Mutations in PTEN-induced putative kinase 1 associated with recessive parkinsonism have differential effects on protein stability

doi:10.1073/pnas.0500617102

.2005年4月19日；102(16):5703-8.

doi:10.1073/pnas.0500617102。 Epub 2005年4月11日。

与隐性帕金森综合征相关的PTEN诱导的假定激酶1突变对蛋白质稳定性有不同影响

亚历山德拉·贝利纳¹, 马塞尔·范德布鲁格, 里利·艾哈迈德, 萨希·凯萨瓦帕尼, 大卫·W·米勒, 格雷戈里·佩特斯科, 马克·库克森

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与隐性帕金森综合征相关的PTEN诱导的假定激酶1突变对蛋白质稳定性有不同影响

亚历山德拉·贝利纳等。美国国家科学院程序. 2005.

.2005年4月19日；102(16):5703-8.

doi:10.1073/pnas.0500617102。 Epub 2005年4月11日。

作者

亚历山德拉·贝利纳¹, 马塞尔·范德布鲁格, 里利·艾哈迈德, 萨希·凯萨瓦帕尼, 大卫·W·米勒, 格雷戈里·佩茨科, 马克·库克森

附属

¹美国马里兰州贝塞斯达Convent Drive 35号国家老龄研究所/NIH神经遗传学实验室，邮编：20892-3707。

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摘要

据报道，PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）基因的几个突变与隐性帕金森综合征有关。该编码蛋白被预测为靶向线粒体的Ser/Thr蛋白激酶。在本研究中，我们研究了突变对PINK1激酶活性的体外影响以及对哺乳动物细胞表达水平和定位的影响。我们选择检测两个点突变：G309D，最初报告稳定并在细胞中正确定位；L347P，因为它在菲律宾存在明显的载波频率，所以引起了人们的兴趣。我们能够确认激酶活性，并产生稳定但缺乏活性的人工“激酶死亡”突变体。L347P突变严重破坏PINK1的稳定性并显著降低激酶活性，而G309D在体外对这些参数的影响要小得多。这一发现与基于同源模型的预测一致。我们还使用在蛋白两端标记myc或GFP的构建物来检测PINK1在转染哺乳动物细胞中的定位。这些结果表明，PINK1在N端以与线粒体输入一致的方式进行处理，但成熟蛋白也存在于胞浆中。这一观察结果的生理相关性尚不清楚，但它意味着PINK1的一部分可能在线粒体中加工后被输出。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
PINK1激酶活性及其突变的影响*在体外*.(一)PINK1激酶结构域模型显示了关键天冬氨酸的位置和本研究研究的两个隐性突变。下部在指示的轴上旋转90°。(b条)野生型PINK1 GST融合蛋白的表达和自磷酸化活性从左到右显示考马斯染色的SDS/PAGE凝胶、Western blot和放射自显影。如图所示，备用车道仅包含GST。箭头表示GST-PINK1融合蛋白，填充箭头显示显著的分解产物，而开放箭头显示单独的GST。所有凝胶或斑点右侧的标记均以千道尔顿为单位。(*c（c）*)PINK1突变体的激酶活性显示自射线图(顶部)，考马斯染色(中部)和合并放射性的定量，针对蛋白质负荷进行校正。图中显示了野生型PINK1（车道1）与人工激酶突变体（K219A，车道2；D362A，车道3；D384A，车道4；三激酶缺失突变体，车道5）的比较。与人类帕金森综合征相关的两个隐性突变体L347P和G309D显示在第6和第7车道。(底部)条形图显示三个独立实验的平均值，误差条形图显示SEM。通过方差分析和Fisher的PLSD事后检验评估变异体之间的活性差异；*,*P（P）*< 0.05;**,*P（P）*< 0.01;*******,*P（P）*< 0.001.

**图2。**
哺乳动物细胞中PINK1蛋白的加工。用myc标记的基因转染COS-7细胞(一)或GFP标记(b条)构造。使用N-末端（泳道1）和C-末端（泳道2）标记的版本一)或GFP转染的细胞（第3通道b条)作为对照。箭头显示前蛋白（N末端断裂前），填充箭头表示成熟肽。GFP构造中的开放箭头显示了可能的N端片段（请参见结果);*在未转染细胞中观察到myc单克隆抗体的交叉反应。(*c（c）*)亚细胞分离。用GFP标记的PINK1或未经转染的PINK1转染COS-7细胞，并将细胞裂解物分离成10000×克颗粒（P10，4-6车道）和100000×克上清液（S100，1–3道）部分。印迹用Hsp70和VDAC1的抗体在中部和底部分别为（开放箭头）。数据代表每个构造的两个以上实验。所有印迹右侧的标记均以千道尔顿为单位。

**图3。**
转染细胞中蛋白质的定位。(一–*e（电子）*)在COS-7细胞的N端转染GFP标记的PINK1构建物(b条和*c（c）*)或C终点站(d日和*e（电子）*)无固定或染色。在相同曝光设置下采集的未转染细胞显示为一.(*（f）*–k)转染细胞，N末端(*（f）*–小时)或C端子(我–k)myc标记为PINK1并用MitoTracker复染。固定后，用抗myc单克隆抗体（绿色*（f）*和我)和MitoTracker（红色克和小时). 合并的图像如所示小时和k.(我–o个)GFP与myc标记的蛋白质，仅显示合并图像。箭头在我表示N-GFP-PINK1和MitoTracker与转染PINK1-C-GFP的细胞之间重叠的区域，其中信号保持分离（箭头位于米). （比例尺：10μm）每个图像代表每个构造至少进行三次重复实验。

**图4。**
突变对哺乳动物细胞PINK1蛋白稳定性的影响。(一)将带有GFP标记的PINK1变异体的N末端（通道2、4、6和8）或C末端（通道3、5、7和9）转染COS-7细胞，或保留未转染的PINK1变异体作为对照（通道1）。与野生型（第2和第3道）对照组或人工激酶死亡构建物（第4和第5道）相比，L347P（第6和第7道）隐性突变体PINK1的稳态蛋白质水平降低，而G309D（第8和第9道）隐性突变PINK1。箭头表示前蛋白的位置，填充的箭头表示成熟蛋白质，开放的箭头表示用作负荷控制的β-肌动蛋白的位置。我们对这两种蛋白质进行了定量(b条)和mRNA(*c（c）*)所有构造的表达式n个=3个实验。对于蛋白质数据，我们测量了N末端结构（填充条）的前蛋白带强度，以及C末端结构的前蛋白（开放条）和成熟蛋白（阴影条）。*，蛋白质水平与野生型构建物显著不同(*P（P）*方差分析结果<0.01）。(d日)蛋白质稳定性的脉冲追踪分析。将N末端GFP标记的野生型瞬时转染COS-7细胞(上部)或L347P(下部)PINK1，标有³⁵S-Met/Cys和使用未标记媒体追逐0–8小时，如每条车道上方所示。显示了该实验的量化，曲线拟合为单相指数衰减函数。在重复实验中获得了类似的稳定性估计。

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