美国国家科学院院刊。2007年1月23日；104(4): 1325–1330.
呼吸系统缺失多巴胺神经元小鼠的进行性帕金森综合征
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达格马尔·高尔特
‡瑞典斯德哥尔摩S-17177卡罗林斯卡学院神经科学系；和
朱顺伟
§瑞典斯德哥尔摩S-14186卡罗林斯卡大学医院卡罗林斯卡研究所Neurotec；
克里斯托夫·霍夫斯特特
‡瑞典斯德哥尔摩S-17177卡罗林斯卡学院神经科学系；和
伊娃·林德奎斯特
‡瑞典斯德哥尔摩S-17177卡罗林斯卡学院神经科学系；和
塞巴斯蒂安·塔姆
‡瑞典斯德哥尔摩S-17177卡罗林斯卡学院神经科学系；和
安妮塔·伯格斯特兰德
‡瑞典斯德哥尔摩S-17177卡罗林斯卡学院神经科学系；和
巴里·霍弗
¶美国国立卫生研究院国家药物滥用研究所，马里兰州巴尔的摩Nathan Shock Drive 5500号，邮编21224
斯塔凡·卡尔海姆
‡瑞典斯德哥尔摩S-17177卡罗林斯卡学院神经科学系；和
阿卜杜勒·穆罕默德
§瑞典斯德哥尔摩S-14186卡罗林斯卡大学医院卡罗林斯卡研究所Neurotec；
拉尔斯·奥尔森
‡瑞典斯德哥尔摩S-17177卡罗林斯卡学院神经科学系；和
†检验医学和
§瑞典斯德哥尔摩S-14186卡罗林斯卡大学医院卡罗林斯卡研究所Neurotec；
‡瑞典斯德哥尔摩S-17177卡罗林斯卡学院神经科学系；和
¶美国国立卫生研究院国家药物滥用研究所，马里兰州巴尔的摩Nathan Shock Drive 5500号，邮编21224
Rolf Luft通讯，卡罗琳斯卡大学医院，瑞典斯德哥尔摩，2006年12月4日。
作者贡献：M.I.E.、S.T.、S.C.、A.H.M.、L.O.和N.-G.L.设计的研究；M.I.E.、M.T.、D.G.、S.Z.、C.H.、E.L.、S.T.、A.B.、F.S.H.、A.T.和L.O.进行了研究；M.I.E.、M.T.、D.G.、S.T.、A.B.、F.S.H.、B.H.、S.C.、A.H.M.、L.O.和N.-G.L.分析数据；B.H.、L.O.和N.-G.L.撰写了这篇论文。
摘要
线粒体功能障碍与帕金森氏病（PD）的病理生理学有关，PD是一种常见的年龄相关性神经退行性疾病，以神经元内包涵体（路易小体）和黑质纹状体多巴胺（DA）系统进行性变性为特征。最近有研究表明，帕金森病患者和老年人中脑DA神经元含有大量的线粒体DNA突变，可能损害呼吸链功能。然而，临床研究尚未确定呼吸链缺陷是否是导致包涵体形成和DA神经元死亡的主要异常，或退化DA神经元内的全身代谢异常是否会导致线粒体继发性损伤。我们使用反向遗传方法来研究这个问题，并创建了条件敲除小鼠（称为MitoPark小鼠），破坏线粒体转录因子a的基因(Tfam公司)DA神经元。敲除小鼠的中脑DA神经元中mtDNA表达减少，呼吸链缺乏，这反过来又导致帕金森病表型，成年后开始缓慢进行性的运动功能损伤，并伴有神经内包涵体的形成和多巴胺神经细胞死亡。共焦显微镜和电子显微镜显示，包涵体包含线粒体蛋白和膜成分。这些实验表明DA神经元的呼吸链功能障碍可能在PD中具有病理生理学意义。
关键词：包涵体、线粒体、线粒体DNA、神经变性、帕金森
线粒体DNA编码呼吸链的13个关键亚单位，因此线粒体DNA的表达对线粒体的生物发生至关重要(1). 线粒体DNA突变导致人类多种神经退行性表型，线粒体功能障碍也与常见的年龄相关性神经退行性病有关(2). 间接证据表明线粒体功能障碍在散发性PD中的作用(2). 此外，对罕见遗传型PD家族的研究已经确定了参与调节线粒体功能的基因(三–5). 额外的支持来自对毒素的实验研究，这些毒素抑制线粒体呼吸链复合体I并导致中脑DA神经元死亡(6). 然而，由于神经毒素可能对多巴胺（DA）神经元有多效性药理作用，对非DA细胞类型有影响，或两者兼有，因此对神经毒素实验结果的解释很复杂(6). 线粒体功能障碍可能是帕金森病病因学重要性的假说最近得到了新的关注，因为研究表明，帕金森病患者呼吸链缺陷DA神经元的比例增加(7). 正常衰老与体细胞线粒体DNA突变的积累和散在细胞色素的出现有关c（c）各种器官中缺乏氧化酶（COX）的细胞(8,9). 对单个COX缺乏细胞的分析表明，它们通常含有高水平的线粒体DNA，并伴有躯体获得性缺失或点突变(8,9). 对表达线粒体DNA聚合酶催化亚单位易出错版本的线粒体DNA突变小鼠的研究提供了额外的实验证据，表明高水平的体细胞线粒体DNA突变可直接导致哺乳动物的多种衰老表型(10).
对COX活性正常的DA神经元线粒体DNA突变水平的分析表明，PD患者和老年对照组的线粒体DNA缺失水平很高，突变负荷随年龄增长呈线性增加(7). 中脑DA神经元的体细胞mtDNA突变水平远高于其他类型神经元的这些水平(7). 同一研究报告称，帕金森病患者中脑约3%的COX缺乏DA神经元，而年龄匹配的对照组的水平要低得多(7). 在正常衰老过程中，中脑DA神经元逐渐丧失(11)观察到的体细胞线粒体DNA突变的积累可能导致呼吸链缺陷，从而导致细胞丢失(7).
对人体组织的研究只能产生相关数据，因此，实验验证线粒体功能障碍可能是帕金森氏病（PD）的病因这一假设非常重要。研究这个问题的一种方法是制造中脑DA神经元组织特异性呼吸链缺陷的小鼠。通过使用液氧磷-线粒体转录因子A的侧翼等位基因(Tfam公司液氧磷)结合组织特异性cre公司-重组酶表达(12–18). TFAM蛋白是哺乳动物线粒体DNA维持所必需的(12,19)通过直接结合和包覆mtDNA来调节mtDNA拷贝数(19). 此外，TFAM对于mtDNA启动子的转录起始是绝对必要的(20). 我们在这里报告了组织特异性敲除Tfam公司DA神经元出现严重呼吸链缺陷，伴有成人缓慢进展的典型帕金森病特征。因此，我们的发现为获得性呼吸链功能障碍可能在帕金森病中具有病理生理重要性的假设提供了实验支持。
结果
创建DAT-核心老鼠。
指导cre公司-DA神经元表达重组酶，我们首先引入cre公司-多巴胺转运体（DAT）位点的基因和新霉素耐药基因(21)获得杂合子DAT-cre-neo公司老鼠(一个). 接下来，我们通过以下方法切除新霉素基因体内Flp-Flt-介导的重组(22)获得杂合子DAT-核心老鼠(一个). 我们使用就地杂交(B类)和报告鼠交配(23)激活β-半乳糖苷酶的表达cre公司-表达细胞(C)，以确定DAT-核心小鼠表达cre公司mRNA和酶活性cre公司-中脑DA神经元中的重组酶蛋白。
创建MitoPark老鼠。(一个)DAT-cre小鼠的创建。包含NLS-cre公司（cre）基因后接FRT公司-侧翼（箭头）新霉素（neo）基因插入外显子2翻译起始密码子的上游。这个新的通过繁殖FLPe缺失小鼠去除该基因。非编码外显子序列为蓝色，编码序列为红色(B类)现场中脑多巴胺神经元杂交。探测TH和cre公司杂合子SN和VTA的mRNA显示重叠杂交信号DAT-核心鼠标。(C)ROSA26-R报告小鼠的免疫组织化学DAT-核心敲入等位基因。这个cre公司蛋白表达以与SN和VTA中TH蛋白表达重叠的模式激活β-半乳糖苷酶蛋白表达。(D类)细胞色素c（c）20周龄对照小鼠的氧化酶（COX）活性在VTA中正常，而相同年龄的MitoPark小鼠的COX活性显著下降（蓝色染色表示COX缺乏神经元）。(E类)现场杂交显示细胞色素表达降低c（c）6周龄MitoPark小鼠中脑DA神经元氧化酶亚单位I（COX I）mRNA（箭头所示）(右上)与控件相比(左上).现场杂交检测相邻切片SN和VTA DA神经元中TH mRNA的表达(下部).
中脑DA神经元mtDNA表达降低的小鼠。
我们过去了DAT-核心鼠标和带有液氧磷-侧翼的Tfam公司等位基因(Tfam公司液氧磷)生产MitoPark小鼠（基因型+/DAT-cre、Tfam液氧磷/Tfam公司液氧磷)纯合子断裂Tfam公司中脑DA神经元。现场杂交检测到6周龄MitoPark小鼠黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）DA神经元中mtDNA编码的COX亚单位I mRNA的表达显著降低(E类). 通过对20周龄MitoPark小鼠中脑DA神经元的组织化学分析，我们还发现COX酶活性显著降低(D类). 这些发现表明，线粒体DNA表达严重降低，进而导致MitoPark小鼠中脑DA神经元严重呼吸链缺陷。
DA反应性进行性帕金森综合征的成人发病。
MitoPark小鼠的胚胎或新生儿死亡率没有增加。在约14-15周时，运动减少和探索行为减少最为明显。我们观察到大约20周龄时出现震颤、抽搐加剧和明显肢体僵硬的症状进展，而MitoPark小鼠由于一般状况不佳，不得不在大约45周龄时被处死。我们进行了行为测试，以定量测量MitoPark小鼠临床上明显的运动障碍，并发现两种运动能力都在逐渐下降(A–C)和养育(D类)在14周大的MitoPark小鼠中。单剂量的左旋多巴显著改善了运动性能( E–G公司)有趣的是，与老年MitoPark小鼠相比，相同剂量的L-DOPA在年轻小鼠中引发了更显著、更持久的运动反应( E类和F类). 年长的MitoPark小鼠的运动反应突然终止，类似于晚期PD的“消退”效应(E类).
MitoPark小鼠自发活动和运动功能分析。(A–D)MitoPark的运动和饲养（白点/条；n个=8）和对照小鼠（黑点/条；n个=7）在开放式野外活动笼中测量60分钟。10周龄MitoPark小鼠的运动与年龄匹配的对照组无显著差异(一个)而14周龄的MitoPark小鼠运动能力下降(B类). 总运动量(C)和整体饲养(D类)MitoPark小鼠在60分钟内随着年龄的增长而减少(n个=12），但在年龄匹配的对照组中没有(n个= 12). 误差线表示±SEM。与年龄匹配的对照组相比，统计学上的显著差异表示为：*，P（P）< 0.05; ∗∗,P（P）< 0.01; ∗∗∗,P（P）< 0.001. (E–G公司)20周龄和30周龄的MitoPark（白点/条；n个=12）和对照小鼠（黑点/条；n个=15）用左旋多巴（20 mg/kg）或生理盐水治疗。(E类)20周龄的对照组（黑色方块）、30周龄的控制组（黑色三角形）、20周龄MitoPark小鼠（白色方块）和30周龄Mito Park小鼠的运动（白色圆圈）。两个年龄段的MitoPark小鼠对左旋多巴治疗的反应是运动增加(E类和F类)和养育(G公司). L-DOPA治疗年轻的MitoPark小鼠比治疗老年的MitoPark小鼠产生更大的运动反应(E类). L-DOPA对对照小鼠无影响(E类和F类). L-DOPA治疗后，两个年龄组的MitoPark小鼠的饲养增加情况相似(G公司). 平均值±SEM用条表示。横杆显示平均运动(F类)和平均抚养(G公司)对照组和用生理盐水（Sal）或左旋多巴（LD）治疗的MitoPark小鼠。统计上的显著差异如下：*，P（P）< 0.05; ∗∗,P（P）< 0.01; ∗∗∗,P（P）< 0.001.
中脑DA神经元和纹状体DA神经终末的渐进性丢失。
12周龄时，首次在背外侧纹状体中观察到DA神经支配的缺失，随着MitoPark小鼠年龄的增长，这种缺失会累及大多数背侧和腹侧纹状体(A–D). 对表达酪氨酸羟化酶（TH）的中脑神经元数量的量化显示出缓慢的进行性细胞丢失，与主要支配腹侧纹状体和皮质区的VTA相比，SN的细胞丢失更显著，发病时间更早，SN主要支配背侧纹状体炎( E–I公司). 这种差异性变性也是人类帕金森病的特征。我们进行了神经化学研究，证实DA神经细胞的缺失导致20周龄MitoPark小鼠黑质纹状体系统不同部位相应的DA缺失( J型和K（K）). 我们还发现20周龄MitoPark小鼠纹状体中DA代谢物高香草酸（HVA）和3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）与DA的比率显著增加(L（左）)与DA缺乏和人类PD中常见的DA周转增加相一致。
MitoPark小鼠中脑TH免疫组化和DA水平。(A–D)对照组纹状体TH免疫反应(一个)和MitoPark老鼠(B–D类). (E–H（E–H）)对照组SN和VTA中TH免疫反应性(E类)和MitoPark(F类和G公司)老鼠。(我)定量评估不同年龄MitoPark小鼠SN（黑条）和VTA（白条）中的细胞丢失。(J型和K（K）)DA和DA代谢物水平的测量。纹状体DA水平(J型)和其他大脑区域(K（K）)20周龄对照小鼠（黑条）和MitoPark小鼠（白条）。EM，正中棘（=A12区），河马：海马结构。(L（左）)20周龄对照（黑条）和MitoPark（白条）小鼠纹状体中DA代谢物HVA和DOPAC（DO）与DA的比值。误差线表示±SEM。与年龄匹配的对照组相比，统计学上的显著差异表示为：*，P（P）< 0.05; ∗∗,P（P）< 0.01; ∗∗∗,P（P）< 0.001.
与线粒体相关的神经元内包涵体。
在6周龄的MitoPark小鼠中，没有观察到DA细胞丢失(F类)尽管mtDNA表达严重降低(E类)中脑DA神经元。然而，DA神经元在这一临床症状前阶段并不正常，因为其中大多数含有小的细胞质聚集物(A–D). 针对人类α-突触核蛋白（h116–131）肽的多克隆抗体与神经元内内含物呈强免疫反应性。然而，另外五种抗体（参见方法)针对α-突触核蛋白的内含物没有免疫反应性，尽管它们在未受影响的神经元中引起了预期的α-突触核蛋白样免疫反应性。这些结果对h116–131α-突触核蛋白抗体检测小鼠α-突触核蛋白的特异性提出了质疑，因此我们将MitoPark小鼠培育为α-突变体敲除小鼠(24). 功能性α-突触核蛋白基因的缺失对MitoPark小鼠的表型没有明显影响（数据未显示）。出乎意料的是，包涵体也保留了下来，并且在缺少功能性α-突触核蛋白基因的MitoPark小鼠中与h116-131抗体呈免疫反应（数据未显示）。因此，我们得出结论，包涵体不包含α-synuclein，并且h116-131抗体与包涵体的未知成分发生反应。因此，在我们的小鼠中，PD表型和DA神经元内含物的发育都不需要α-突触核蛋白。由于h116–131抗体在检测包涵体方面具有良好的信噪比特性，我们使用该抗体进一步研究了退化DA神经元中此类包涵体的丰度和位置。大多数中脑DA神经元中存在内含物(C)随着神经退行性变的进展，它们的平均大小增加(D类). 在非DA神经元中未发现内含物。用电子显微镜检查了11周龄的MitoPark和对照小鼠中脑的超薄切片。仅在MitoPark小鼠中，我们观察到大的、轮廓清晰的、部分电子密度的小体，通常位于靠近神经元体的树突结构中(). 其中一些小体具有无定形的成分和弥散的衬里，而其他小体则呈管状，并被不同的双层膜包围( B类和C). 我们甚至观察到了似乎是过渡状态的情况，其中身体的一部分开始变得致密，边界弥散，而另一部分仍然保持其膜和管状系统(C). 内含物中的双膜结构是线粒体膜的典型超微结构，因此我们在共聚焦显微镜下对组织切片进行免疫标记。我们发现了许多例子，其中线粒体标记蛋白，即线粒体ATP合成酶的核编码α亚基，部分与内含物重叠、并置甚至围绕内含物( E类和F类). 这些数据强烈表明，功能失调的线粒体在胞质内包涵体的形成中起着直接作用。
细胞内包涵体分析。(一个和B类)VTA和SN的TH免疫反应DA神经元（红色）中免疫反应内含物（绿色）的共焦显微镜图像(C)不同年龄MitoPark小鼠SN和VTA中每个DA神经元聚集数的量化。(D类)不同年龄MitoPark小鼠SN和VTA DA神经元聚集物的大小。(E类和F类)双重免疫荧光标记检测内含物（绿色）和线粒体（红色）后聚集物的高倍共聚焦图像。
说明神经元内内含物形态的电子显微照片。(一个)神经细胞中含有核仁的内含物（箭头）。(B类)由五个异常线粒体和内含线粒体膜的内含物组成的簇。(C)高倍放大混合形态的单个夹杂物，位于枝晶中（用虚线表示）。夹杂物的无定形部分显示出弥漫的衬里和溶解的膜，而身体较完整的部分显示出管状结构和可见的双层膜。星号表示与树突突触接触的树突。
讨论
我们证明，小鼠DA神经元的呼吸链缺乏会导致帕金森病的特征性表现，包括缓慢进行的神经元变性、典型的行为障碍和神经内包涵体的形成。我们提出了功能失调的线粒体直接参与包涵体形成的证据。然而，我们没有在这些包涵体中发现α-突触核蛋白的证据，尽管α-突触核蛋白在人类PD的路易小体中普遍存在。事实上，即使在缺乏功能性α-突突核蛋白基因的MitoPark小鼠中，也很容易形成包涵体。现有数据表明路易尸体可以有多种形态(25)有人认为它们的形态是随着时间演变的(25). 其他人的研究表明，α-突触核蛋白和线粒体之间可能存在相互作用。体外研究表明，α-突触核蛋白可以与膜中的脂质直接相互作用(26,27)线粒体呼吸链的蛋白质(28,29). 路易体的形态主要在从终末期帕金森病患者获得的脑组织中进行了研究，因此尚不清楚这些聚集体在疾病早期是如何出现的。
呼吸链缺陷导致MitoPark小鼠内含物形成的机制尚需阐明。先前的研究表明，活性氧的形成和氧化应激在PD中很重要。然而，呼吸链功能障碍和氧化应激之间没有绝对联系。我们研究了多种mtDNA表达降低的小鼠模型(10,12–18)这些小鼠增加了细胞死亡，但几乎没有或几乎没有增加氧化应激(18,30). 因此，应该强调的是，PD可能的线粒体病因学并不意味着活性氧和氧化应激具有重要意义。
呼吸链的功能取决于线粒体DNA和核基因的协调表达，而这两个基因组的平衡表达对于多亚单位呼吸链酶复合物的正确组装是必要的。线粒体网络有一个精细的蛋白质降解系统，涉及基质中的膜结合AAA蛋白酶和LON蛋白酶(31). 线粒体DNA表达减少导致过量的核编码呼吸链亚单位，这些亚单位必须被线粒体蛋白水解酶系统降解。组织特异性诱导的进行性心肌病小鼠模型的基因表达研究Tfam公司敲除导致线粒体DNA缺失，已证明强烈诱导LON蛋白表达(14). 我们推测，线粒体DNA表达减少可能导致DA神经元线粒体中核编码蛋白的聚集，而这一事件可能会启动一个也涉及非线粒体蛋白的聚集过程。
总之，我们利用转基因技术提供了遗传证据，证明中脑DA神经元呼吸链功能的原发性缺陷导致小鼠关键PD特征的逐步发展：(我)成年神经变性发作(ii（ii）)缓慢进行的临床过程(三)神经元内包涵体的形成(四)SN的细胞死亡发病早于VTA，且细胞死亡范围更广(v（v）)对左旋多巴治疗的反应取决于疾病阶段。以前的小鼠模型没有再现PD的所有特征，因此MitoPark小鼠可能为研究PD的关键病理生理事件提供了平台。此外，我们的结果为以下假设提供了实验支持：线粒体DNA表达减少可能是PD的病因事件。
材料和方法
的结构DAT-核心老鼠。
含有多巴胺转运体基因（DAT）5′端的DNA克隆是从129/SvJλFix II噬菌体文库（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫内）获得的。从外显子1上游延伸到内含子5下游的A≈3.7-kb序列用NotI释放，并亚克隆到pBlueScript II SK中，生成pME1。安NLS-cre/FRT-neo-FRT盒式磁带是通过几个步骤将所需的元件进行亚克隆而构建的。首先，用SalI–KpnI释放pBlueScript II SK的多克隆位点盒，并用含有FRT重组位点和必要限制酶位点（SacI/PacI/SalI/EcoRI/KpnI/FRT-sequence/XhoI/EcoIRI/SacII/AscI/KpnI*）的合成寡核苷酸替换，从而生成pME2。pME2的KpnI位点在克隆过程中失活。DNA片段编码NLS-cre公司使用SalI–KpnI从pML78（Mark B.Lewandoski，国家癌症研究所，Frederick，MD）中释放，并连接到pME2，生成pME3。接下来，一种含有FRT公司-序列是在pMC1neo–poly（A）（由卡罗林斯卡研究所托马斯·帕尔曼提供）中的多聚腺苷化位点之后，使用BamHI和SacII引入的。这个新FRT然后用XhoI–SacII释放构建体，并连接到pME3中，产生pME4。为了最终组装靶向构建物，将pBlueScript II SK的MCS替换为含有寡核苷酸的限制性位点，以插入5′和3′同源臂，并将其用于NLS-cre/FRT-neo-FRT盒式磁带（SacI/NotI/BamHI/SmaI/PacI/BamHI/AscI/EcoRV/BamHI/EcoRI/KpnI），生成pME5。分别用NotI–FspI和FspI–EcoRI从pME1中释放5′和3′同源臂，并使用NotI–SmaI和EcoRV–EcoRI将其插入pME5中。内源性DAT翻译起始位点位于外显子2，我们构建的质粒在内含子1中引入了一个盒。最后，我们引入了一个短的合成寡核苷酸，以在PacI位点重建内含子1/外显子2边界的序列，该序列与引入的序列相距5′cre公司基因，产生pME6。靶向载体用NotI线性化并电穿孔到R1胚胎干（ES）细胞。要删除FRT公司-侧翼的新的基因下游cre公司靶向DAT-locus的基因，小鼠杂合子(+/DAT-cre-neo公司)与FLPe缺失小鼠交配。
现场杂交。
寡核苷酸探针检测编码酪氨酸羟化酶的转录物（5′-GGT GTG CAG CTC ATC CTG GAC CCC CTC CAA GGA GCG CT-3′）、cre重组酶（5′-GCC CGG ACC GAA GCA TGT TTA GCT GCT AAT GTT GCT GGA-3′或5′-CAC CAG AGA CGG AAA TCC ATC GCT CGA CCA GTT TAG TTA CCC CCA GGCC-3′）Cox I（TGG GTC CCC TCC AGC GGG ATC AAA GAA AGT TGT GTT TAG GTT GCG G）标记有33P，用于放射性就地杂交(16).
组织学和免疫组织化学。
用钙灌注小鼠2+-游离Tyrode溶液，然后在0.16 M磷酸盐缓冲液中加入4%多聚甲醛和0.4%苦味酸。将大脑解剖出来，固定后，平衡至10%蔗糖（含0.1%叠氮化钠）。用于间接免疫组织化学的一级抗体(16)包括针对TH（1:400；Pel-Freez，Rogers，AR）、β-半乳糖苷酶（1:500；Chemicon，Temecula，CA）和线粒体ATP合成酶核编码α亚基（1:250；Molecular Probes，Eugene，OR）的多克隆抗体。使用几种不同的抗体检测α-突触核蛋白：(我)多克隆山羊抗人肽116–131抗体（1:100；Biogenesis，Poole，U.K.）(ii（ii）)Syn-1是一种识别人和鼠α-synuclein的单克隆鼠抗鼠15–123抗体（1:500；BD Biosciences，加州圣何塞）(三)Syn-202是一种针对人α-突触核蛋白肽130–140的小鼠单克隆抗体，可识别人和小鼠α-和β-突触核素（1:400；英国剑桥Abcam）(四)Syn 4D6，单克隆小鼠抗重组人α-突触核蛋白（1:300；Abcam）(v（v）)一种多克隆兔抗人肽111–131抗体（1:2000；Chemicon），以及(不及物动词)羊抗人肽108-120多克隆抗体（1:1000；Chemicon）。共有7对不同年龄的米托帕克小鼠和对照同窝小鼠被用于就地杂交研究和酶组织化学染色，并对20对不同年龄的小鼠进行免疫组化。在代表性SN和VTA水平的编码载玻片上分别计算TH-免疫活性DA神经细胞体轮廓，每只动物使用2至5个切片，共18只小鼠（9对同窝鼠，每对由一只MitoPark和一只对照鼠组成）。比较SN和VTA细胞/切片和动物的平均数量。我们统计了总共9只动物中每个时间点、区域和动物的100个代表性DA细胞中的聚集体数量。我们通过TH和h116-131抗体双重标记来鉴定细胞。为了确定骨料的尺寸分布，我们使用适当的软件测量了总共九只动物中至少100个个体骨料/时间点、面积和动物的最大直径。为了确定共聚焦模式，使用了共焦显微镜（LSM 510 Meta；Zeiss，Jena，Germany）。
电子显微镜。
在440 mM Millonig缓冲液（pH 7.4）中用2%戊二醛灌注小鼠，然后取出大脑。从每个大脑中解剖出一个包含SN的1mm厚切片。切除周围组织，并在中线处切割切片，使每一块都包含左或右SN。每个SN被切割成三块1–2 mm三并在2%戊二醛溶液中后固定。然后对标本进行进一步修剪、渗透、脱水，并将其嵌入Durcupan（瑞士Buchs的Fluka）。SN的超薄切片收集在formvar涂层铜格栅上，与醋酸铀酰和柠檬酸铅进行对比，并使用电子显微镜进行检查（CM12；Philips，Eindhoven，荷兰）。
动物行为分析。
在自动活动笼中检查野外活动。在0900至1300小时之间，在光-暗周期的光阶段对动物进行测试。当动物中断下层光电池时，记录运动活动，当上层光电池中断时，记录饲养活动。将动物分别轻轻地放置在露天竞技场中，并在那里停留60分钟。每10分钟记录一次运动和饲养次数。对于L-DOPA治疗，在如上所述的活动笼中测量60分钟的自发运动和饲养。然后给动物腹腔注射左旋多巴和外周多巴脱羧酶抑制剂苄嗪（PBS中的Madopark 20 mg/kg；Roche、Basel、Switerland）或PBS，然后立即放回活动笼中再记录60分钟。计数得分为平均值±SEM。采用双向方差分析检验统计显著性。
儿茶酚胺测量。
采用高压液相色谱法（HPLC）和电化学检测法测定纹状体和中脑中的儿茶酚胺和代谢物(32).
致谢
我们感谢Robert Nussbaum博士（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）提供的α-突触核蛋白缺失小鼠。本研究得到了瑞典帕金森基金会、瑞典研究委员会、托尔斯滕和拉格纳·索德伯格基金会、瑞士脑力、卡罗林斯卡研究所基金、瑞典脑力基金会、贝蒂尔·希尔斯滕基金会、美国公共卫生署、国家药物滥用研究所/国家卫生研究所、，和迈克尔·福克斯基金会。
缩写
| 考克斯 | 细胞色素c（c）氧化酶 |
| 陆军部 | 多巴胺 |
| 运输终端交货 | 多巴胺转运体 |
| PD公司 | 帕金森氏病 |
| 序号 | 黑质 |
| 真实航向 | 酪氨酸羟化酶 |
| 悉尼威立雅运输公司 | 腹侧被盖区。 |
脚注
利益冲突声明：N.-G.L.、L.O.和M.I.E.是拥有MitoPark老鼠商业权利的公司的共同所有者。
工具书类
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