与隐性帕金森综合征相关的PTEN诱导的假定激酶1突变对蛋白质稳定性有不同影响

摘要

现已确定与隐性帕金森综合征有关的几个基因。中的突变停车场(1)是帕金森综合征的一个相对常见的病因，发病年龄在50岁之前，具有不同但通常较轻的表型。DJ-1型突变比停车场突变，但表型大致相似(2). 考虑到这两个基因中的任何一个的隐性突变都会导致帕金森综合征，很可能其中任何一个基因的突变停车场或DJ-1型导致黑质中投射到纹状体的多巴胺能神经元的丧失。正电子发射断层扫描显示多巴胺能功能丧失停车场（例如。，三–6)和DJ-1(7,8)患者，支持这个想法。因此，尽管这两种帕金森综合征遗传形式的详细病理学尚不清楚，但存在明显的表型重叠。这一结论表明，parkin和DJ-1之间存在联系，但这两种野生型蛋白的正常功能没有明显联系。Parkin是一种E3蛋白-泛素连接酶(9)，而DJ-1可能有许多角色(10)但会影响神经元在线粒体损伤产生的氧化应激下生存的能力(11).

最近，PTEN诱导的假定激酶1的突变(粉红色1)基因也被描述为与隐性帕金森综合征相关。最初，有三个家系被描述为已确定的突变：一个家系中的G309D点替换和另外两个家系的截断突变（W437X）(12). 随后，一些研究描述了令人信服的点突变或截断(13–16)表明突变频率低于停车场但大于DJ-1型有一些人群具有明显的突变频率：在菲律宾，8%的对照人群中存在L347P突变，尽管总是处于杂合状态(15). 已经报道了与该基因座相关的病例的详细表型描述，包括正电子发射断层扫描数据(17,18)并表现出与停车场或DJ-1型.

PINK1蛋白之前已被两个研究抑癌基因PTEN调控的小组克隆(19)以及不同转移潜能的小鼠细胞系中的差异基因表达(20). 这两项研究都表明，对丝氨酸/苏氨酸导向激酶结构域有很强的预测，而Unoki等。(19)证明重组GST融合蛋白具有自身磷酸化活性。PINK1的天然激酶底物尚未确定。在他们的论文中描述粉红色1突变，瓦伦特和同事(12)还注意到在蛋白质的N末端存在一个强大的线粒体靶向肽，并表明哺乳动物细胞中表达的N-myc标记蛋白积聚在线粒体中。

与隐性帕金森综合征相关的PINK1突变的鉴定提出了两个重要的假设。首先，我们(21)和其他(22)已经注意到，线粒体定位可能支持这种细胞器与黑质细胞丢失的发病机制密切相关的假说。其次，PINK1突变的隐性性质表明，功能丧失与疾病有关，进一步表明PINK1激酶活性在保护黑质神经元方面很重要。瓦伦特等。(12)研究表明，野生型PINK1（而非G309D突变）可保护细胞免受蛋白酶体抑制剂导致的线粒体功能丧失。

在这项研究中，我们通过使用先前被证明对该蛋白有用的自磷酸化分析来检测PINK1突变是否影响激酶活性在体外(19). 我们还检测了两种突变的蛋白质加工、定位和稳态水平：Valente最初报道的G309D突变等。(12)以及菲律宾流行的L347P突变。我们表明，与α-螺旋中的其他亮氨酸-脯氨酸取代一样(23)L347P对哺乳动物细胞中的蛋白质稳定性有显著影响。

材料和方法

PINK1激酶结构域的同源建模。序列分析表明，人类PINK1的235-554氨基酸与真核生物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族相似。通过使用在什么（whatif）一套程序(24).

质粒。从Genecopoeia（Germantown，MD）购买了一个编码克隆到Gateway入口克隆中的人类PINK1全长（残基1-581）的cDNA。根据制造商的说明，使用网关重组技术（Invitrogen）将全长PINK1转移到目的载体。我们使用pcDNA-DEST47将GFP熔断到PINK1的C端，使用pcDNA-DEST53将GFP融合到PINK1的N端。此外，我们将PINK1克隆到pCM-VTnT（Promega）中，并在PINK1的C或N端引入myc标记。将两个N-myc标记引物或两个C-myc标记的引物连接在一起，并克隆到经酶切的pCMVTnT中Xho公司我和Xba公司I生产pCMVTnT-N-myc或萨尔我和不是I代表pCMVTnT-C-myc。所有引物序列可在支持材料和方法，发布为支持信息在PNAS网站上。PINK1网关进入载体用生态里/不是我和生态里/萨尔我将发布粉红色1然后编码区分别连接到pCMVTnT-N-myc和pCMVTn T-C-myc。

根据制造商的说明，使用QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene）通过定点突变引入隐性突变体L347P和G309D。为了测试激酶活性，我们使用QuikChange多试剂盒（Stratagene）制造了K219A、D362A和D384A变体以及三重激酶死亡突变体（K219A/D362A/D384A）。

对于转染，COS7或M17（人类神经母细胞瘤）细胞在添加10%（vol/vol）FBS（Invitrogen）的Opti-MEM中生长，并使用FuGENE（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）瞬时转染，如参考文献所述。23.

蛋白质纯化和体外激酶分析。用Pfu DNA聚合酶（Stratagene）和正向（5′-ACA）扩增野生型或突变型PINK1 cDNA的激酶结构域（氨基酸112–496）GAATTC公司GAGGAAAAAACAGGCGGAG-3′）和背面（5′-TTTTCTCGAG公司CTTGCTGGCCTCG-3′）引物，产生生态RI和Xho公司I站点。PCR产物用生态RI和Xho公司一、 将所得DNA片段连接到pGEX-5X-1（Amersham Pharmacia Biosciences）中，与GST的N末端融合。PINK1融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）（诺瓦根）。细胞在37°C下生长，直至OD₆₀₀达到0.7–0.8，然后用异丙基β诱导-d日-硫代吡喃半乳糖苷在37°C下最终浓度为0.2 mM，持续3 h。在含有50 mM Tris·HCl（pH 7.4）、200 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT（0.1%）、Triton X-100和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中，通过冰上超声对细胞进行裂解。在12000×克，上清液与谷胱甘肽Sepharose 4B珠（Amersham Pharmacia Biosciences）在4°C下培养过夜。使用裂解缓冲液对珠子进行广泛清洗，并通过添加2×SDS样品缓冲液，然后在95°C下加热5分钟，为SDS/PAGE制备珠子。

蛋白质自磷酸化分析如参考文献所述。20样品在10%SDS/PAGE凝胶上分馏，并在考马斯蓝溶液中染色过夜，以确认蛋白质负载量相等。对于放射自显影术，凝胶干燥后在Storm磷光成像仪上成像（Amersham Pharmacia Biosciences）。

激酶活性通过测量[³²P] 通过使用运行的风暴磷光成像仪将ATP并入GST-PINK1图像量软件（Amersham Pharmacia Biosciences）。这些数据通过蛋白质表达水平和扫描的考马斯染色凝胶上的蛋白质总量进行标准化，也使用图像量不同重组蛋白之间的自磷酸化活性差异(n个=3）使用ANOVA和Fisher的PLSD事后检验进行分析（Statview，SAS Institute，Cary，NC）。

免疫印迹法。如参考文献所述，对SDS/PAGE上解析的蛋白质进行印迹。11和23使用的抗体为单克隆抗GFP（克隆7.1和13.1，罗氏应用科学）、抗myc（克隆9E10，罗氏实用科学）和抗β-肌动蛋白（克隆AC15，Sigma）。使用Storm荧光成像仪对斑点进行成像，并使用图像量5.2和归一化为β-actin。所有数据表示至少三次测定的平均值±SEM。

脉冲-大通标签。用GFP标记的PINK1瞬时转染Cos-7细胞。转染48小时后，细胞在不含蛋氨酸/半胱氨酸的DMEM（Gibco-BRL）加1%的培养基中处于饥饿状态我-谷氨酰胺作用1 h。然后将细胞暴露于500μCi（1 Ci=37 GBq）的[³⁵S] 已见面/[³⁵S] Cys（Amersham Pharmacia Biosciences）每孔3小时，用温热的PBS冲洗三次，并在含有1%的完整培养基中打捞我-谷氨酰胺，2 mM我-蛋氨酸，2 mM我-半胱氨酸和10%FCS在不同时间内最多8 h。细胞在含有150 mM NaCl、5 mM EDTA、50 mM Tris（pH 7.6）、0.25%Nonide P-40、1 mM PMSF和蛋白酶抑制剂的缓冲液中溶解。用琼脂糖偶联的抗GFP抗体免疫沉淀转染蛋白（Vector Laboratories），产物用样品缓冲液洗脱并用SDS/PAGE分离。电泳后，将凝胶固定（异丙醇/水/乙酸，25:65:10），用Amplify（Amersham Pharmacia Biosciences）增强30分钟，并在Storm Phosphor Imager上干燥以进行放射自显影。

定量RT-PCR。用TRIzol（Invitrogen）在转染48小时后从细胞中分离出总RNA。用DNase I（Invitrogen）处理分离的RNA，用寡核苷酸（dT）引物分别用SuperScript III逆转录酶（Invit罗gen）逆转录1μg数量的总RNA。cDNA模板在用于RT-PCR之前稀释10倍。PINK1的引物为5′-AGACGCTTGCAGGGCTTC-3′（正向）和5′-GGCAATGTAGGCATGG-3′（反向）。β-actin的引物为5′-AGAGATTCCTATGGGCG-3′（正向）和5′-CATGTCGTCCCAGTGGAC-3′（反向）。如参考文献所述，使用Applied Biosystems 7900系统进行实时定量PCR并进行分析。25.

亚细胞分离。根据制造商的说明书（Pierce），使用线粒体分离试剂盒纯化亚细胞组分。使用抗VDAC1（1:4000单克隆31HL，Calbiochem）和抗Hsp70（1:400单克隆W27，Neomarkers，Fremont，CA）测定每个组分的纯度。

免疫荧光染色。细胞用MitoTracker（分子探针）染色并转染PINK1，如参考文献所述。11和23对于DJ-1，除了主要抗体是抗GFP或抗myc（均为1:200稀释度）。

结果

突变对PINK1激酶活性的影响体外PINK1的一级序列包含三个与具有激酶活性的蛋白质一致的基序。对于人类蛋白质，这些基序分别是LAIK（氨基酸216–219）、HRD（氨基酸360–362）和DFG（氨基酸384–386），预计它们将分别形成ATP定向位点、活性催化碱和二价金属阳离子的螯合位点。我们通过使用一系列同源的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域晶体结构来创建一个一致模板，然后用PINK1序列修改该模板，从而对人类PINK1的激酶部分进行建模，该部分包括来自氨基酸235–554的两个基序。同源模型受到限制的经验能量最小化，以消除任何空间位阻并优化局部相互作用，同时不允许结构与一致模板的结构有显著差异(图1一). 该模型预测，假定的催化天冬氨酸D362和金属结合位点（D384）相对接近，可能形成活性位点。已发现隐性点突变的G309和L347位点预计不会位于活性位点内，而是位于可能对蛋白质折叠很重要的区域。该模型将G309放置在靠近PSTAIRE螺旋和ATP结合位点的环中。G309D替代不太可能严重破坏褶皱的稳定性，但可能会静电干扰ATP结合或水解。L347预计位于PSTAIRE螺旋的中间，这是一个螺旋段，在细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶中形成细胞周期蛋白结合表面的一部分。根据这个模型，我们做出了以下预测。首先，突变D362和D384（与K219一起）会使激酶活性失活。其次，鉴于脯氨酸倾向于充当螺旋破胶剂，L347P可能不稳定，但G309D相对稳定。

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图1。

PINK1激酶活性及其突变的影响在体外.(一)PINK1激酶结构域模型显示了关键天冬氨酸的位置和本研究研究的两个隐性突变。下部在指示的轴上旋转90°。(b条)野生型PINK1 GST融合蛋白的表达和自磷酸化活性从左到右显示考马斯染色的SDS/PAGE凝胶、Western blot和放射自显影。如图所示，备用车道仅包含GST。箭头表示GST-PINK1融合蛋白，填充箭头显示显著的分解产物，而开放箭头显示单独的GST。所有凝胶或斑点右侧的标记均以千道尔顿为单位。(c（c）)PINK1突变体的激酶活性显示自射线图(顶部)，考马斯染色(中部)和合并放射性的定量，针对蛋白质负荷进行校正。图中显示了野生型PINK1（车道1）与人工激酶突变体（K219A，车道2；D362A，车道3；D384A，车道4；三激酶缺失突变体，车道5）的比较。与人类帕金森综合征相关的两个隐性突变体L347P和G309D显示在第6和第7车道。(底部)条形图显示三个独立实验的平均值，误差条形图显示SEM。通过方差分析和Fisher的PLSD事后检验评估变异体之间的活性差异；*,P（P）< 0.05;**,P（P）< 0.01;***,P（P）< 0.001.

为了验证这些想法，我们生成了重组野生型和突变型PINK1蛋白。全长PINK1对大肠杆菌且可溶性较差（未显示数据）。因此，我们制作了缺乏线粒体靶向肽和PINK1部分C末端的构建物，如Unoki所描述的那样与GST融合等。(19). GST-粉红色1_112–496从细菌裂解物的可溶部分纯化构建物，作为融合蛋白预测大小的完整条带（表观分子质量为70kDa），尽管可以看到降解产物，其中包括60kDa的主要条带(图1b条). 一些PINK1沉积在不溶性部分（数据未显示）。PINK1以前已经被证明能够自我磷酸化在体外(19)作为活性酶的简便测定方法。自磷酸化仅限于完整的GST-PINK1蛋白，而非降解产物(图1b条).

接下来，我们在同一试验中测量了PINK1变异体的自身磷酸化(图1c（c）). 结构之间存在显著的总体差异(P（P）通过单向方差分析=0.0002；n个= 3). 在设计用于降低激酶活性的结构中，K219A单独具有显著作用，将活性降低到野生型的50.6±12.8%(P（P）=0.003），而D362A和D384A均将活性降低至野生型的≈75%，两种影响均无统计学意义。然而，所有三种替代物的作用都比K219A单独作用强，活性降低到野生型的25.5±10.5%(P（P）< 0.0001). 我们测试了两个隐性突变，发现尽管G309D的活性有所下降（野生型的60.5%；P（P）=0.01），L347P活性显著降低（<10%的野生型）。重组L347P GST-PINK1融合不稳定。这一结果表明L347P突变破坏了蛋白质的稳定性，支持了我们的上述预测(图1c（c）).

PINK1在哺乳动物细胞中的加工和线粒体定位。PINK1 N末端的靶向序列被预测为将蛋白质导向线粒体，这与Valente的数据一致等。(12)他证明了转染细胞中N末端标记的PINK1的线粒体积累。然而，许多线粒体先导肽在输入线粒体后通过线粒体加工肽酶从成熟蛋白质中被切割出来(26)这表明完整的N末端标记蛋白可能是一种前蛋白。因此，在检测突变的影响之前，我们探索了N末端靶向序列的可能裂解。

在N端标记myc的PINK1转染的细胞显示出一条表观分子量为65kDa的单条带。这一发现接近63-kDa-myc标签的理论分子质量，并与Valente的结果一致等。(12). 通过使用C末端标记结构，发现了一个表观分子量为55kDa的额外带(图2一). GFP标签较大时也出现了类似的结果(图2b条)其中前蛋白≈90 kDa，较小片段≈80 kDa。尺寸的减小与蛋白质N末端≈10-kDa片段的蛋白水解一致。此外，我们在用N-末端GFP-PINK1蛋白转染的细胞中看到≈30kDa的条带。该条带可能代表GFP加上切割位点前的线粒体靶向序列。在强CMV启动子驱动的瞬时转染下，PINK1的数量很可能比细胞中的正常数量高很多。因此，切割后线粒体中剩余的肽也可能没有完全降解；这一结论与观察结果一致，即两种结构中都存在一定量的前蛋白。还观察到含有C末端V5/His6标签的构建体的裂解（数据未显示）。这些结果表明PINK1在导入线粒体后在N端进行处理，不同的融合伙伴不会干扰处理。

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图2。

哺乳动物细胞中PINK1蛋白的加工。用myc标记的基因转染COS-7细胞(一)或GFP标记(b条)构造。使用N-末端（泳道1）和C-末端（泳道2）标记的版本一)或GFP转染的细胞（第3通道b条)作为对照。箭头显示前蛋白（N末端断裂前），填充箭头表示成熟肽。GFP构造中的开放箭头显示了可能的N端片段（请参见结果);*在未转染细胞中观察到myc单克隆抗体的交叉反应。(c（c）)亚细胞分离。用GFP标记的PINK1或未经转染的PINK1转染COS-7细胞，并将细胞裂解物分离成10000×克颗粒（P10，4-6车道）和100000×克上清液（S100，1–3道）部分。印迹用Hsp70和VDAC1的抗体在中部和底部分别为（开放箭头）。数据代表每个构造的两个以上实验。所有印迹右侧的标记均以千道尔顿为单位。

我们还进行了亚细胞分离(图2c（c）)通过使用GFP标记的蛋白质。前蛋白由N末端标记结构中的单个带表示，在10000×克含有线粒体蛋白质的颗粒（P10），尽管在100000×克上清液（S100）。由于线粒体蛋白质通常在胞浆中翻译，这一结果可能反映了进口前产生的蛋白质。令人惊讶的是，我们还发现S100组分中也有一部分成熟肽（带有C末端结构的低带）(图2c（c）).

为了证实这些数据，我们使用几种不同的结构进行了亚细胞定位。在转染细胞中直接观察到GFP标记的PINK1，无需固定。N端GFP标记的PINK1存在于类似线粒体的结构中，而C端标记的蛋白存在于胞浆中(图3一–e（电子）). 在一些细胞中，一些PINK1信号积聚在多个小的细胞溶质点或单个大的核周包涵体中，这让人联想到相对不溶的聚集蛋白(图3e（电子）). 我们还用MitoTracker对细胞进行染色以确定线粒体。使用共焦显微镜，我们发现尽管N末端标记的PINK1的信号与MitoTracher重叠(图3（f）–小时)，线粒体和C末端标记蛋白的信号通常是分离的(图3我–k). myc和GFP标记蛋白的结果相似(图3我–o个)以及几种不同的固定方法，包括甲醇固定（数据未显示）。

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图3。

转染细胞中蛋白质的定位。(一–e（电子）)在COS-7细胞的N端转染GFP标记的PINK1构建物(b条和c（c）)或C终点站(d日和e（电子）)无固定或染色。在相同曝光设置下采集的未转染细胞显示为一.(（f）–k)转染细胞，N末端(（f）–小时)或C端子(我–k)myc标记为PINK1并用MitoTracker复染。固定后，用抗myc单克隆抗体（绿色（f）和我)和MitoTracker（红色克和小时). 合并的图像如所示小时和k.(我–o个)GFP与myc标记的蛋白质，仅显示合并图像。箭头在我表示N-GFP-PINK1和MitoTracker与转染PINK1-C-GFP的细胞之间重叠的区域，其中信号保持分离（箭头位于米). （比例尺：10μm）每个图像代表每个构造至少进行三次重复实验。

L347P PINK1在哺乳动物细胞中不稳定。接下来，我们用两端带有GFP标记的PINK1变异结构转染细胞。虽然重要激酶残基的突变对转染蛋白的稳态水平没有影响，但使用L347P突变体后，转染PINK1的量显著减少(图4一). 定量分析表明，L347P蛋白的数量显著减少(图4b条)但不是mRNA(图4c（c）). L347P蛋白水平显著高于(P（P）<0.01）小于野生型或其他构建物，而在测量前蛋白或成熟蛋白时，mRNA水平之间没有统计上的显著差异(P（P）方差分析=0.23；n个=3），认为所有构建物的转染效率相似。与瓦伦特及其同事的报告类似，G309D结构没有发现任何影响(12). 含有L347P突变但在C末端标记有V5-His的构建物也不稳定（数据未显示）。mRNA水平恒定的蛋白质丢失高度令人想起L166P DJ-1的行为(23)并且与由于细胞中蛋白酶的降解而导致的蛋白质的不稳定性一致。为了测试低稳态水平是由于L347P的周转增加所致，我们进行了脉冲追踪分析(图4d日). 我们估计野生型N末端GFP标记的PINK1的半衰期约为2小时，而L347P突变的半衰率为0.25小时。

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图4。

突变对哺乳动物细胞PINK1蛋白稳定性的影响。(一)将带有GFP标记的PINK1变异体的N末端（通道2、4、6和8）或C末端（通道3、5、7和9）转染COS-7细胞，或保留未转染的PINK1变异体作为对照（通道1）。与野生型（第2和第3道）对照组或人工激酶死亡构建物（第4和第5道）相比，L347P（第6和第7道）隐性突变体PINK1的稳态蛋白质水平降低，而G309D（第8和第9道）隐性突变PINK1。箭头表示前蛋白的位置，填充的箭头表示成熟蛋白质，开放的箭头表示用作负荷控制的β-肌动蛋白的位置。我们对这两种蛋白质进行了定量(b条)和mRNA(c（c）)所有构造的表达式n个=3个实验。对于蛋白质数据，我们测量了N末端结构（填充条）的前蛋白带强度，以及C末端结构的前蛋白（开放条）和成熟蛋白（阴影条）。*，蛋白质水平与野生型构建物显著不同(P（P）方差分析结果<0.01）。(d日)蛋白质稳定性的脉冲追踪分析。将N末端GFP标记的野生型瞬时转染COS-7细胞(上部)或L347P(下部)PINK1，标有³⁵S-Met/Cys和使用未标记媒体追逐0–8小时，如每条车道上方所示。显示了该实验的量化，曲线拟合为单相指数衰减函数。在重复实验中获得了类似的稳定性估计。

我们还检测了突变蛋白的定位。激酶头PINK1定位为野生型蛋白，N-末端标记的构建体与MitoTracker重叠，C-末端标记的构建体存在于细胞质中，偶尔作为内含物存在（图5一和b条，发布为支持信息在PNAS网站上）。与使用印迹法观察到的较低的蛋白质稳态水平一致，L347P PINK1的免疫染色水平要低得多，尤其是对于C末端结构（图5c（c）和d日). 然而，G309D PINK1似乎正常定位（图5e（电子）和（f）)并且，像野生型或激酶死亡蛋白一样，存在于某些细胞的胞浆内含物中（数据未显示）。

讨论

在这项研究中，我们试图确定PINK1的突变是否影响与蛋白质已知属性相关的几个参数中的任何一个。由于PINK1被认为是一种线粒体导向的蛋白激酶，我们比较了野生型PINK1与G309D和L347P突变体的激酶活性和定位。此外，作为对照，我们生成了一个三激酶头人工突变，并确定了各种突变对哺乳动物细胞蛋白质稳定性的影响。

这些数据证实(20)PINK1是一种激酶，通过使用相对粗糙的自我定向磷酸化测定。虽然可能不完全是生理性的，但该测试很有用，因为它可以量化突变对折叠酶活性的影响。与参考文献中的描述一致。20，全长PINK1不可溶，不能稳定表达，尽管我们很难降解PINK1的较小片段，但我们能够纯化活性激酶。我们能够通过突变关键残基（K219、D362和D384）来抑制蛋白质的活性，这些关键残基预计在ATP定向和对底物上的受体残基进行磷酸盐转移反应中很重要。我们选择将这些残基突变为丙氨酸残基，以尽量减少二级结构的破坏，这很可能是因为该蛋白在细菌和哺乳动物细胞中高效表达（见下文）。尽管G309D对活性的影响不如L347P显著，但这两种隐性疾病相关突变都倾向于降低活性。与我们的建模预测一致，L347P即使在表达为融合蛋白时也非常不稳定大肠杆菌.

除了具有预测的激酶结构域外，PINK1还具有线粒体靶向肽(12). 在我们对哺乳动物细胞中N端和C端标记的蛋白质的比较中，我们证明≈8-10 kDa是从N端切割而来的，尽管在过表达研究中，并不是所有的蛋白质都被处理过。预测精确的切割序列是困难的，因为线粒体加工肽酶对切割位点有相当松散的一致序列，有时（但并不总是）直接指向精氨酸后放置2到3个残基的氨基酸。对人类PINK1一级序列的检测还揭示了RFFRQSVAGL基序，这与线粒体中间肽酶[RX（F/L/I）XX（T/S/G）XXXX]的共识一致，后者是作用于内基质蛋白子集的一种次级肽酶。因此，在蛋白质的前100个氨基酸中可能存在多个人类PINK1降解位点。需要进行进一步的实验，以确定从PINK1的N末端部分裂解的确切序列。

这些结果与参考文献中其他地方建议的PINK1的线粒体靶向性一致。12对于N末端结构，我们确认了线粒体定位。然而，至少在转染细胞中，一部分成熟PINK1似乎被输出到胞浆中。由于这种多肽是蛋白质的加工形式，很可能该蛋白质已经被线粒体肽酶作用。我们还发现C末端标记的蛋白质在包涵体中积累，这让人想起当使用异源启动子在高水平表达时溶解度相对较差的蛋白质。这些考虑表明PINK1可能容易聚集或溶解度损失，突出了利用内源性蛋白质进行进一步研究的重要性。

虽然不寻常，但也有蛋白质以这种方式表现的先例。例如，酵母富马酸酶折叠在线粒体中，但可以通过逆行运输输出到细胞质(27). 在哺乳动物细胞中，一些谷胱甘肽S公司-转移酶同工酶可以以磷酸化依赖的方式靶向细胞质或线粒体(28). 目前尚不清楚预蛋白和成熟PINK1的差异定位是一种生理反应还是在不同条件下可能被调节。例如，胞质位置可能是细胞试图降解多余的蛋白质。我们通过使用两个不同的C末端标记来确认定位，因此不太可能存在（例如）GFP，它会驱动细胞溶质积累。同样，这一结果需要使用内源性蛋白质水平进行确认。用于检测GST融合蛋白的抗肽抗体不识别内源性蛋白（A.B.和M.RC.，未发表的观察结果）。然而，如果存在成熟的、激酶活性的PINK1的细胞溶质池，那么这一观察结果将使PINK1突变支持隐性帕金森病发病过程的线粒体假说的假设复杂化(21,22).

这些研究的一个明确结果是，与野生型PINK1相比，L347P突变在细胞中产生的蛋白质稳态水平较低。虽然机制尚未确定，但这种突变可能与DJ-1中的L166P突变具有类似的效果，其中结构重要的α-螺旋的错误折叠导致稳定性较差。在哺乳动物细胞中，这种错误折叠导致泛素蛋白酶体系统识别(23)或其他蛋白水解机器(29). 无论涉及何种机制，L347P PINK1的极低稳定状态表明该突变是因果性的。如果是这样，携带频率为8%，这一发现意味着该突变将导致菲律宾的许多隐性帕金森症病例。G309D突变的功能丧失机制并不相同，因为该蛋白相对稳定。此前，瓦伦特及其同事证明，这种突变在转染细胞中缺乏保护功能。在这项研究中观察到的激酶活性的微小下降是否会导致这种保护活性的丧失尚不清楚。然而，对于隐性PINK1突变的合理假设是，它们要么破坏蛋白质的稳定性，要么降低激酶活性，使其低于支持脆弱群体神经元存活所需的活性。需要进一步研究以确定PINK1的激酶活性对神经元生存是必要的，并确定蛋白质的天然底物。

补充材料

致谢

笔记

作者贡献：S.K.、D.W.M.和M.R.C.设计的研究；A.B.、M.V.D.B.和R.A.进行研究；S.K.、D.W.M.和G.A.P.贡献了新的试剂/分析工具；A.B.、M.V.D.B.、D.W.M.和M.R.C.分析数据；A.B.和M.R.C.撰写了论文。

缩写：PINK1，PTEN诱导的推定激酶1。

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