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.2008年12月31日；28(53):14500-10.
doi:10.1523/JNEUROSCI.5141-08.2008。

功能丧失分析表明，Omi/HtrA2不是体内PINK1/PARKIN通路的重要组成部分

吉娜·云 1, 约瑟夫·H·曹, 马克·多德森, 艾拉·克拉克, 潘卡杰·卡帕希, 鲁赫纳·B·乔杜里, 郭明
附属公司

功能丧失分析表明，Omi/HtrA2不是体内PINK1/PARKIN通路的重要组成部分

吉娜·云等。 神经科学. .

摘要

最近，在散发性帕金森病（PD）患者中发现线粒体蛋白酶Omi/HtrA2（G399S）突变，导致Omi/HtrA2被指定为PD基因座13（PARK13）。据报道，G399S导致Omi蛋白酶活性降低。体外研究表明，Omi/HtrA2作用于PINK1下游，其突变介导隐性形式的PD。我们以及其他人之前已经表明，家族性PD基因的果蝇同源物PINK1（PARK6）和PARKIN（PARK1）在共同的遗传途径中发挥作用，调节线粒体完整性和动力学。Omi/HtrA2是否调节线粒体完整性以及在体内是否作用于PINK1下游尚待探索。在这里，我们发现果蝇中的Omi/HtrA2无效突变体，与pink1或parkin无效突变体相比，没有表现出线粒体形态缺陷。广泛的遗传相互作用研究不支持Omi/HtrA2与pink1在同一遗传途径中发挥作用，或与pinkl执行部分冗余功能的模型，至少在线粒体完整性和动力学调节方面是如此。此外，与蛋白酶受损蛋白的表达相比，Omi/HtrA2 G399S保留了Omi/HtrA2的显著（如果不是完整的）功能。鉴于最近的研究结果表明，在PD患者和健康对照组中可以发现G399S的相似频率，我们不赞成Omi/HtrA2在PD发病机制中发挥重要作用的假设，至少在pink1/parkin途径中线粒体完整性的调节方面。

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数字

图1。
图1。
基于过度表达的基因交互作用粉红色和奥米.扫描EM和光学显微照片果蝇属眼睛被显示出来。18°C时，奥米过度表达(B类)导致野生型眼睛出现，而粉红色1(C)导致眼睛轻微粗糙。两者过度表达奥米和粉红色1导致眼睛小而粗糙(F类). 这个粉红色1 omi过表达相互作用被蛋白酶激活型Omi S266A的表达所消除(G公司). OmiS266A的表达本身不会导致任何眼部表型(D类). 与Pink1病突变体G426D类似的突变的表达没有表型(E类); 然而，它仍然显示了与奥米过度表达(H（H）). The phenotype of粉红色1过度表达不能通过丢失奥米RNAi诱导的功能-奥米，即使在29°C下升高(我,J型). 的静音奥米RNAi功能-奥米之所以强大，是因为它完全抑制了奥米过度表达诱导的眼部表型（补充图S2，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料). 类似地，由奥米过表达不能因缺乏粉红色1(K（K）,L（左）).A–H来自18°C饲养的苍蝇，而I–L型来自29°C下饲养的苍蝇。基因型：对照：w个; GMR-Gal4/+。奥米（Omi）：w个; GMR-Gal4，无人机-奥米/+. 粉红色1：w个; GMR-Gal4，无人机-粉红色1/+. 粉红色1G426D：w个; GMR-Gal4/UAS-Pink1G426D。Omi+Pink1：w个; 无人机-奥米/+; GMR-Gal4，无人机-粉红色1/+. Omi+Pink1G426D：w个; GMR-Gal4，无人机-奥米/UAS-接收器1G426D。粉红色1+OmiS266A：w个; UAS-OmiS266A/+；GMR-Gal4，无人机-粉红色1/+. 引脚1+奥米功能丧失（lof）：w个; GMR-Gal4，无人机-粉红色1/无人机系统RNAi-奥米。奥米+粉红色1lof（参考）：w粉红色15; GMR-Gal4，无人机-奥米/+.
图2。
图2。
Pink1G426D的mRNA表达和表型分析，该突变类似于PD-相关突变PINK1G309D。一个、使用全长苍蝇的Northern印迹粉红色1作为探针。与野生型相比，粉红色1空突变体(粉红色15)苍蝇没有显示全长mRNA。转基因苍蝇表达粉红色1G426D突变体显示类似或更高的粉红色1与表达野生型的苍蝇相比粉红色1。箭头指向粉红色1表达式，以及第49页（*）作为RNA负载对照。B–J类，示意图(B类)洋葱期精子细胞线粒体的相控显微照片(C–F类)和“叶片阶段”(G–J型). 与野生型相比，粉红色1在洋葱期，突变体在nebenkern中表现出液泡化（红色箭头）(D类)叶片期野生型中的线粒体衍生物（黄色箭头）有一种，而不是两种(H（H）). 携带野生型基因的基因组拯救转基因粉红色1（CaSpeR-粉红色1)彻底挽救因缺乏粉红色1（100%可育，n个>120）（Clark等人，2006），以及洋葱期和叶片期的精子细胞表型(F类,J型). 相反，粉红色1G426D（CaSpeR-粉红色1G426D）未能挽救粉红色1男性（生育率<2%，n个=60）或精子表型(E类,我). 红色箭头表示nebenkern的液泡化，黄色箭头表示每个线粒体衍生物。K–N（K–N）间接飞行肌线粒体用丝裂原原纤维蛋白标记。与对照组相比(K（K）),粉红色1突变体表现出丝裂原纤维蛋白信号整体水平降低和大量强纤维蛋白信号(L（左）)可以通过Pink1WT的过度表达完全挽救(N个)，但不是Pink1G426D(M（M）).
图3。
图3。
奥米null突变体在精子发生中表现出缺陷，但在睾丸中具有正常的线粒体形态。一个，Omi域示意图。MTS，线粒体靶向序列。TM，跨膜结构域。IBM，IAP-binding motif。的确切位置奥米国家统计局和奥米V110E型分别用蓝色和红色星号表示。B类，Omi/HtrA2在高度保守区域的不同物种中的序列比对，其中保守缬氨酸在奥米V110E型，标记为红色。C–E类,C′–E′，睾丸的相控显微照片。与控制苍蝇形成对比(C,C′)，其中精囊（箭头）充满精子（暗相），奥米突变体(D类,D′)显示一个空的精囊（括号内有星号），可以通过奥米过度表达(E类,E′)（箭头指向精囊）。C′–E′精囊的高分辨率视图来自C–E类.F–H（飞行高度）一个合胞体囊肿内投资锥的Phalloid染色。与投资锥排列良好的控制相反，这表明同步运动(F类),奥米突变体在一些囊肿中显示出分散的投资锥，表明个体化存在轻微缺陷(G公司)，可以通过奥米过度表达(H（H）).输入-输出“洋葱期”精子细胞线粒体的示意图和相控显微照片(I–L型)和“叶片阶段”(我,M–O型). 与野生型相比(J型,M（M）),奥米突变体在任何一个阶段都没有表现出任何缺陷(K（K）,N个)，而粉红色1在洋葱期，突变体在nebenkern中表现出液泡化（红色箭头）(L（左）)叶片期野生型中的线粒体衍生物（黄色箭头）有一种，而不是两种(O（运行）).P–S公司，个体化后囊肿部分的示意图和透射电镜图像。每个精子细胞在单个质膜内都包含一个轴丝（橙色箭头）和线粒体衍生物（红色箭头）。这个奥米突变囊肿(R（右）)显示精子细胞的紊乱和偶尔的个体化缺陷（数据未显示）。然而，与粉红色1突变体，表现出线粒体的大小和形态严重受损(S公司),奥米突变囊肿显示线粒体正常(R（右）). 基因型：野生型：w个/是；控制：w个/是；奥米国家统计局/+;奥米突变体：w个/是；奥米国家统计局/英国国防部（3R）ED5644;奥米突变体+救援：w个/是；TMR公司-奥米/+;奥米国家统计局/英国国防部（3R）ED5644。比例尺：C–E类，500微米；问-答500纳米。
图4。
图4。
奥米空突变体没有显示多巴胺能神经元丢失、肌肉变性或线粒体形态缺陷。A–C，40d龄野生型全脑的抗酪氨酸羟化酶免疫染色(一个),粉红色1突变体(B类)、和奥米突变体(C)苍蝇。对每个基因型的17到27只个体苍蝇（两个半球）进行了计数。D类，示意图描绘了成年人大脑中主要多巴胺能神经元簇的位置，如缩写所示（Nässel and Elekes，1992）。主要多巴胺能神经元簇位于大脑后表面附近，但位于前表面附近的原大脑前外侧（PAL）除外（标记为灰色）。PPL，前脑后外侧；前脑后内侧；VUM，腹侧未配对内侧。E类,F类，每簇多巴胺能神经元的量化粉红色1变异苍蝇和野生型苍蝇(E类)、和奥米突变苍蝇和野生型苍蝇(F类)在25°C下老化40 d。错误栏代表SD和Studentt吨测试用于统计分析*第页<0.05**第页< 0.01.G–L间接飞行肌纤维甲苯胺蓝染色(G公司,我,K（K）)和这些肌肉的EM研究(H（H）,J型,L（左）). 线粒体的边界用白色虚线标记。与…对比粉红色1突变体(我,J型),奥米突变体没有显示肌肉退化或线粒体形态缺陷(K（K）,L（左）)，即使老化30天。基因型：野生型：w个/年。奥米突变体：w个/是；奥米国家统计局/英国国防部（3R）ED5644。粉红色1突变体：w粉红色15/年。比例尺：H（H）,J型,L（左），1微米。
图5。
图5。
之间缺乏遗传交互作用粉红色1和奥米在线粒体形态学的功能丧失研究中。A–J，“洋葱期”精子细胞线粒体的相控显微照片(A–E)和“叶片阶段”(F–J型).粉红色1空突变体显示nebenkens的空泡化(B类)和一个线粒体衍生物(G公司). 这种表型可以被粉红色1过度表达（过度反应）(C,H（H）)，但不是由奥米过度表达(D类,我). 双突变体去除了两者粉红色1和奥米函数结果粉红色1无任何增强的突变体样表型(E类,J型). 红色箭头表示nebenkern的液泡化，黄色箭头表示每个线粒体衍生物。K–N（K–N），间接飞行肌的线粒体被mitoGFP标记。与对照组相比(K（K）),粉红色1突变体表现出丝裂原纤维蛋白信号的整体水平降低，以及大量强烈的纤维蛋白信号(L（左）)，完全可以通过粉红色1过度表达(M（M）). 双突变体粉红色1和奥米显示粉红色1突变体样表型(N个). 基因型：一个,F类,w个.B类,G公司,w粉红色15/年。C,H（H）,w粉红色15/是；TMR公司-粉红色1/+.D类,我,w粉红色15/是；TMR公司-奥米/+.E类,J型,w粉红色15/是；奥米国家统计局/英国国防部（3R）ED5644.K（K）,FM6公司/是；Mef2-Gal4，UAS-mitoGFP/+。L（左）,w粉红色15/是；Mef2-Gal4、UAS有丝分裂GFP/+。M（M）,w粉红色15/是；Mef2-Gal4、UAS-mitoGFP/UAS-粉红色1.N个,w粉红色15/是；Mef2-Gal4，UAS-mitoGFP/UAS-RNAi-奥米.
图6。
图6。
Omi定位于线粒体，其表达在粉红色1空突变体；Pink1表达在奥米也有突变体。A–F，野生型洋葱阶段精子细胞的双重标记(A–C)和粉红色1突变体(D–F型)使用Prosα6T-GFP（绿色）标记细胞核，使用抗Omi抗体（红色）标记nebenkern。在粉红色1零突变体，Omi仍然定位于精子细胞的nebenknes。G公司，使用基因组拯救转基因对内源性Pink1-9Myc表达进行Western blotting（WB）。损失奥米功能不会改变Pink1的解理模式。
图7。
图7。
Omi突变体的功能分析。一个，关于Omi域的4个突变（*）的位置示意图。B类,C，相位对比显微照片。Omi WT的过度表达（图3E类,E′)，G363S的表达(C)，但不是S266A(B类)，恢复精囊中活动精子的产生奥米突变体。箭头插入C表示精子的存在（暗相），而括号和星号在B类指出精子的缺失。D类OmiS236C和OmiS266A的表达水平与抗Omi抗体检测到的Omi WT相当。显示了使用抗Omi抗体过度表达OmiWT、OmiS236C或OmiS266A的苍蝇头部裂解物的蛋白质印迹。使用眼睛特异性驱动因子（GMR-Gal4）实现过表达，并在18°C下饲养苍蝇，以避免细胞死亡，影响蛋白质的恢复。非特异性带（*）用作蛋白质负荷控制。E–J公司，扫描电镜照片果蝇属眼睛。与Omi WT过度表达相比，Omi WM在25°C时会导致眼睛变小且粗糙(H（H）)Omi G363S或S364A的过度表达导致类似的粗糙眼表型(我,J型)，而Omi S236C或S266A的过度表达导致野生型眼睛出现(F类,G公司). GMR-Gal4用作眼睛专用驱动器。比例尺：B类,C500微米。
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