要代表在3小时CCCP处理期间积累的PINK1，因为洗脱前添加环己酰亚胺对其水平影响不大(，第8车道对第10车道）。
PINK1在抑制电压敏感性分裂后积累。（A） 用DMSO处理稳定表达YFP-Parkin的HeLa细胞3.5小时，用2µM CCCP处理3.5小时，或用CCCP处理3小时，然后在没有血清的情况下洗去CCCP 0.5小时。在最后1 h的处理中添加50µM MG132和/或100µM环己酰胺。全细胞裂解物（WCL）在SDS凝胶上运行，并对内源性PINK1和微管蛋白进行免疫印迹。（B） 描述PINK1两步处理的模型。（C） 定量RT-PCR用于测量用DMSO或CCCP处理1h的HeLa细胞中PINK1 mRNA的相对表达。该图表示四个独立实验的结果。作为阳性对照，在外源性表达PINK1后，还测量了HeLa细胞中的相对PINK1 mRNA水平。PINK1 mRNA表达水平归一化为看家基因β-肌动蛋白.WT，野生型。
为了进一步评估PINK1在去极化条件下的稳定性，我们在蛋白酶体降解抑制剂MG132的存在下进行了相同的一组实验。当在用载体处理的HeLa细胞的最后一个小时内添加MG132时，出现一条～52-kDa带，与之前报告中描述的全长Parkin的卵裂产物一致[22],[28],[30](，车道1与车道2）。用MG132处理后，这种短形式PINK1的积累表明，正如之前观察到的那样，它在基础条件下是不稳定的[22],[30](，车道1与车道2）。有趣的是，在使用CCCP去极化3.5小时后，MG132存在下短型PINK1的水平降低，而全长PINK1的水平升高(，车道2与车道5）；但随着全长PINK1水平下降，CCCP冲刷后增加(，车道2与车道9）。这种模式表明，线粒体去极化阻止全长PINK1裂解为不稳定短形式，CCCP洗脱后恢复。综上所述，这些结果支持PINK1处理的两步模型：首先，全长PINK1-以电压依赖、蛋白酶体依赖的方式被切割成～52-kDa短形式，其次，PINK1/短形式被蛋白酶体快速降解(). PINK1的电压依赖性处理在健康的极化线粒体上维持低水平的PINK1，但允许PINK1在去极化的线粒体上快速积累。
尽管这些实验表明，PINK1的表达增加至少部分是由于PINK1裂解受到抑制，但在去极化后PINK_1的转录增加可能也有助于PINK_2丰度的增加。为了评估PINK1转录是否也受到膜电位的调节，我们对用二甲基亚砜或CCCP处理1小时的HeLa细胞中PINK1的水平进行了定量RT-PCR（qRT-PCR），CCCP去极化后PINK1转录没有显著增加（p=======================================================================================================0.4499). 这些数据证实，去极化后PINK1表达的增加并不是由PINK1转录的增加驱动的().
最后，为了测试积累的PINK1在去极化线粒体上的定位，我们使用针对PINK1's激酶结构域的抗体进行了蛋白酶保护试验。与PINK1的拓扑结构的最新研究结果一致[22]，我们发现内源性PINK1的激酶结构域在去极化后面对细胞质(图S1E).
去极化线粒体上PINK1的积累与蛋白酶PARL无关
哺乳动物细胞中负责PINK1裂解的蛋白酶尚不清楚，但在果蝇属PINK1裂解似乎需要膜内丝氨酸蛋白酶Rhomboid-7细胞[31]为了检测哺乳动物Rhomboid-7（PARL）的直系同源基因是否与哺乳动物细胞中PINK1的裂解有关，我们测试了PINK1-V5是否在转染PARL-shRNA并经CCCP处理的HeLa细胞中积累。虽然在HeLa细胞中不能检测到内源性PARL，但PARL shRNA抑制了过度表达的PARL的表达(图S2A和S2B). 敲除PARL不会显著改变HeLa细胞内源性PINK1的基础水平或增加去极化诱导的内源性PINH1的积累(图S2B). 同样，PARL中PINK1-V5水平相似−/−和PARL+/+MEF，在基础条件下和CCCP去极化后(图S2C). 总之，这些结果表明PARL对于PINK1的切割是可有可无的。
去极化线粒体上PINK1的积累与Parkin的表达无关
以前的研究果蝇属哺乳动物细胞表明PINK1在Parkin基因上游发挥作用[11]——[13],[20],[32]尽管这种遗传相互作用的分子机制尚不清楚。为了测试线粒体上PINK1的积累是否是Parkin向去极化线粒体募集的上游，我们评估了PINK1的积累对Parkin表达的依赖性。内源性PINK1在HeLa细胞中的积累类似，HeLa的内源性Parkin表达很少或没有，而HeLa则稳定表达YFP-Parkin(图S2D). 与这些发现一致，我们观察到外源性PINK1-myc在永生帕金中的积累类似−/−和Parkin+/+MEF公司(图S2E). 总之，这些结果表明PINK1的积累是Parkin向去极化线粒体募集的上游，与Parkin的表达无关。
PINK1的表达是Parkin恢复去极化线粒体和Parkin诱导的线粒体吞噬所必需的
接下来，我们测试了去极化线粒体的Parkin募集是否依赖于PINK1的表达。我们发现，尽管YFP Parkin在43.3±8.1%（平均值±标准差[SD]）的PINK1中被募集到线粒体+/+在暴露于20µM CCCP 3小时后的初级MEF中，PINK1中的线粒体未检测到其补充−/−MEF，通过共焦显微镜进行评估(). 我们也未能在PINK1 CCCP后24小时检测到YFP-Parkin招募−/−MEFs（未发表的数据）表明，在缺乏PINK1的情况下，YFP-Parkin很少或没有向去极化线粒体募集。YFP-Parkin招募可以在PINK1中重建−/−MEF通过野生型PINK1的表达，而不是通过缺乏线粒体靶向N末端的PINK1-ΔN的表达（1–155）[22]提示PINK1的线粒体靶向性是Parkin向线粒体募集的必要条件(). PINK1的激酶缺陷（KD）版本[28]也未能重建Parkin对线粒体的补充().
去极化线粒体的Parkin募集需要PINK1及其线粒体靶向N末端。（A） PINK1的主要MEF+/+或PINK1−/−将YFP-Parkin（绿色）和指示构建物（载体PINK1-V5、PINK1激酶缺乏[KD]-V5或PINK1156-581[ΔN]-V5）以1∶4的比例共同转染小鼠，用二甲基亚砜或血清中的20µM CCCP处理3 h。对线粒体进行Tom20（红色）免疫染色。右侧列中的图像是中间列和左侧列的合并图像，是中间列中装箱区域的展开。（B） 在三个或多个独立实验中，对≥100个细胞/条件下（A）中YFP-Parkin和线粒体之间的克隆化进行评分。（C） 独立生成PINK1的转换MEF+/+和PINK1−/−小鼠被转染并按（A）中所述进行处理，并按（B）中所示进行评分。（D） 用对照shRNA或PINK1 shRNA稳定转导的M17人神经母细胞瘤细胞在血清中用10µM CCCP处理3小时，并如（A）所示成像。（E） 如（B）所述，对（D）中YFP-Parkin和线粒体之间的结肠化进行评分。（F） 对照shRNA和PINK1 shRNA M17细胞被转染并按（D）中的方式处理，将其分为富含线粒体的膜组分（Memb）和上清液（Sup）。在SDS凝胶上运行组分，并用抗Parkin和抗VDAC抗体进行免疫印迹。对两种细胞类型之间的核后上清液（PNS）中的YFP-Parkin浓度进行调整，使其接近相等。（A和D）中的比例尺代表10µm。（B、C和E）中的误差线表示标准偏差。
我们进一步测试了SV40转化的MEF细胞系中Parkin募集对PINK1的依赖性，该细胞系来源于独立生成的PINK1−/−鼠标[29](和图S3A). 与主PINK1类似−/−MEF，在改造后的PINK1中没有招聘−/−而在PINK1的60.7±7.7%中Parkin被募集到线粒体+/+CCCP处理后的细胞。同样，改造后的PINK1中的Parkin招募−/−PINK1外源性表达后细胞重构（72.8±7.7%vs.0.0±0.0%，第页-值<0.001），但不是PINK1ΔN或PINK1 KD。
最后，我们测试了人类神经母细胞瘤细胞系（M17）中Parkin募集的依赖性[33],[34]在稳定转导PINK1 shRNA的M17细胞中，CCCP处理的细胞中有4.7±1.2%的YFP-Parkin易位到线粒体，而对照shRNA M17细胞在10µM CCCP处理3 h后有67.3±3.1%的细胞显示线粒体YFP-Parkin(第页-值<0.001）(). 载体处理未能在两种细胞系中诱导YFP-Parkin易位到线粒体。通过免疫印迹法在M17细胞系中检测了PINK1表达对Parkin向细胞膜募集的必要性。在对照shRNA细胞中，CCCP处理后，富含线粒体膜部分的YFP-Parkin水平增加，上清液中YFP-Parkin水平降低，这与Parkin向线粒体移位一致(、上面板和图S3B). 与对照shRNA细胞相比，PINK1 shRNA细胞中YFP-Parkin的表达较少，这可能是因为这些细胞中的转染效率较低，和/或因为Parkin在没有PINK1s的情况下不太稳定，正如之前所观察到的那样[29]然而，无论是在等负荷条件下，还是在调节负荷使两个细胞群中的Parkin总量大致相等时，我们都没有发现Parkin增加膜分数，这进一步表明，在缺乏PINK1的情况下，Parkin不会被招募到解偶联的线粒体中(、下面板和图S3B).
我们之前报道过异位Parkin可以诱导去极化线粒体的自噬[21]为了测试PINK1对帕金诱导的有丝分裂是否必要，我们治疗了原发性PINK1−/−和PINK1+/+用20µM CCCP瞬时表达YFP-Parkin的MEF 24小时(). 而在66.1±16.8%的PINK1中未检测到线粒体+/+MEF，全是粉红色−/−MEFs保留线粒体。Parkin依赖性线粒体自噬由PINK中外源性PINK1的表达重建−/−MEF，含有65.5±5.0%的复原粉红色−/−CCCP处理后细胞显示出无法检测到的线粒体。
PINK1是Parkin诱导去极化线粒体自噬所必需的。（A） PINK1的主要MEF+/+或PINK1−/−与YFP-Parkin共转染的小鼠用DMSO或血清中的20µM CCCP处理24 h。线粒体用抗Tom20抗体染色。（B） 在三个或更多独立实验中，对每种情况下>150个细胞的（A）中未检测到线粒体的细胞百分比进行评分。（C） 用10µM CCCP处理稳定转导对照shRNA或PINK1 shRNA的M17人神经母细胞瘤细胞24 h，并按（A）染色。（A和C）底部行中的图像是中间行中方框所示图像的展开。（A和C）中的比例尺代表10µm。（D） 如（B）所述，对（C）中无线粒体的细胞百分比进行评分。（E） 用DMSO或10µM CCCP处理稳定转导对照shRNA或PINK1 shRNA的M17细胞24 h，并用Mitotracker Green（MTG）染色。MTG以不依赖于膜电位的方式对线粒体脂质进行染色，是线粒体质量的一种敏感测量方法。该图显示了三个独立实验中二甲基亚砜和CCCP处理样品之间的线粒体绿强度变化。（F） 用对照shRNA或PINK1 shRNA稳定转导的M17细胞在CCCP存在下用Mitotracker Green脉冲。在0小时、16小时和24小时用平板读取器测量MTG强度损失。该图显示了三个生物复制品的数据，并代表了三个独立的实验。（B、D和E）中的误差条表示标准偏差。
我们发现帕金诱导的有丝分裂也依赖于M17人神经母细胞瘤细胞系中PINK1的表达。而在27.1±8.6%的对照shRNA M17细胞中，24小时后线粒体完全丢失，而PINK1 shRNA细胞中线粒体丢失的细胞不到5%(). 这些结果表明PINK1对于Parkin过度表达后去极化线粒体的有丝分裂是必要的。
为了测试PINK1的表达是否影响内源性Parkin水平下的线粒体周转，我们用DMSO或CCCP处理对照shRNA和PINK1-shRNA M17细胞（表达中度Parkin）24小时，并通过Mitotracker Green（MTG）染色和流式细胞术测量其相对线粒体质量。MTG是线粒体质量的一种敏感测量方法，以膜电位无关的方式对线粒体脂质进行染色，以前曾用于测量去极化线粒体的线粒体质量[35],[36]CCCP处理后，对照shRNA M17细胞的线粒体质量下降（CCCP vs.DMSO，−22.4±12.6%），而去极化后PINK1 shRNA M17细胞线粒体质量增加（CCCP对DMSO（43.5±20.0%）(第页-价值=======================================================================================================线粒体质量控制shRNA与粉红色shRNA的变化为0.008）(). 这些结果与内源性PINK1在线粒体生物发生持续（或增加）的情况下促进线粒体降解一致[37],[38]为了更直接地测定对照细胞和PINK1 shRNA M17细胞的线粒体周转率，我们用MTG刺激细胞，并在CCCP存在的情况下跟踪0、16和24小时MTG强度的损失。与内源性PINK1促进去极化线粒体降解的假设一致，与CCCP处理的对照shRNA细胞相比，PINK1-shRNA细胞中的MTG强度下降较慢（24h时为0.58±0.07 vs.0.33±0.07相对MTG强度）(). 这些数据表明，PINK1在内源性Parkin水平的背景下促进线粒体自噬。此外，这些结果表明，功能失调的线粒体的选择性转换可能通过新线粒体的生物发生来平衡，从而使受损、功能失调的线粒体能够交换为健康、功能正常的线粒体。
与基因研究一致果蝇属这些发现表明，Parkin向去极化线粒体的易位和Parkin诱导的有丝分裂是PINK1表达的下游，而PINK1-因去极化而积累是Parkin募集的上游。
PINK1在外线粒体膜上的表达足以支持Parkin募集和线粒体吞噬
线粒体PINK1的表达对于Parkin向线粒体的募集是必要的。接下来，我们测试PINK1的过度表达是否足以使Parkin募集到线粒体，我们发现PINK1适度过度表达显著加速了CCCP去极化后Parkin募集动力学（移位时间5.0±1.5分钟vs.32.0±5.4分钟，第页-值<0.001）(;视频S2与。第3页). 与PINK1线粒体定位和激酶活性的必要性一致，外源性表达PINK1KD或PINK1ΔN未能加速Parkin募集动力学(). 在PINK1高表达的细胞中，即使没有CCCP，Parkin也被招募到线粒体中()，如前所述[27]YFP-Parkin与线粒体电位染料TMRE在45.3±7.6%同时表达YFP-Parkin和PINK1的细胞中共定位，而仅在0±0%的细胞中表达Parkin(第页-值<0.001）(). 总之，这些结果表明Parkin募集动力学对细胞中PINK1水平非常敏感。此外，他们表明PINK1表达增加足以独立于膜电位进行Parkin募集。
Parkin募集动力学受PINK1表达调控。（A） 在血清中添加10µM CCCP后，在0分钟的时间点，对单独转染mCherry-Parkin（红色）或以1∶1比例转染M樱桃-帕金（红色）和PINK1-YFP的HeLa细胞进行实时成像在添加CCCP之后。Parkin易位开始的时间被定义为在至少三个独立实验中，六个或更多细胞的两个或多个连续图像的两个以上象限中首次出现点状突起。N.S.，无显著性。（C） 转染YFP-Parkin（绿色）或YFP-Pargin（绿色）和PINK1-myc（比例为1∶4）的HeLa细胞的活共焦图像。用TMRE（红色）负载细胞以染色极化线粒体。细胞未经CCCP处理。最后一幅图像中的比例尺表示10µm。中间和右侧面板中的图像是左侧面板中装箱区域的展开。（D） 按（C）所述处理的细胞在YFP-Parkin和TMRE之间的共定位进行评分。≥在三个或更多的独立实验中，对50个细胞/实验进行评分。
为了测试PINK1在线粒体上的稳定表达是否足以补充Parkin，我们构建了一个融合蛋白，该融合蛋白预计缺乏PINK1's蛋白水解裂解位点，因此在线粒体上表现出更大的稳定性。基于全长型和裂解型之间的～11-kDa差异，裂解位点可能位于残基110之前（残基1-110的预测分子量为11.54 kDa），因此我们用OPA3（1-30）的外线粒体膜锚取代PINK1的残基1-10(). 我们发现，去除PINK1的前110个氨基酸会阻止PINK1靶向线粒体，这与以前的报道一致[39](，中间面板）；而OPA3（1–30）与PINK1Δ1-110的融合恢复了线粒体靶向性，很可能是线粒体外膜(，右侧面板）。正如蛋白水解裂解结果所预测的那样()，与PINK1-YFP相比，OPA3-PINK1Δ1-110-YFP表现出更高的稳定性(). 此外，OPA3-PINK1Δ1-110-YFP水平对CCCP的线粒体去极化没有反应，表明去极化对PINK1的稳定取决于其前110个氨基酸。当与mCherry-Parkin共表达时，PINK1-YFP在没有CCCP的情况下将mCherry Parkin招募到57.9±1.8%的细胞线粒体中；而在线粒体上不表达的PINK1Δ1-110-YFP在缺乏CCCP的情况下无法招募mCherry-Parkin。然而，OPA3-PINK1Δ1-110-YFP不显示电压依赖性蛋白水解，在没有CCCP的情况下，将mCherry-Parkin招募到98±1.8%细胞的线粒体(). 总之，这些数据表明，无论膜电位如何，线粒体上PINK1的稳定表达足以使Parkin募集到线粒体。
线粒体外膜上PINK1的稳定表达对于Parkin的募集是足够的。（A） PINK1-YFP（绿色）、PINK1（111–581）-YFP-（绿色）和OPA3-PINK1（111-581）-YFP（绿）结构示意图。（B） 共焦图像描绘了HeLa细胞中PINK1-YFP、PINK1（111–581）-YFP和OPA3-PINK1（111-581）-YFP的定位。线粒体用电位染料TMRE（红色）染色。（C） 用PINK1-YFP、PINK1（111–581）-YFP-或Opa3-PINK1-（111–58）-YFP转染HeLa细胞，并用二甲基亚砜或2µM CCCP在无血清培养基中处理3 h。在SDS凝胶上运行全细胞裂解物（WCL），并对PINK1、GFP和微管蛋白进行免疫印迹。（D） 与mCherry-Parkin（红色）和PINK1-YFP（绿色。细胞未经CCCP处理。（E） 在三个或更多独立实验中，对（D）中的HeLa细胞进行了mCherry-Parkin评分，以确定其在≥150个细胞中形成线粒体点状特征。细胞未经CCCP处理。（F） 用胞浆中的FRB-PINK1（111–581）-YFP、线粒体上的TOM20（1–33）-FKBP和mCherry-Parkin转染HeLa细胞。在雷帕霉素类似物AP21967存在下，各融合蛋白（PINK1（111–58）和TOM20的线粒体外膜锚定）的FRB和FKBP结构域异源二聚体化，如果他们可以进入同一个隔间（例如胞浆）。用载体或250 nM AP21967处理细胞8 h后，在三个或更多独立实验中对≥150个细胞线粒体的mCherry-Parkin点状特征进行评分。（G） 转染PINK1-YFP（绿色）、PINK1（111–581）-YFP-（绿色）或OPA3-PINK1（111-581）-YFP（绿色，含或不含ECFP-Parkin）并在无CCCP的情况下培养96小时的HeLa细胞的共聚焦图像。对细胞进行Tom20免疫染色（红色）。为了帮助观察缺乏线粒体的细胞，我们对一些单个细胞进行了概述。（H） 在三个或多个独立实验中，对按（G）处理的细胞中≥150个细胞中不存在可检测线粒体进行评分。所有图像中的比例尺代表10µm。
为了验证外线粒体膜上PINK1的增加表达足以诱导Parkin募集，我们使用了一个调节的异二聚体系统[40]其中，修饰的FRB结构域与PINK1Δ1-110-YFP融合，FKBP结构域与TOM20的线粒体外膜锚（残基1至33）融合(图S4A). 在雷帕霉素衍生物AP21967的存在下，FRB结构域和FKBP结构域异源二聚体，但前提是它们位于同一隔间。因此，如果TOM20-FKBP的FKBP结构域面对细胞质，而不是面对膜间隙或基质，FRB-PINK1Δ1-110-YFP应该从细胞质向线粒体募集，但在添加AP21967后迅速被补充到线粒体外膜(图S4B和S4C). 为了评估线粒体外膜上PINK1的表达是否足以招募Parkin，我们共转染了mCherry-Parkin、FRB-PINK1-Δ1-110-YFP和TOM20-FKBP。在没有AP21967的情况下，mCherry-Parkin存在于细胞液中，但在与AP21966孵育后，在没有CCCP的情况下96.7±4.1%的细胞中，mChery-Parkin被补充到线粒体中(和图S4D). 因此，线粒体外膜PINK1表达增加足以将Parkin募集到线粒体中。
接下来，我们测试了线粒体PINK1表达增加后Parkin的募集是否足以在CCCP不去极化的情况下诱导线粒体吞噬。PINK1和Parkin共转染后，96h后有相当比例的细胞（42.1±7.3%）没有线粒体。相比之下，细胞溶质PINK1-Δ1-110-YFP与Parkin的共转染96h后没有产生缺乏线粒体的细胞，这导致线粒体上PINK1的稳定表达，恢复了PINK1和Parkin诱导线粒体自噬的能力，在96小时时76.4±2.2%的细胞缺乏线粒体(). 这些数据表明，无论膜电位如何，PINK1在线粒体外膜上的稳定表达足以在帕金存在的情况下诱导有丝分裂。
去极化后PINK1的积累是Parkin补充线粒体所必需的
为了测试去极化后内源性PINK1的积累是否对Parkin募集是必要的，我们用CCCP单独处理HeLa细胞（60分钟），或用CCCP加放线菌酮（一种蛋白质合成的通用抑制剂）处理HeLa细胞（在CCCP前30分钟添加放线菌酰胺，并在整个60分钟CCCP处理过程中保持）。用环己酰亚胺处理HeLa细胞90分钟可阻断去极化诱导的内源性PINK1在全细胞裂解物和富含线粒体的膜部分中的积累(). 同样，用环己酰亚胺处理90分钟，通过共聚焦显微镜阻断了Parkin向去极化线粒体的募集（96.0±3.5%对11.3±4.2%）(). 相比之下，共聚焦显微镜下，90min的放线菌素D（一种转录抑制剂）治疗对Parkin向解偶联线粒体募集的作用不大()这表明派金招募不需要PINK1的新转录。这与解偶联后PINK1 mRNA不上调一致(). 通过免疫印迹法，环己酰亚胺同样阻断了富含线粒体的重膜组分中YFP-Parkin的积累(). 虽然这些发现并没有证明帕金招募需要新的PINK1合成（环己酰亚胺阻断所有蛋白质的从头合成，因此可能独立于PINK1-的积累来抑制帕金招募），但它们表明PINK1/的积累和帕金招募可能是偶然相关的。
帕金招募可能需要CCCP去极化后PINK1的积累。（A） 在不含血清的情况下，用2µM CCCP单独处理1 h或CCCP 1 h+2µM CHX处理稳定表达YFP-Parkin的HeLa细胞（30 min预处理和1 h处理）。在SDS凝胶上运行全细胞裂解产物，并对内源性PINK1和负载控制GAPDH进行免疫印迹。（B） 按（A）处理的细胞被分离。富含线粒体的膜组分（Memb）在SDS凝胶上运行，并对内源性PINK1和VDAC进行免疫印迹。（C） 用YFP-Parkin（绿色）转染HeLa细胞，并在有血清的情况下单独用10µM CCCP 1 h、CCCP+10µM放线菌素（30分钟预处理和1 h处理）或CCCP 1 h+100µM CHX（30分钟前处理和1小时处理）处理，并对Tom20进行免疫染色（红色）。（D） 在三个或多个独立实验中，对≥150个细胞/条件下（C）中YFP-Parkin和线粒体之间的克隆化进行评分。（E） 将稳定表达YFP-Parkin的HeLa细胞作为（A）处理并进行分馏。富含线粒体的部分在SDS凝胶上运行，并对Parkin进行免疫染色。所有图像中的比例尺代表10µm。
Parkin中的苏氨酸175和217可能与Parkin对线粒体的补充无关
有人提出，PINK1可能通过帕金的一个高度保守的区域/结构域中苏氨酸175和217的磷酸化诱导帕金的线粒体募集，最近将其命名为RING0(图S5A)[27],[41]我们发现，尽管T175和T217突变为丙氨酸阻止了Parkin向线粒体的募集，正如之前报道的那样，磷酸化突变体T175E、T217E和T175、217E并没有自发移位到线粒体。此外，这些磷酸化突变体似乎抑制CCCP诱导的Parkin募集。虽然这些发现并不排除PINK1或其他激酶磷酸化这些位点诱导Parkin招募的可能性，但它们表明这些苏氨酸更有可能发挥重要的结构作用(图S5B和S5C).
PINK1和Parkin基因的患者突变以不同的步长干扰PINK1/Parkin通路
我们评估了PINK1致病突变重建PINK1YFP-Parkin向线粒体募集的能力−/−主要MEF。PINK1中外源性PINK1-WT表达后−/−20µM CCCP处理3 h后，MEF、YFP-Parkin被招募到78.6±3.9%细胞的线粒体(). 我们发现PINK1的L347P患者突变体是不稳定的(和图S6A)，如前所述[28]L347P未能重建YFP-Parkin向去极化线粒体的募集(). 在表现出稳定表达的患者突变中，A168P和H271Q也未能在3小时后重建YFP-Parkin募集，而G309D仅部分重建YFP-Parkin募集（30.7±16.7%）(). G411S多态性，迄今为止仅在杂合子突变病例中发现[42]，以与野生型PINK1相似的程度（74.2±5.4%）重建了YFP Parkin募集，表明含有该多态性的PINK1可能在PINK1/Parkin通路中发挥作用(). 这与G411S可能代表一种自然变异，可能不是真正的致病突变的想法一致。细胞接触CCCP后积累的所有PINK1突变体的蛋白质水平(和图S6A).
致病性PINK1突变体无法重建Parkin募集到去极化线粒体。（A） PINK1的主要MEF−/−用YFP-Parkin（绿色）共转染小鼠并显示V5标记的PINK1构建物以1∶4的比例用DMSO或血清中的20µM CCCP处理3 h。线粒体用抗Tom20抗体（红色）染色。图像中的比例尺表示10µm。中间行和底部行中的图像是由顶部行中的框指示的图像的展开。（B） 在三个或多个独立实验中，对（A）中YFP-Parkin和线粒体之间的克隆化进行了评分，每种条件下的细胞数超过150个。误差线表示标准偏差。（C） 将稳定表达YFP-Parkin的HeLa细胞转染到指定的V5标记结构，在无血清培养基中用二甲基亚砜或2µM CCCP处理3 h，然后分馏。富含线粒体的膜部分在SDS凝胶上运行，并对PINK1、V5标签和线粒体蛋白VDAC进行免疫印迹。
接下来，我们测试了患者Parkin的突变，以确定它们是否会影响Parkin向线粒体的募集和/或Parkin诱导的有丝分裂。Parkin有一个N-末端泛素样结构域（UBL）和一个位于RING（RBR）超结构域之间的C-末端RING，该超结构域由三个非典型的RING结构域组成(). N端RING1的折叠与传统RING结构域（如c-CBL）的折叠最为相似，而中间RING（IBR）和c端RING2可能具有独特的折叠[43]——[45]RBR结构域负责Parkin的泛素连接酶活性，而其UBL结构域被认为通过泛素结合域（UBD）介导Parkin与蛋白质之间的相互作用[46].
Parkin的致病突变破坏了Parkin向线粒体的募集和/或Parkin诱导的有丝分裂。（A） 用含有指示突变的YFP-Parkin（白色和绿色）转染HeLa细胞，并用CCCP处理1 h。用抗Tom20抗体（红色）标记线粒体。底部行中的图像是由中间行中的框指示的区域的展开。WT，野生型。（B） 在三个或更多独立实验中，（A）中YFP-Parkin和线粒体之间的克隆化得分≥150个细胞/条件。（C） HeLa细胞按照（A）进行转染和处理，并分为核后上清液（PNS）、富含线粒体的重膜部分（HMF）和上清液。部分在SDS凝胶上运行，并对Parkin和VDAC进行免疫印迹。（D和E）HeLa细胞如（A）中所述转染并用CCCP或DMSO处理24小时。（E） WT、R42P和R275W Parkin（绿色）的图像染色如（A）所示。星号（*）表示工程突变；所有其他疾病都与帕金森病有关。所有图像中的比例尺代表10µm。（B和D）中的误差线表示标准偏差。
如前所述，在用10µM CCCP处理1小时后，通过共聚焦显微镜将野生型YFP Parkin募集到大多数HeLa细胞（94.7±5.8%）的线粒体中(). UBL结构域的致病性突变（R42P和R46P）、UBL缺失或UBL与UBD相互作用中的关键残基（I44A）突变[47]均导致去极化线粒体Parkin募集中度不足（R42P和R46P分别为34±5.3%和26.5±6.6%）(和图S7A——S7E公司). RING结构域保守半胱氨酸的突变（患者突变C253Y、C289G和C441R以及工程突变C332S）在CCCP治疗1小时时完全破坏招募，导致RING2缺失的突变（病人突变Q311X和工程突变T415X）也会破坏招募(). 突变K211N和C212Y，位于Parkin的一个高度保守区域内，该区域可能是一个新的类环结构域[41](图S5A)，同样阻止Parkin向线粒体募集()与该地区对Parkin活动的重要性相一致。在CCCP暴露24小时后，观察到一些保守的半胱氨酸环突变体（C289G、C332S和C441R）的线粒体募集，这表明这些突变并没有完全破坏募集(图S8A和S8B). 有趣的是，RING1中的R275W突变仅表现出轻度招募缺陷（81.7±2.1%）(). 在活细胞成像实验中验证了YFP-Parkin R275W的招募(图S8C). 尽管在控制条件下，一些突变体形成了可见的聚集体(图S8D)，无突变体，包括R275W，与线粒体共定位(和图S8E).
接下来，我们通过免疫印迹法评估Parkin突变体对去极化线粒体的招募。与我们之前的结果一样[21]在控制条件下，我们在膜组分中发现了一些背景YFP-Parkin信号。用CCCP处理1小时后，富含线粒体的膜部分中野生型Parkin的水平增加，上清液中野生型Parkin的水平降低(). 尽管Parkin R275W的表达略低于野生型，但在CCCP处理后，它也增加了膜部分的定位并减少了上清液中的定位，这与共焦显微镜下观察到的线粒体易位一致(). 然而，R42P或C332S的Western blotting均未检测到膜易位，这表明这些突变体的易位大大低于野生型，与共焦显微镜下观察到的线粒体易位缺陷一致().
我们评估了Parkin突变体诱导有丝分裂的能力。正如我们之前发现的那样[21]CCCP治疗24小时后，未检测到内源性Parkin表达的HeLa细胞中野生型Parkin的表达完全消除了一半以上细胞（59.0±15.1%）的线粒体(). Parkin的UBL突变表现出中度的有丝分裂活性丧失（R42P和R46P的线粒体分别为22.0±2.0%和23.1±8.4%）；而RBR保守半胱氨酸的突变或导致RING2缺失的截断表现出严重的有丝分裂缺陷（0±0%至5.3±2.3%，取决于突变）(). 此外，患者突变R211N和C212Y导致类似的有丝分裂缺陷，支持这可能是类似于RING1、IBR和RING2的非典型RING结构域的观点(). 有趣的是，RING1中的R275W突变也表现出严重的有丝分裂缺陷（4.0±4%）()尽管它似乎在很大程度上保留了向未偶联线粒体移位的能力(). 这种发现模式表明，Parkin向线粒体的募集及其诱导的有丝分裂是可分离的事件。
讨论
我们最近报道，与帕金森病相关的E3泛素连接酶Parkin被选择性地募集到膜电位低的功能失调的线粒体中，以促进其自噬降解，这表明线粒体质量控制的缺乏可能是在Parkin敲除中观察到的线粒体功能障碍的基础果蝇属和老鼠[11]——[15],[17],[21]然而，帕金如何区分受损的去极化线粒体和健康的极化线粒体尚不清楚。
这里，我们显示PINK1选择性地聚集在持续受损的去极化线粒体上。这种选择性积累是通过一种新的机制实现的，在这种机制中，PINK1合成并导入所有线粒体，但通过电压敏感性蛋白水解从健康线粒体中分离出来(图S9). 然而，在失去膜电位的受损线粒体上，PINK1的断裂受到抑制，导致功能失调线粒体上PINK1.线粒体PINK1的表达是Parkin向功能失调线粒体募集并被Parkin选择性清除所必需的。此外，线粒体外膜PINK1表达的增加足以促进Parkin募集和Parkin诱导的有丝分裂，这表明膜电位的丧失主要通过线粒体PINK1的上调激活Parkin的募集。
这个模型为之前的几个观测结果提供了一个简洁的解释。全长线粒体PINK1（～63 kDa[22],[28]——[30]我们的结果表明，全长线粒体PINK1是PINK1/Parkin途径中的活性形式，PINK1-分裂为不稳定的细胞溶质形式，在健康线粒体上维持低水平的PINK1.以便在没有线粒体损伤的情况下抑制PINK1/Parkin途径。此外，该模型还解释了解偶联缬霉素（可以抑制TIM22/23线粒体输入途径）阻断PINK1处理但无法阻断PINK1输入的观察结果[30]我们的模型表明，PINK1输入不需要膜电位，但需要膜电位来选择性地维持健康线粒体上PINK1的低表达。这一机制将线粒体损伤后线粒体电压电位的崩溃与受损线粒体上PINH1的选择性积累耦合在一起。
目前，在哺乳动物细胞中，哪种蛋白酶介导PINK1的裂解尚不清楚。虽然膜内丝氨酸蛋白酶Rhomboid-7似乎是PINK1在果蝇属
[31]，我们的结果表明，哺乳动物细胞中PINK1的裂解不需要其哺乳动物同源基因PARL。这种情况与OPA1的情况类似，OPA1也需要菱形-7才能在果蝇属，但哺乳动物细胞的分裂不需要PARL[48].
此外，还需要进一步研究PINK1裂解是如何被膜电位调节的。蛋白酶本身可能对膜电位敏感，和/或PINK1裂解位点可能仅在存在膜电位的情况下对蛋白酶可用。或者，膜电位对PINK1裂解的调节可能是间接的。线粒体去极化抑制PINK1裂解上调PINK1/Parkin有丝分裂途径，也增加了PINK1's蛋白酶抑制剂上调该途径的可能性，并具有一定的治疗益处。
我们的结果表明，PINK1在其积累后诱导Parkin募集到线粒体的一个特定亚群，并且有几种模型可以解释PINK1如何诱导Parkins募集。最简单地说，随着PINK1的积累，Parkin可以通过与积累的PINK1的直接相互作用被募集到线粒体。为了支持这种模式，PINK1似乎至少在某些情况下直接绑定Parkin[29]或者，PINK1可能需要磷酸化Parkin、Parkin的底物或PINK1和Parkin之间的适配器，从而增加Parkin对线粒体底物或受体的亲和力。这与磷酸化在Parkin激活中的作用一致，我们发现，缺乏激酶的PINK1未能在PINK1-空MEF中挽救Parkin向线粒体的募集（尽管PINK1-KD的处理似乎与野生型PINK1.相同）。我们无法复制Parkin保守区域中两种苏氨酸的磷酸化足以诱导Parkin向线粒体募集的结果[27]，但Parkin可能在其他地方被PINK1磷酸化。然而，如果直接磷酸化足以诱导Parkin向线粒体募集，似乎很难解释Parkin如何靶向线粒体的特定亚群，就像在线粒体生物能量多样性细胞中发生的那样[21].
Parkin和PINK1的突变主要以隐性方式遗传，其功能丧失被认为会导致早发性帕金森病。我们发现，PINK1和Parkin的患者突变以不同的步骤破坏了PINK1/Parkin线粒体周转途径，这与该途径与帕金森病发展的潜在相关性一致。
Parkin’s UBL突变或其缺失导致Parkin募集到去极化线粒体和诱导线粒体吞噬的中度缺陷。UBL的缺失仅部分抑制Parkin向线粒体的募集，这表明尽管该结构域促进Parkin对线粒体的募集作用，但并不一定对募集或随后的有丝分裂有绝对必要。UBL可能通过与含有泛素结合域的蛋白质的相互作用促进Parkin的补充，如突变的残基异亮氨酸44，这对UBL和UBD之间的相互作用至关重要[47]与丙氨酸的结合导致了类似于UBL结构域缺失引起的招募不足。致病突变R42P引起核磁共振的全局去折叠[49]和A46P位于含有I44A的β折叠片的两端，表明这些突变可能通过破坏Parkin和含有UBD的蛋白质之间的相互作用来抑制Parkin的募集(图S7A和S7B).
RBR结构域中关键半胱氨酸残基的突变或负责Parkin泛素连接酶活性的RING2的缺失，严重破坏了Parkin向线粒体的募集及其对线粒体自噬的诱导。有趣的是，Parkin的RING1中的R275W突变只引起去极化线粒体Parkin募集的轻微干扰，但严重干扰了线粒体的有丝分裂，这表明募集和有丝分裂可以在实验上分离。
Parkin的R275W多态性和PINK1的G411S多态性仅在帕金森病患者中被鉴定为杂合多态性[42],[50]因此，这些多态性的致病性一直存在争议。我们的结果表明，R275W Parkin突变影响一个高度保守的精氨酸残基，在我们的有丝分裂测定中导致Parkin功能显著丧失。这与体内数据一致黑腹果蝇，证明Parkin R275W与野生型Parkin不同，不能补偿内源性Parkin的丢失。相比之下，我们发现含有G411S多态性的PINK1，在脊椎动物中保守，但在无脊椎动物中不保守，可以补偿内源性PINK1，这与PINK1 G411S可能是一种天然变体而不是致病突变的观点一致。
Parkin在去极化条件下对PINK1的严格依赖性有点令人惊讶，因为当过度表达时，Parkin可以部分补偿果蝇属在哺乳动物细胞中[11]——[13],[20]Parkin过度表达如何补偿PINK1缺失尚不清楚，但有几种可能的解释。首先，可能存在独立于PINK1和去极化的机制，可以将Parkin招募到功能失调的线粒体中。或者，Parkin可以在细胞中发挥其他独立于PINH1的功能，间接防止线粒体功能障碍；或Parkin可能在某种程度上独立于线粒体对接的过度表达而发挥作用，可能影响细胞溶质室的线粒体吞噬或其他线粒体变化。
在哺乳动物细胞模型和小鼠中PINK1的稳定丢失或敲低导致许多线粒体相关异常。这些细胞或组织中的线粒体表现出电子传递链（ETC）功能障碍、膜电位降低、活性氧生成增加、线粒体断裂和钙调节异常等异常[20],[32],[34],[51]虽然其中一些异常可能是其他异常的可逆后果，例如线粒体断裂可能是由于膜电位低[34]ETC功能障碍和膜电位降低可能在一定程度上是钙调节异常的功能性后果[51]-其他异常可能是由于特定线粒体蛋白质或蛋白质复合体的不可逆功能障碍所致。例如，复合物I和假定的Na+/碳酸钙+PINK1基因敲除后，培养细胞中的转运体似乎功能失调[51]而在缺乏PINK1的小鼠纹状体中，复合物I和II似乎出现功能失调[16].
尽管PINK1缺失细胞中这些异常的直接原因尚不清楚，但一种解释可能是PINK1/Parkin通路未能消除氧化损伤的线粒体，线粒体随着时间的推移而积累是代谢和其他细胞应激的自然结果。Parkin缺失的细胞和组织似乎与PINK1缺失细胞和组织具有一些相同的线粒体缺陷，这支持了这样的观点，即这些异常可能是由于常见PINK1/Parkin通路的缺失所致[17],[18]我们不能排除PINK1除了在PINK1/Parkin通路中发挥信号作用外，还可以积极预防线粒体损伤和功能障碍。例如，PINK1与HtrA2/OMI的交互似乎独立于中的Parkin函数果蝇属
[31],[52],[53].
PINK1和Parkin的缺失对某些细胞群的影响比其他细胞群更大，如黑质神经元，尽管PINK1和Parkins的表达似乎更为广泛。为什么某些组织比其他组织更容易丢失PINK1/Parkin尚不清楚，但这可能与该组织内线粒体的损伤程度有关（例如，SN中的线粒体比其他神经组织中的线粒体承受更大的氧化应激[2]); 冗余的有丝分裂途径的存在（例如，哺乳动物组织可能包含与最近在酵母中发现的途径同源的途径[54],[55]); 组织通过其他方式减轻损伤的能力（由有丝分裂细胞组成的组织可能能够通过细胞周转而不是线粒体周转来管理线粒体损伤）；以及特定组织中的线粒体需求（神经元具有较高的局部代谢需求，多巴胺能神经元需要线粒体缓冲特别高的钙流量[56]). 这些因素中的部分或全部可能导致SN神经元对PINK1和Parkin的特殊依赖。
PINK1和Parkin是常染色体隐性遗传性帕金森综合征的一个重要病因，在基因上与保护线粒体免受渐进性损伤和功能障碍的途径有关。我们发现，PINK1水平和随后Parkin向线粒体的补充受到单个线粒体的生物能量状态的显著调节，这种独特的调节可能使PINK1和Parkin促进受损线粒体的选择性和高效周转。致病性突变导致PINK1或Parkin功能丧失，可能会破坏线粒体周转途径，从而导致功能失调的线粒体在脆弱组织中积聚，从而导致氧化应激增加、代谢抑制，最终加速细胞死亡，这在果蝇属在较小程度上，在疾病的小鼠模型中[11]——[17]总之，这些发现为PINK1和Parkin在果蝇属支持PINK1和Parkin功能缺失如何导致常染色体隐性帕金森综合征的一个新的可测试模型。
支持信息
图S1
线粒体去极化后，线粒体PINK1积聚在线粒体外膜上。（A） 在时间点0用1µM缬霉素处理的HeLa细胞进行分馏，并提取碳酸盐。将富含线粒体完整蛋白质的碳酸盐提取颗粒置于SDS凝胶上，并对内源性PINK1和线粒体蛋白VDAC进行免疫印迹。（B） 在时间点0，用2µM无血清CCCP处理稳定表达YFP-Parkin的HeLa细胞并进行分馏。在SDS凝胶上运行富含线粒体的膜部分（通道1和2）和富含细胞溶质的膜后部分（通道4-9），并对PINK1、微管蛋白和VDAC进行免疫印迹。（C） 粉红色1−/−用不含血清的2µM CCCP处理转染PINK1-myc或未转染的MEF 3 h，然后进行分馏。在SDS凝胶上运行富含线粒体膜部分，并对PINK1和VDAC进行免疫印迹。（D） 用PINK1-YFP或激酶缺陷型PINK1（PINK1KD-YFP）转染的HeLa细胞按（B）处理。在SDS凝胶上运行全细胞裂解产物，并对PINK1和微管蛋白进行免疫印迹。箭头表示全长PINK1-YFP的预测分子量（MW）。（E） 用10µM CCCP处理稳定表达YFP-Parkin的HeLa细胞3 h并进行分馏。对富含线粒体的膜部分进行了鉴定。用0至100µg/ml蛋白酶K处理每等分样品，并对内源性PINK1、外膜蛋白TOM20、内膜蛋白Tim23和基质蛋白Hsp60进行免疫印迹。
（2.72 MB TIF）
图S2
PINK1的积累独立于PARL和Parkin的表达。（A） 用10µM CCCP将共转染PARL-Flag和PARL-shRNA或对照shRNA的HeLa细胞去极化3 h。在SDS凝胶上运行全细胞裂解物，并用PARL N末端、PARL C末端和微管蛋白抗体进行免疫印迹。（B） 用二甲基亚砜或CCCP处理模拟转染或转染shRNA PARL的HeLa细胞3h并进行分馏。在SDS凝胶上运行富含线粒体的膜组分（左）和全细胞裂解物（右），并对PARL、VDAC和/或微管蛋白的C末端PINK1进行免疫印迹。（C） 用PINK1-V5转染野生型或PARL-null MEF，按（B）处理，并进行分馏。在SDS凝胶上运行富含线粒体的重膜部分，并对PINK1、PARL的N末端、PALL的C末端和Hsp60进行免疫印迹。（D） 用二甲基亚砜或2µM CCCP处理未转染的HeLa细胞或稳定表达YFP-Parkin（HeLa/Parkin）的HeLa细胞1小时。在SDS凝胶上运行全细胞裂解物（WCL），并对内源性PINK1和微管蛋白进行免疫印迹。（E） 帕金+/+或Parkin−/−转染PINK1-myc的MEF在无血清的情况下用2µM CCCP处理并分馏。对富含线粒体的膜部分进行PINK1和VDAC免疫印迹。所有图像中的比例尺代表10µm。
（2.32 MB畅通节能法）
图S3
PINK1是Parkin向线粒体募集所必需的。（A） SV40改造PINK1−/−用YFP-Parkin（绿色）和载体PINK1或PINK1-KD共同转染的MEF用20µM CCCP处理3 h。对细胞进行Tom20（红色）免疫染色。（B） 用二甲基亚砜或10µM CCCP处理稳定转染对照shRNA或PINK1 shRNA并转染YFP-Parkin的M17神经母细胞瘤细胞3 h，并将其分离为核后上清液（PNS）、富含线粒体的重膜部分（HMF）和上清（Sup）。在SDS凝胶上运行组分，并对Parkin、PINK1和VDAC进行免疫印迹。图像中的比例尺表示10µm。
（139百万TIF）
图S4
线粒体外膜PINK1表达增加足以补充Parkin。（A） PINK1-YFP、FRB-PINK1（111–581）-YFP和Tom20（1–33）-FKBP结构示意图。如果FRB和FKBP结构域位于同一个隔室中，则在雷帕霉素类似物AP21967的存在下，它们会异源二聚。（B） 用PINK1（111–581）-YFP和Tom20（1–33）-FKBP转染HeLa细胞，并进行活体成像。在时间点0添加雷帕霉素类似物AP21967（250 nM）。（C） 共焦图像描绘了FRB-PINK1（111–581）-YFP（绿色）与Tom20（1–33）-FKBP共转染后，用载体或250 nM AP21967处理30分钟后的定位。线粒体用电位染料TMRE（红色）标记。（D） 共焦图像描绘了用载具或250 nM AP21967处理8小时后FRB-PINK1（111–581）-YFP（绿色）和mCherry-Parkin（红色）的定位。所有图像中的比例尺代表10µm。
（2.16 MB畅通节能法）
图S5
Parkin、T175和T217上假定的PINK1磷酸化位点不足以招募Parkin。（A） 包含T175和T217的高度保守Parkin独特区域/域的比对。顶部的箭头显示了苏氨酸175和217以及致病突变C212的位置。对齐底部的括号指向保守的半胱氨酸和组氨酸残基，形成RING0结构域的推定锌结合位点I和II。（B） 用含有指示点突变的YFP-Parkin（白色）转染HeLa细胞，并用DMSO或CCCP处理1 h。用抗Tom20抗体标记线粒体。（C） 在三个或多个独立实验中，对（A）中YFP-Parkin和线粒体之间的克隆化进行了评分，每种条件下的细胞数超过150个。所有图像中的比例尺代表10µm。
（2.17 MB畅通节能法）
图S6
PINK1致病突变不影响PINK1-诱导的积累。（A） 在无血清培养基中用二甲基亚砜或2µM CCCP处理转染V5标记的PINK1构建物的稳定表达Parkin的HeLa细胞。在SDS凝胶上运行全细胞裂解产物，并对PINK1、V5标签和微管蛋白进行免疫印迹。
（0.67 MB畅通节能法）
图S7
Parkin泛素样结构域（UBL）的突变部分破坏了Parkin向线粒体的募集。（A） 同源Parkin蛋白UBL部分氨基酸序列的比对。星号（*）表示下面检查的患者突变（R42P和R46）和工程突变（I44A）的位置。红色方框表示包含I44的β-折叠片的位置，I44是UBL域和泛素结合域之间相互作用的关键残基。（B） UBL（PDB 1IYF）的结构，患者突变位置（R42P和A46P）以蓝色突出显示，工程突变位置I44A以红色突出显示。（C和D）转染含有指示突变（绿色）的YFP-Parkin的HeLa细胞，用CCCP处理1小时（C）或24小时（D）。用Tom20抗体（红色）标记线粒体。（E） 在三个或更多独立实验中，（C）中YFP-Parkin和线粒体之间的克隆化得分≥150个细胞/条件。（F） 在三个或更多独立实验中，未转染线粒体并按（D）中所述进行处理的细胞百分比得分≥150个细胞/条件。所有图像中的比例尺代表10µm。
（370百万桶/立方英尺）
图S8
Parkin突变扰乱Parkin的募集和/或Parkin介导的有丝分裂。（A） 在三个或多个独立实验中，对转染了YFP-Parkin（绿色）的HeLa细胞（含有指示的错义突变），用血清中的10µM CCCP处理24 h，以评估Parkin与线粒体在≥150个细胞/条件下的共定位。线粒体进行Tom20免疫染色（红色）。（B） 共焦图像代表（A）。（C） 转染YFP-Parkin R275W（绿色）的HeLa细胞进行活体成像。在时间点0添加CCCP（10µM）。（D） 用DMSO或10µM CCCP处理转染有所示结构的HeLa细胞24小时，并在三个或更多独立实验中对每种条件下≥150个细胞中可见聚集物的细胞百分比进行评分。（E） 转染YFP-Parkin WT（绿色）或YFP-Parkin R275W（绿色）的HeLa细胞用DMSO或CCCP处理1h，并进行活体成像。线粒体用电位染料TMRE（红色）染色。所有图像中的比例尺代表10µm。
（2.40 MB TIF）
图S9
模型描述了通过膜电位对健康和功能失调线粒体PINK1稳定性的调节。在健康的线粒体上，PINK1由组分导入，蛋白水解分解为细胞溶质形式，并被蛋白酶体降解，导致线粒体PINK1水平较低。然而，在膜电位较低（ΔΨ）的受损线粒体上，PINK1的裂解被阻断，导致线粒体PINK1在功能失调的线粒体上堆积。堆积的PINK2将Parkin招募到受损线粒体，Parkin可能通过泛素化标志着线粒体的自噬降解。
（0.39 MB畅通节能法）
视频S1
PINK1-YFP在线粒体上积聚。瞬时转染PINK1-YFP（绿色）的HeLa细胞在CO中培养2-独立培养基（Gibco）培养1h，然后在时间点0用10µM CCCP处理。使用35°C的PerkinElmer UltraView LCI（活细胞成像）系统，每1分钟拍摄一次细胞图像，持续40分钟。
（2.67 MB MOV）
视频S2
mCherry-Parkin被募集到线粒体中。以1∶1的比例瞬时转染mCherry-Parkin（红色）+空载体的HeLa细胞在CO中培养2-独立培养基（Gibco）培养1h，然后在时间点0用10µM CCCP处理。使用35°C的PerkinElmer UltraView LCI（活细胞成像）系统，每1分钟拍摄一次细胞图像，持续68分钟。
（200毫巴MOV）
视频S3
外源性PINK1表达增强了mCherry-Parkin向线粒体募集的动力学。以1∶1的比例瞬时转染mCherry-Parkin（红色）+PINK1-YFP的HeLa细胞在CO中培养2-独立培养基（Gibco）培养1h，然后在时间点0用10µM CCCP处理。使用35°C的PerkinElmer UltraView LCI（活细胞成像）系统，每1分钟拍摄一次细胞图像，持续51分钟。
（4.11 MB MOV）
