生物化学杂志。2009年5月15日；284(20): 13843–13855.
PINK1功能丧失通过氧化作用促进线粒体吞噬应激与线粒体裂变*S公司⃞
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鲁本·达格达
‡病理科**美国大学神经科学中心宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡，邮编：15213§匹兹堡退伍军人事务宾夕法尼亚州匹兹堡市医疗系统，邮编：15240¶研究中心安大略省多伦多市多伦多大学神经退行性疾病M55 3H2，加拿大和∥渥太华健康研究安大略省渥太华市渥太华大学神经科学研究所K1H 8M5，加拿大
Salvatore J.Cherra，三世
‡病理科**美国大学神经科学中心宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡，邮编：15213§匹兹堡退伍军人事务宾夕法尼亚州匹兹堡市医疗系统，邮编：15240¶研究中心安大略省多伦多市多伦多大学神经退行性疾病M55 3H2，加拿大和∥渥太华健康研究安大略省渥太华市渥太华大学神经科学研究所K1H 8M5，加拿大
斯科特·库利奇
‡病理科**美国大学神经科学中心宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡，邮编：15213§匹兹堡退伍军人事务宾夕法尼亚州匹兹堡市医疗系统，邮编：15240¶研究中心神经退行性疾病，多伦多大学，安大略省多伦多M55 3H2，加拿大和∥渥太华健康研究安大略省渥太华市渥太华大学神经科学研究所K1H 8M5，加拿大
阿努拉·坦登
‡病理科**美国大学神经科学中心宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡，邮编：15213§匹兹堡退伍军人事务宾夕法尼亚州匹兹堡市医疗系统，邮编：15240¶研究中心安大略省多伦多市多伦多大学神经退行性疾病M55 3H2，加拿大和∥渥太华健康研究安大略省渥太华市渥太华大学神经科学研究所K1H 8M5，加拿大
大卫·帕克
‡病理科**美国大学神经科学中心宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡，邮编：15213§匹兹堡退伍军人事务宾夕法尼亚州匹兹堡市医疗系统，邮编：15240¶研究中心神经退行性疾病，多伦多大学，安大略省多伦多M55 3H2，加拿大和∥渥太华健康研究安大略省渥太华市渥太华大学神经科学研究所K1H 8M5，加拿大
查琳·T·楚
‡病理科**牛津大学神经科学中心宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡，邮编：15213§匹兹堡退伍军人事务宾夕法尼亚州匹兹堡市医疗系统，邮编：15240¶研究中心安大略省多伦多市多伦多大学神经退行性疾病M55 3H2，加拿大和∥渥太华健康研究安大略省渥太华市渥太华大学神经科学小组研究所K1H 8M5，加拿大
‡病理科**美国大学神经科学中心宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡，邮编：15213§匹兹堡退伍军人事务宾夕法尼亚州匹兹堡市医疗系统，邮编：15240¶研究中心安大略省多伦多市多伦多大学神经退行性疾病M55 3H2，加拿大和∥渥太华健康研究安大略省渥太华市渥太华大学神经科学研究所K1H 8M5，加拿大
1部分由国家研究院提供支持健康补助F32AG030821。
2信件收件人：美国大学病理学系宾夕法尼亚州匹兹堡洛思罗普街200号匹兹堡，邮编15261。电话：412-383-5379；传真：412-648-9172; 电子邮件：ude.ttip@4ctc. 收稿日期：2008年11月10日；2009年3月9日修订
- 补充资料
[补充数据]
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摘要
线粒体失调与帕金森病密切相关。PTEN诱导激酶1（PINK1）突变与家族性帕金森综合征和神经精神障碍。尽管PINK1过度表达神经保护，对PINK1缺失的神经元反应知之甚少功能。我们发现PINK1的稳定敲除诱导线粒体SH-SY5Y细胞的分裂和自噬重新引入PINK1的RNA干扰（RNAi）抗性质粒。此外，野生型PINK1的稳定或短暂过度表达增加线粒体互联性与毒素诱导的抑制自噬/有丝分裂。线粒体氧化剂的产生起着至关重要的作用在PINK1 shRNA系中触发线粒体断裂和自噬。自噬/有丝分裂在限制细胞死亡中起到保护作用Parkin的过度表达进一步增强了这种保护性的有丝分裂反应。显性阴性Drp1突变体抑制了细胞分裂和有丝分裂PINK1-细胞不足。有趣的是，自噬蛋白的RNAi敲除Atg7和LC3/Atg8也减少了线粒体碎片，但不影响氧化应激，提示自噬在形态学上的积极参与线粒体重构以清除。总之，PINK1功能丧失引发氧化应激和线粒体转换自噬和裂变/融合机制。此外，PINK1和Parkin可能通过不同机制合作维持线粒体平衡。
帕金森病是一种与年龄相关的神经退行性疾病约占全球人口的1%。散发病例的原因尚不清楚，尽管线粒体或氧化毒素，例如1-甲基-4-苯基吡啶，6-羟基多巴胺（6-OHDA），三和鱼藤酮在动物和细胞培养模型中的繁殖特性(1). 中的异常细胞中观察到线粒体呼吸和氧化应激增加和帕金森病患者的组织(2，三)，也展示了线粒体自噬增加(4). 此外帕金森病基因影响氧化应激反应途径和线粒体体内平衡(5). 因此，线粒体内稳态的破坏是一个重要的影响因素散发性和遗传性帕金森病（PD）的发病机制。
这个停车场6常染色体隐性遗传和早发PD的相关基因座编码PTEN诱导的激酶1（PINK1）(6，7). PINK1是一种细胞溶质线粒体定位的581-氨基酸丝氨酸/苏氨酸激酶具有N末端线粒体靶向序列(6，8). 主要序列也包括一个假定的跨膜结构域，对PINK1域(8)，一个保守的与钙钙调蛋白激酶同源的激酶结构域和C末端调节自身磷酸化活性的结构域(9，10). 的过度表达野生型PINK1，但不是其PD-相关突变体，可以抵抗多种神经细胞的毒性损伤(6，11，12). 线粒体靶向对某些人来说是必要的(13)但是PINK1并非所有的神经保护作用(14)，意味着参与调节线粒体病理生物学的细胞质靶点(8). PINK1催化活性是其神经保护作用所必需的，因为激酶缺乏的K219MPINK1的ATP结合袋中的替代品会使其丧失以下能力保护神经元(14). 尽管PINK1突变似乎不会损害线粒体靶向性，PD-相关突变不同程度地破坏蛋白质的稳定，导致神经保护活性(13，15).
最近的研究表明PINK1和Parkin在基因上相互作用(三，16-18)防止氧化应激(19，20)调节线粒体形态学(21). 初级电池来源于PINK1突变患者的线粒体断裂HeLa细胞中RNA干扰研究重述的无组织嵴(三).
线粒体被大量自噬降解，这一过程涉及细胞质货物在膜自噬液泡中的隔离用于输送到溶酶体(22，23). 有趣的是，线粒体分裂伴随自噬性神经变性PD神经毒素6-OHDA(24，25). 此外，线粒体在神经退行性变中观察到碎片化和自噬增加阿尔茨海默病和帕金森病等疾病(4，26-28).尽管自噬体中包含线粒体曾被认为是一种饥饿期间观察到的随机过程，涉及缺氧的研究，线粒体损伤、凋亡刺激或限制需氧量兼性厌氧菌中的底物支持选择性的概念线粒体自噬(29，30). 特别地，线粒体定位激酶可能在模型中起重要作用涉及线粒体氧化损伤(25，31，32).
自噬参与蛋白质聚集体的清除(33-35)和轴突突触形态的正常调节(36). 慢性破坏溶酶体功能导致轻微受损的线粒体积聚钙缓冲能力下降(37)，这意味着自噬在线粒体稳态中的作用(37，38). 最近，Parkin补充PINK1缺乏对线粒体形态的影响(三)，被发现用于促销去极化线粒体的自噬(39). 相反，Beclin1-独立自噬/有丝分裂参与PD诱导的细胞死亡毒素1-甲基-4-苯基吡啶和6-OHDA(25，28，31，32)导致神经突起在富含亮氨酸重复序列中表达PD连接突变的细胞中的回缩激酶2(40). 鉴于适当调节的自噬起着体内平衡和神经保护作用，过度或不完全的自噬会导致“自噬”压力”会导致神经退化(28).
线粒体断裂(三)线粒体增加自噬(4)已经是在帕金森病患者的人体细胞或组织中，我们研究了PINK1功能的工程性丧失不能重演这些人类神经元细胞（SH-SY5Y）的观察结果。内源性基因的稳定敲除PINK1导致线粒体断裂，增加自噬和而PINK1的稳定或短暂过表达有助于细胞分裂相反的效果。自噬/线粒体自噬依赖于线粒体氧化剂的产生和裂变的激活。数据表明PINK1对维持线粒体网络很重要，提示线粒体动力学和自噬的协调调节限制与PINK1功能丧失相关的细胞死亡。
实验程序
质粒-PINK1 pcDNA6.1构造C端子标记为版本5(12)和氨基处理pAdTrack-CMV中的ΔN-PINK1-3xFLAG(14)具有特征之前。pReceiver载体中Parkin的HA标记人类cDNA为从Genecopoeia（马里兰州Germantown）购买。线粒体靶向GFP（细胞色素氧化酶VIII导入序列）和HA或GFP标记的野生型和EGFP-N1主干中的显性阴性K38A-Drp1由Dr。斯特凡·斯特拉克（爱荷华大学）。HA-Drp1同时构造共表达内源性Drp1特异性shRNA(41). GFP-LC3和RFP-LC3由Tamotsu Yoshimori（国家遗传学研究所，日本）(42).
定制PINK1多克隆抗体的产生-多克隆识别激酶亚结构域IX中预测暴露环的抗体（C8830）使用Invitrogen和在免疫印迹和荧光应用中具有特异性。
稳定PINK1过表达和敲除细胞的产生线-将SH-SY5Y细胞系（American Type Culture Collection，弗吉尼亚州马纳萨斯）是一种多巴胺能人类神经母细胞瘤细胞系，维持为描述(31). 用于稳定PINK1-过表达细胞系，SH-SY5Y细胞转染pReceiver M14（Genecopoeia）中的PINK1-3x标志或空pReceiver M14（控制）使用Lipofectamine 2000（0.10%最终，Invitrogen）并用G418选择（Invitrogen；1 mg/ml，在Dulbecco改良Eagle's培养基中，10%胎牛血清）24天。单个菌落在800μg/ml G418中扩增。小鼠免疫印迹证实PINK1-3xFlag的表达抗FLAG M2抗体（1:5000）（Sigma）和总PINK1使用C8830（1:2000）。
为了产生稳定的PINK1缺陷株，SH-SY5Y被转染PINK1 shRNA编码序列（Origene，Rockville，MD）或对照pRS shRNA除嘌呤霉素（0.6μg/ml；Sigma）为已使用。为了控制非特异性或离靶效应，两系列PINK1生成shRNA克隆，其中一个克隆靶向N末端区域（A系列：CCAGGCTGCGCAGGACCG）和另一个激酶结构域中的序列（D系列：CCCCTCACCCAACATCATCC）。单个菌落通过ΔΔC类T型分析，使用TaqMan定量PINK1、β-actin和ABI 7500的逆转录-PCR探针实时PCR系统（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）。蛋白质减少PINK1（C8830）的免疫印迹分析证实其表达。
免疫荧光和成像-SH-SY5Y细胞为甲醛固定并用C8830（1:2000）、鼠抗HA标签（1:1000）染色；Covance）和小鼠抗线粒体抗原，60kDa（克隆113-1，1:400；加利福尼亚州圣拉蒙市BioGenex）。然后将固定细胞在适当的培养基中孵育Alexa 488-驴抗兔（分子探针，尤金，加利福尼亚州）或Cy3-donkey抗小鼠次级抗体（1:400；Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA），并用1.25μg/ml DAPI（分子探头）。使用IDX71 Olympus在25°C下对标记细胞成像×20放大倍数的荧光显微镜（0.45数值孔径）或×40（0.60数值孔径）和DP70显微镜数字摄像机（奥林巴斯美国公司，纽约州梅尔维尔；励磁/发射滤波器，490/520纳米；541/572纳米）。
共焦成像-对于有丝分裂，GFP-LC3转染细胞用MitoTracker红染色（100 n米，分子探针）和使用倒置FluoView 1000激光扫描共聚焦显微镜在使用线性顺序放大×60倍（1.42数值孔径）扫描模式功能（美国奥林巴斯；激发/发射滤波器，488/510 nm；561/592纳米）。
用于线粒体的三维重建，10-μm厚使用FluoView 100采集25-30个切片的Z堆栈至少10-12个细胞/条件的激光扫描共聚焦显微镜。使用Imaris 6.1软件生成三维投影（Bitplane Scientific Solutions，苏黎世）。
细胞培养处理-用牛肝处理细胞过氧化氢酶（罗氏分子生物化学；260000单位/ml），10单位/ml或锰（III）四（4-苯甲酸）卟啉（MnTBAP，Alexis生化公司，圣地亚哥）100μ米巴非霉素（10 n米; 钙生物化学）用于抑制自溶体降解(43)和0.5μ米使用clasto-lactacystinβ-内酯（Sigma）6小时，以抑制蛋白酶体。
合成了人类Atg蛋白的小干扰RNA（siRNA）特征如上所述(31)和SH-SY5Y细胞用Atg8/LC3 siRNA、Atg7 siRNA或等效siControl非靶向siRNA（Dharmacon，Lafayette，CO）72小时前进行分析(22). 线粒体如前所述，从SH-SY5Y细胞中分离得到(44).
透射电子显微镜-细胞被处理为如前所述(31)和在JEOL JEM-1210电子显微镜上成像。
Western Blot分析和密度测定-细胞裂解物（1.0%Triton X-100（含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）的溶解率为5-15%所述的ammediol缓冲聚丙烯酰胺凝胶和免疫印迹以前(31)使用C8830兔抗PINK1（1:2000）、鼠抗FLAG（1:2000；Sigma）、兔抗MAP-LC3（5F10，1:4000；Nanotools，圣地亚哥），兔抗GFP（1:1000；Invitrogen），小鼠抗线粒体抗原，60kDa（1:1000；Biogenex，SanRamon，CA）、小鼠抗丙酮酸脱氢酶（1:1000或0.01μg/ml；分子探针），小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体（1:5000；Sigma），鼠标抗ATG7（1:1000），抗HA标签（1:1000；Covance，普林斯顿，NJ），兔抗肿瘤ERK1/2（1:30000；Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY）和抗乳酸脱氢酶（1:1000；Chemicon/Millipore）。分子的根据对数分子绘制的相对迁移率估算重量万花筒标准（Bio-Read）的重量。
细胞存活-死亡分析-细胞存活率使用阿拉马蓝（俄亥俄州克利夫兰市Trek Diagnostics），激发540 nm，发射590 nm，在Spectromax M2微板阅读器中（分子器件，桑尼维尔，加利福尼亚州）。使用碘化丙啶（分子探针；1μg/ml，37°C下5-10分钟），如所述(25)通过计算含有碎片、浓缩或固缩的GFP转染细胞数量每个外荧光显微照片的细胞核。
线粒体超氧化物检测-细胞被染色如前所述的MitoSOX（分子探针）(44). 量化平均值MitoSOX荧光的细胞积分密度期刊（分子器件），由美国癌症研究中心的Simon Watkins设计生物成像，计算每个细胞的综合像素强度。这个每小时MitoSOX荧光平均细胞积分强度通过计数细胞数量，将表观荧光显微照片归一化为细胞数量使用中的“计数核”函数计算每个场的核数DRAQ5（英国莱斯特郡Biostatus Ltd.）频道。
GFP-LC3 Puncta、线粒体自噬和线粒体的定量形态学-GFP-LC3转染细胞的线粒体MitoTracker Red的定量如前所述(25). 自动化量化以平均细胞GFP-LC3点作为自噬的测量如前所述，为NIH ImageJ软件（版本1.39）使用自定义宏以前(22，25).
为了量化线粒体形态的两个参数，另一个ImageJ为NIH Image创建了宏（可从ImageJ Wiki网站；参见补充图S1图例）。细胞的绿色通道用MitoTracker绿色FM（250 n）染色米; 分子探针）或表达mito-GFP的细胞被提取成灰度，倒置显示线粒体特异性荧光为黑色像素，阈值为优化分解单个线粒体。宏观追踪线粒体使用“分析粒子”绘制轮廓。平均面积/周长比被用作线粒体互连指数圆形度用于测量线粒体伸长，使用验证线粒体分裂和融合的特征良好的介质（图。S1）。
统计-除非另有说明，否则表示结果编译后表示至少三个独立实验的±S.E。使用单向方差分析进行多组比较Fisher差异最小。的值第页< 0.05被认为是重要的。
结果
稳定的PINK1-过表达和缺陷细胞系-收件人研究PINK1中与扰动相关的生化机制功能，我们生成了一组SH-SY5Y克隆细胞系过度表达或表现出内源性PINK1表达减少。5-15%梯度凝胶，兔C8830抗血清标记出微弱的~66kDa条带和内源性PINK1的强加工～50-kDa带。此外抗体识别出不同强度的～35-kDa带和～22-24-kDa乐队。免疫反应带通过与免疫肽(，中间面板)或通过shRNA到PINK1(). 由免疫荧光，C8830产生内源性PINK1的强染色与线粒体共定位(，黄色的)在细胞质(，绿色).
PINK1-过表达和敲除细胞系的特性。
一个，来自稳定pRec载体控制SH-SY5Y细胞系的细胞裂解物(C类)PINK1敲除稳定细胞系(答14)，和PINK1-过表达克隆细胞系(#24)以5-15%的比例解决用ammediol缓冲凝胶和免疫印迹法检测PINK1和C8830抗血清存在(中间面板)或缺席(左侧面板)阻塞的PINK1肽（100μg/ml，1小时）。为FLAG标签重新标记污点(右侧面板)β-actin作为负荷控制。插入1显示胶片的较长曝光时间，以更好地显示全长内源性PINK1相对于过度表达的PINK1-3xFlag。免疫反应性带包括全长重组PINK1-3xFlag（带一′,～69 kDa），内源性全长（带一，～66 kDa）和a主要处理波段b条，～50 kDa）。一个或两个以下还观察到分子量处理形式（<39 kDa）。A已处理有时观察到PINK1-3xFlag的形式（～60kDa，补充图。第8节）；插图2显示了单元格中此处理带的加重用蛋白酶体抑制剂clasto-lactacystinβ-内酯（band）治疗一″). 较小的处理PINK1频带可能进一步反映处理，可能在C端子端，因为没有更小的FLAG频带观察。B类线粒体的蛋白质印迹(米托)和细胞质的(细胞)来源于亲代SH-SY5Y细胞的组分(W公司)，一条稳定的矢量线(Ctrl键)，和PINK1-3xFlag克隆#24在10%三甘氨酸凝胶上溶解并免疫印迹FLAG，内源性PINK1、线粒体P60和乳酸脱氢酶(乳酸脱氢酶). 类似获得了克隆9的结果（数据未显示）。星号，表示非特定带。全长重组PINK1-3xFlag（带一′），内源性全长（带一)、和已处理（波段b条)观察到PINK1。C类，的外荧光图像SH-SY5Y细胞双重标记内源性PINK1(绿色)和60-kDa人线粒体抗原(红色)并对带有DAPI公司(蓝色).D类克隆SH-SY5Y株系中PINK1 mRNA水平表达针对N末端（A系列克隆）或中间的shRNAPINK1的（D系列克隆）区域。数据归一化为β-肌动蛋白mRNA作为相对量化值±最大值和最小值。对照克隆使用pRS控制矢量（V系列克隆）作为参考生成值。*，第页< 0.001与V17。E类，PINK1免疫印迹显示稳定PINK1shRNA内源性PINK1s减少细胞系与含有β-actin的载体控制细胞系的比较用作加载控制。50kDa的处理带(b条)和两个较小的处理带(c（c）和d日)在这个斑点中观察到（参见补充图S7了解ECL膜的非裁剪版本）。密度测定法显示了数据（每行三个独立实验汇编而成）低于(*，第页< 0.01与控制单元线路）。
PINK1-过表达克隆24()克隆9（图S8）显示稳定表达PINK1带有C端子3xFlag标签。两种抗FLAG单克隆抗体和C8830抗血清识别过度表达的全长3xFlag标记的PINK1（～69 kDa）(，左边和右侧面板; 图S8）。一个代表全长内源性PINK1（～66 kDa）的较暗带也是在矢量控制和PINK1-3x标记线中观察到(、和插图1暴露时间较长）。PINK1-3x标志出现在线粒体和细胞溶质部分(). 处理的～60-kDa PINK1-3x标志形式（补充图S8）未持续观察到，但增加了乳酸菌素抑制蛋白酶体后的丰度(，插入2)或MG132（数据未显示）。
评估PINK1敲除在稳定PINK1-shRNA克隆中的效率在mRNA和蛋白质水平上通过定量逆转录-PCR，Western印迹分析和免疫荧光（数据未显示）。PINK1 shRNA克隆与对照组相比，A和D系列均有效降低了PINK1的mRNA水平矢量控制细胞系(). PINK1的所有加工形式都减少了与载体控制细胞相比，在多个PINK1 shRNA克隆中显著用Western blot检测线条().
PINK1诱导的线粒体和自噬溶酶体缺失变更-超微结构分析显示稳定的载体对照品系表现出正常的线粒体形态，几乎没有平均值(). 稳定使用独立短发夹序列敲除PINK1()诱发小而支离破碎的线粒体图谱偶尔出现增大、肿胀的轮廓。嵴褶皱数PINK1敲除细胞中每μm线粒体长度减少()，类似于人帕金森病/路易体病黑质超微结构观察神经元(4)和人类PD杂交单元格(45). 平均数与对照组相比，AVs和每个细胞的溶酶体显著增加矢量细胞()表明PINK1的缺失促进了自噬。
PINK1基因敲除和过度表达细胞的超微结构分析线。 A-D公司，稳定细胞系的电子显微照片表达空shRNA载体控制(一个)、A和D系列PINK1 shRNAs(B类和C类)，或PINK1-3x标志(D类).米，线粒体；av（平均值），自噬空泡；第页，溶酶体；n个，原子核。插入，线粒体增大，显示致密嵴(比例尺：2μm）。E类，平均数量线粒体嵴折叠/μm(
，第页< 0.001与矢量控制；平均值±S.E。，n个= 80-150线粒体/状况）。F类AV的平均数量（自噬体和自身溶酶体）每细胞定量。(，第页< 0.05与矢量控制；平均值±S.E。，n个= 30单元格/条件）。
PINK1过表达克隆的线粒体图谱更长嵴褶皱密度较高()还有一些异常增大嵴丰富的线粒体(，插入). 与PINK1击倒相比细胞系中，这些异常线粒体的存在似乎没有当每个细胞的平均AV数量保持不变时，引发自噬反应过度表达细胞中含量低().
PINK1表达调节线粒体形态-作为线粒体网络通过全细胞分析比通过电子显微镜，我们利用计算机自动图像分析进行比较PINK1表达水平改变对细胞形态学的影响线粒体分裂/融合的已知介体。NIH的自定义宏ImageJ以无偏见的方式追踪单个线粒体并计算线粒体相互连接指数和线粒体伸长指数。它通过转染裂变蛋白动力学相关蛋白进行验证（Drp1）和显性负性Drp1（Drp1-DN），特征良好的分子导致线粒体分裂和融合增加的操纵，分别(46，47)（补充图S1）。野生型PINK1的瞬时或稳定过表达增加线粒体互联性和延伸性得分与载体的比较控制稳定电池(). 相反，PINK1的稳定击倒与载体相比，诱导线粒体网络断裂控制单元().
PINK1的敲除或过度表达改变线粒体形态学。 一个线粒体的表观荧光图像在载体控制中瞬时转染mito-GFP，稳定的PINK1-shRNA和稳定的PINK1过表达克隆。比例尺：20微米。B类，线粒体Z堆叠的三维重建在载体控制、PINK1 shRNA克隆和PINK1-过表达克隆。C类，定量图像分析线粒体互联性和线粒体伸长在空腹中的应用载体控制和PINK1shRNA克隆细胞（三种代表性细胞实验；，第页< 0.02与控制(Ctrl键); 平均值±S.E。，n个=25-35个单元格）。D类，线粒体定量a中的互连性和线粒体伸长PINK1-3xFlag在SH-SY5Y细胞中的瞬时过表达转染PINK1-WT-V5(，第页< 0.05与稳定对照或空载体；平均值±S.E。，n个=25-35个细胞/条件，三个独立实验）。
由于线粒体轮廓较短，呈圆形，可能反映出线粒体的空间重排，我们进行了三维重建线粒体GFP表达线粒体Z堆叠的重建(). 这个证实PINK1缺失株与对照组相比线粒体碎片化带有载体控制细胞，显示出管状和球形线粒体。相反，PINK1的过度表达增加线粒体互联性。
PINK1功能丧失促进大细胞自噬和粒体自噬-我们利用已建立的荧光和生物化学自噬测量研究PINK1基因敲除对大自噬(22). 共价的泛素折叠蛋白Atg8/微管相关蛋白的脂质化轻链3（LC3）对大分子自噬诱导至关重要(23). 非共轭LC3-I形态在胞浆中弥散，而磷脂酰乙醇胺结合LC3-II定位于AV，通过SDS-PAGE显示出更大的流动性(48). 稳定击倒PINK1显著增加了多个PINK1中LC3-II与β-肌动蛋白的比率shRNA克隆，表明内源性PINK1的缺失促进自噬(). 平均值在转染GFP-LC3标记物的活细胞中测定AVs的数量早期AV或RFP-LC3，后者在后期保持强荧光AVs/自溶体(42).PINK1基因敲除增加了早期AV的平均细胞数(，左边图表)和晚期AV(，右图形)导致溶酶体膨胀（补充图S2），表明AV成熟和溶酶体融合在PINK1shRNA细胞系中保持完整。使用巴非霉素A自溶体降解(43)，确认完好PINK1缺陷株系的自噬通量().
PINK1 shRNA稳定细胞系瞬时转染GFP-LC3和以Mito Tracker Red为指标分析GFP-LC3的共定位有丝分裂(25，49). 我们发现它很稳定敲低PINK1诱导自噬性线粒体螯合()并输送至溶酶体（补充图S2）和免疫印迹法检测线粒体总细胞水平下降线粒体基质（丙酮酸脱氢酶）和膜（P60）蛋白(). 定量分析显示约为2倍三个shRNA克隆的线粒体P60水平下降，而PINK1的过度表达显示无显著增加(). 治疗含有巴非霉素A的细胞(，补充图S3B类)或Atg7的RNAi，或Atg8/LC3B蛋白质（补充图S3一个)显著逆转了线粒体水平下降，表明自噬降解PINK1缺陷细胞中的线粒体().
PINK1过度表达逆转PINK1-敲除诱导的自噬-6-OHDA诱导自噬/有丝分裂(25). 而稳定击倒在PINK1促进自噬的过程中，稳定的PINK1过度表达抑制了6-OHDA诱导自噬和有丝分裂与稳定载体对照克隆的比较().
同样，shRNA逆转研究表明ΔN-PINK1-3xFLAG，缺少A系列的目标序列PINK1特异性shRNA完全逆转了PINK1拆卸线(). ΔN-PINK1在保护反对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶/1-甲基-4-苯吡啶（MPP+）毒性(14)，这是与自噬细胞死亡相关(31).
PINK1基因敲除诱导线粒体超氧化物调节碎片化和分裂-研究调节PINK1基因敲除对线粒体功能的影响，我们使用线粒体靶向荧光超氧化物传感器。稳定击倒PINK1显著增加线粒体超氧化物生成通过MitoSOX荧光，表明PINK1的缺失促进线粒体活性氧与功能障碍(). 此外，过氧化氢酶已被证明可以影响自由基引起的细胞内和细胞外过氧化氢水平过氧化物通过质膜的扩散和MnTBAP，一种超氧物分布于线粒体和细胞溶质的歧化酶模拟物(50)，逆转线粒体PINK1缺失导致的形态变化与抗氧化剂处理的载体控制细胞(). Drp1-DN的瞬时表达，逆转了PINK1敲低对线粒体形态的影响，但没有减少线粒体线粒体XPINK1shRNA细胞系中的荧光（补充图S4），表明ROS位于PINK1缺陷细胞线粒体断裂的上游。
用GFP-LC3和用过氧化氢酶或MnTBAP处理以分析抗氧化剂对PINK1缺失诱导的自噬。只有MnTBAP抑制由PINK1基因敲除对基础自噬也有显著影响(). 这些结果表明细胞ROS的产生对线粒体断裂和自噬都是必要的，但超氧化物（或其产物过氧亚硝酸盐）对自噬诱导。
线粒体分裂对线粒体碎片和PINK1缺陷细胞的线粒体吞噬-我们接下来评估了PINK1 shRNA细胞系中观察到的线粒体断裂是由经典的依赖Drp1的裂变。我们瞬时转染稳定载体带有GFP标记的Drp1-DN的对照和PINK1 shRNA株。此K38A替代削弱了裂变所需的GTP酶活性，导致SH-SY5Y细胞中的线粒体互连性（补充图S1）。GFP-Drp1-DN的瞬时表达显著恢复线粒体互连性和长度，表明经典的Drp1依赖裂变PINK1缺乏时观察到的线粒体重塑需要克隆(). 有趣的是，联合转染HA标记的Drp1-DN与GFP-LC3作为自噬标记物导致GFP-LC3puncta和PINK缺陷克隆的有丝分裂达到与野生型对照克隆(). 这表明线粒体裂变/融合机制调节PINK1诱导的线粒体降解缺乏。
自噬机制是线粒体分裂的必要条件PINK1 shRNA细胞，但不增加线粒体活性氧-我们分析阻断自噬对线粒体超氧化物的影响使用先前表征的siRNA的产生和线粒体形态靶向必需自噬蛋白Atg7和Atg8/LC3B(25，31，40). 如预期，击倒这些蛋白抑制PINK1缺陷克隆的自噬()，但它已经对增加的线粒体超氧化物没有影响，证实了自噬发生在线粒体氧化应激的下游().有趣的是，Atg8/LC3B或Atg7的siRNA也逆转了PINK1shRNA细胞系线粒体断裂水平类似于在内源性PINK1水平正常的细胞中发现的那些(). 这些数据，加上上述抗氧化敏感性，表明自噬是活跃的参与线粒体重构以清除，而不是服务于裂变下游的被动作用。因此，裂变/融合和自噬机器在病理调节中相互配合PINK1缺陷诱导的线粒体重构和清除。
抑制自噬和线粒体分裂增加细胞死亡PINK1敲除细胞系-与以下观点一致：PINK1对神经元细胞有害(19)，我们发现了击倒PINK1诱导SH-SY5Y细胞活性适度下降()，关联培养5天后细胞死亡增加().
自噬在调节细胞活力中的潜在作用使用siRNA抑制自噬来研究PINK1缺陷细胞诱导和24h剂量的巴非霉素抑制自噬降解。一个PINK1 shRNA中的细胞活力进一步显著降低用巴非霉素处理的细胞()或Atg7 siRNA，后者无显著差异对对照稳定细胞系活力的影响().
同样，GFP-Drp1-DN诱导的线粒体融合增加了细胞死亡在两个PINK1shRNA细胞系中，表明线粒体分裂也是PINK1缺乏的保护机制，促进有效的有丝分裂反应（补充图S5）。这些数据表明推测PINK1缺乏时自噬的有益作用作为去除受损线粒体的机制。
Parkin的表达进一步增强了细胞的吞噬和细胞保护作用PINK1-缺陷细胞-根据最近的观察，Parkin补充受损线粒体并促进自噬(39)，我们研究了效果PINK1敲除细胞中的Parkin。免疫荧光和活共焦显微镜下显示HA-tagged Parkin，54-kDa的瞬时表达融合蛋白，在SH-SY5Y细胞中(，插入)协同增加数量GFP-LC3点和与PINK1敲除细胞系中每个细胞的线粒体(). 上另一方面，Parkin的瞬时表达恢复了线粒体形态参数到控制级别(). 细胞死亡分析显示，瞬时表达Parkin显著逆转PINK1缺失诱导的细胞死亡().
讨论
目前尚无减缓PD进展的治疗方法疾病。虽然大多数病例是散发的，但对基因的研究与罕见的帕金森病家族相关，显示了涉及氧化应激、线粒体病理生物学和蛋白质聚集(51，52). 尤其是学习常染色体隐性遗传型PD相关蛋白的作用通常显示发病年龄更早）有希望了解有助于阻止或延缓疾病进展的补偿机制。目前的数据表明，PINK1在线粒体维持，抑制线粒体氧化应激，裂变和自噬，并表明裂变的协同激活，自噬和Parkin通路是重要的细胞保护反应有效去除受损的线粒体。
与PINK1对线粒体至关重要的概念一致完整性和体内平衡(2，三，6)，我们发现稳定PINK1基因敲除升高线粒体超氧化物并促进线粒体断裂、大自噬和有丝分裂，而PINK1的过度表达稳定了线粒体网络。这些研究证明PINK1在调节自噬中的新作用。出现超氧化物是PINK1敲低诱导线粒体分裂的常见介质，有丝分裂和大自噬。交互抑制研究表明裂变和自噬机制对线粒体都是必不可少的伴随PINK1缺陷线粒体清除的重塑这种线粒体自噬反应起着保护作用。总之，我们的数据表明线粒体活性氧作为调节细胞协同活化的关键信号线粒体分裂和自噬优化异常清除线粒体（补充图S6）。
最近，帕金被证明能够识别并促进药物去极化线粒体(39). 我们的数据扩展了这一点PINK1缺乏引起线粒体功能异常的观察。具体而言，Parkin增强PINK1 shRNA细胞的有丝分裂反应恢复正常线粒体形态，减少细胞死亡。作为使用Drp1-DN逆转线粒体分裂加剧细胞死亡（补充图S5），Parkin的神经保护可能不是简单的原因对线粒体形态的影响。而不是线性路径神经保护，这些研究表明PINK1稳定线粒体完整性和功能，而Parkin感觉受损线粒体进行代偿间隙。
虽然我们的研究和其他哺乳动物细胞研究表明线粒体PINK1缺陷细胞中的碎片(三)，在中学习果蝇属表现为大直径，核周，突变型功能丧失PINK1果蝇线粒体的荧光染色(21，53). 一行PINK1淘汰赛随着年龄的增长，小鼠的线粒体轮廓也会略微增大(54). 尽管大多数PINK1缺陷的人SH-SY5Y细胞线粒体较小且呈碎片状，我们也偶尔看到用电子显微镜观察到大的、膨胀的线粒体轮廓显微镜()和三维重建分离较大球形线粒体(); 是否这反映出直接或间接影响尚不清楚。当然Parkin恢复线粒体形态学参数的能力PINK1缺失细胞可能直接或间接由融合影响所致通过清除由裂变。有人建议脊椎动物和无脊椎动物门(三，19). 也有可能RNAi研究中观察到的裂变是对线粒体损伤的反应由于PINK1功能下降，这在习惯性神经元中未观察到直到它完全消失。然而，裂变和聚变都有可能事件是对应激和损伤的反应，但主要是稳态结果取决于病理和代偿的平衡给定细胞环境中的机制。
自噬在神经元线粒体内稳态中起着关键作用(55). 然而，人们知之甚少关于有丝分裂的信号调节。线粒体裂变诱导某些系统中的有丝分裂(56)我们发现了损失内源性PINK1促进线粒体分裂和自噬。自相矛盾的是，自噬机制不仅是线粒体到溶酶体，但也有助于线粒体断裂(). 抑制自噬可望引起如果自噬，则增加对破碎但未清除线粒体的检测仅作为裂变下游的被动清除机制。在相反，抑制自噬结合机制逆转了PINK1缺陷诱导的碎片化(). 有趣的是，肝细胞的活细胞成像证明自噬体可以介导完整细长线粒体的不同部分（中心和末端）(29). 因此，协调裂变和自噬机制的激活有助于线粒体PINK1缺陷细胞中自噬周转的重塑。
在帕金森病/路易体病死后的脑组织中存在线粒体线粒体激酶磷酸化增加相关的自噬(4). 有趣的观察PINK1的过度表达增强了相互连接的线粒体网络支持线粒体定位激酶可能起关键作用的概念调节线粒体动力学的作用。最近的观察表明依赖蛋白激酶A的Drp1磷酸化抑制裂变(41，57)提示其他丝氨酸/苏氨酸激酶也可以调节线粒体裂变/融合蛋白，尽管已知PINK1底物均不影响线粒体动力学(58，59).
由于线粒体功能障碍与PD，有丝分裂最初可能代表一种代偿机制来清除线粒体受损。但过度的有丝分裂，不平衡再生生物发生可能最终被证明是有害的，因为神经元依赖线粒体呼吸(28). 自噬上调在这种PINK1缺乏的慢性模型中起到细胞保护作用()尽管对神经炎/突触有潜在影响维护需要进一步研究(40，60).
总之，RNAi和过度表达研究证明了内源性作用PINK1通过减少线粒体来维持线粒体稳态氧化应激、调节线粒体动力学和抑制自噬。PINK1缺陷细胞诱导的自噬依赖于超氧化物和Drp1依赖性裂变增加。裂变和自噬在PINK1缺乏引起的线粒体重构中发挥积极作用，裂变的协同激活和Parkin增强的有丝分裂可能有助于降低隐性PD患者线粒体功能障碍相关的毒性家庭。
致谢
我们感谢Simon Watkins和生物成像中心匹兹堡大学电子显微镜和变形学。我们感谢夏洛特·迪格斯（Charlotte Diges）、艾米·萨托里（Amy Sartori）和梅根·德里金斯基（Megan Derezinski）技术援助和下列所有调查人员慷慨提供试剂的“实验程序”。
笔记
*这项工作得到了National的全部或部分支持卫生拨款研究所AG026389、DC009120和NS053777（至C.T.C.）。这项工作也得到了匹兹堡基金会的拨款，埃默林基金（致C.T.C.）美国帕金森病协会（致S。和退伍军人管理局高级职业生涯发展奖（授予S.M.K.）。
本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充图S1-S8。
脚注
三使用的缩写是：6-OHDA，6-羟基多巴胺；AV，自噬液泡；Drp1，动力相关蛋白-1；Drp1-DN，显性负性Drp1；LC3，微管相关蛋白轻链3；帕金森病疾病/帕金森病；PINK1，PTEN诱导激酶1；活性氧氧物种；小干扰RNA；RNA干扰；shRNA，短发夹RNA；HA、血凝素；绿色荧光蛋白；RFP，红色荧光蛋白；DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；ERK公司，细胞外信号调节激酶；MnTBAP，锰（III）四（4-苯甲酸）卟啉。
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