Identification of a novel Zn2+-binding domain in the autosomal recessive juvenile Parkinson-related E3 ligase parkin

doi:10.1074/jbc.M808700200

.2009年5月29日；284(22):14978-86.

doi:10.1074/jbc。M808700200。 Epub 2009年4月1日。

常染色体隐性遗传青少年Parkinson相关E3连接酶parkin中一个新的Zn2+结合域的鉴定

Ventzislava A Hristova公司¹, 史蒂文·比斯利, R简·雷利特, 加里·S·肖

附属公司

PMID： 19339245
预防性维修识别码： PMC2685680型
内政部： 10.1074/jbc。M80870020型

常染色体隐性遗传青少年Parkinson相关E3连接酶parkin中一个新的Zn2+结合域的鉴定

Ventzislava A Hristova公司等。生物化学杂志. 2009.

.2009年5月29日；284(22):14978-86.

doi:10.1074/jbc。M808700200。 Epub 2009年4月1日。

作者

Ventzislava A Hristova公司¹, 史蒂文·A·比斯利, R简·雷利特, 加里·S·肖

附属

¹加拿大安大略省N6A 5C1，伦敦，西安大略大学生物化学系。

PMID： 19339245
预防性维修识别码： PMC2685680型
内政部： 10.1074/jbc。M80870020型

摘要

编码parkin蛋白的park2错义突变约占常染色体隐性遗传青少年帕金森病（ARJP）病例的50%。Parkin属于RBR（RING-between-RING）E3连接酶家族，参与泛素介导的蛋白质降解和转运，如Pael-R和联菲林-1。提出的parkin结构主要基于序列相似性研究，由N端泛素样结构域和C端RBR结构域组成。这些域被一个大约160个重复的独特parkin序列分隔开，该序列没有可识别的域结构。我们对细菌表达和纯化的帕金进行了有限的蛋白水解实验，以在独特的帕金结构域序列中鉴定一个新的结构域（RING0）。RING0由Cys（150）-Cys（169）和Cys（196）-His（215）之间的两个不同的、保守的富含半胱氨酸的簇组成，由CX（2）-（3）CX（11）CX二C和CX（4-6）CX十-16）-CX二（H/C）基序组成。半胱氨酸/组氨酸残基在该区域的位置与parkin RING1和RING2结构域以及其他E3连接酶RING结构域相似。然而，在parkin中，一个26位连接子区域将这些基序分开，这不是其他RING域结构的典型特征。此外，RING0结构域包括parkin的泛素样和RBR区域之间的所有已知ARJP突变位点，只有一个除外。使用电喷雾电离质谱和电感耦合等离子体原子发射光谱分析，我们确定RING0、RING1、IBR和RING2结构域分别结合两个Zn（2+）离子，首次观察到E3连接酶能够结合八个金属离子。从parkin中去除锌会导致蛋白质几乎完全展开，这一观察结果使parkin发现的基于半胱氨酸的ARJP突变合理化，包括形成细胞内含物和/或泛素化缺陷的RING0（C212Y），可能是因为锌结合不良和错误折叠。parkin中RING0结构域的鉴定为蛋白质提供了一个新的整体结构域，这对于评估ARJP突变的作用和设计旨在了解该疾病的实验非常重要。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**GST-parkin和parkin的自动普及。** 一个，西部污点，污点(*左侧面板*)使用泛素抗体显示*在里面体外*在E1、Ubc7和泛素(*第四车道*). 在缺乏E1或泛素的情况下(第一和*第二条车道*)或GST-parkin(*第三条车道*)未观察到自泛化现象。SDS-PAGE凝胶自泛素化反应(*右侧面板*)显示多个GST parkin带以上的泛素化物种。B类，抗泛素蛋白质印迹(*左侧面板*)显示*在体外*在E1、Ubc7和泛素存在下帕金的自动泛素化(*第四车道*). 缺乏泛素修饰的情况下发生E1或泛素(第一和*第二条车道*)或停车场(*第三条车道*). 自泛素化反应的SDS-PAGE凝胶(*右侧面板*)显示公园上方有多种泛素化物种乐队。

**图2。**
**V8蛋白酶对parkin的有限蛋白水解。** 一个，考马斯与V8蛋白酶孵育后的帕金蓝色SDS-PAGE凝胶120分钟。B类，帕金和主要碎片的示意图由LC-MS检测到的V8有限蛋白水解导致每个片段的计算和观察分子质量表示为*正确的。C类*，不含V8蛋白酶的parkin的LC-MS光谱。D类、parkin与V8蛋白酶孵育30分钟的LC-MS光谱。E类，与V8孵育120分钟后帕金的LC-MS光谱蛋白酶。所有计算的质量均来自父停车场还包括N末端GSPGIPARPAATTLPVT先导序列的蛋白质凝血酶裂解后残留。

**图3。**
**胰蛋白酶对parkin的有限蛋白水解。** 一个，考马斯蓝染色帕金SDS-PAGE凝胶与胰蛋白酶120min以上。B类，停车场示意图以及由胰蛋白酶限制的蛋白水解产生的主要片段通过LC-MS检测。计算和观察到的每个片段被指示给*对。C类*帕金的LC-MS光谱胰蛋白酶缺乏。D类帕金的LC-MS光谱胰蛋白酶水解10分钟后。E类帕金的LC-MS光谱与胰蛋白酶孵育90分钟后肿块来源于parkin蛋白，该蛋白还包括凝血酶后保留的N-末端GSPGIPARPAATTLPVT先导序列解理。

**图4。**
**代表性parkin的RING0域的多序列比对正交曲线。**从有限的蛋白质水解中鉴定出所选区域实验。使用ClustalW制作路线，并由Jalview。潜在的锌结合残留物在*黄色的*残留物编号参照人类停车场顺序。

**图5。**
**锌与帕金结合的化学计量学。** 一个、ESI-MS光谱显示天然全长派金，质量为53676.0±1.0 Da对应全长派金加八锌²⁺离子。B类部分变性帕金的ESI-MS显示八种不同的公园物种，由于单个锌结合的预期质量差²⁺离子和损耗两个质子。C类、含有大量53169.8±2.2 Da和无结合锌²⁺离子。

**图6。**
**锌的去除²⁺导致停车场结构损失。**光盘全长parkin（3μ米)5米米特里斯，20米米氯化钠和1 m米pH值为7.4的二硫苏糖醇。光谱不在场时展示全长派克大衣(*粗实线*)、和四人在场(虚线)和八个(虚线)等同于EDTA。增加EDTA的添加量不会导致进一步的变化在CD光谱中。图中还显示了6人在场米盐酸胍(*薄固体线*).

**图7。**
**公园新领域架构示意图。**这个结构域是基于有限的蛋白质水解、序列保守性和质谱数据。RING0域位于RBR地区。表明RING0内的单残基ARJP突变。

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