鲜血。2008年8月15日；112(4): 1493–1502.
红细胞
Ulk1在网织红细胞成熟过程中线粒体和核糖体的自噬清除中起关键作用
，
1,2 ，1,2 ，2 ，2 ，2 ，三 ，4 ，三和2,5 蒙迪拉·昆都
1病理学和检验医学系
2费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所；
图莉亚·林德斯滕
1病理学和检验医学系
2费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所；
杨家英（Chia-Ying Yang）
2费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所；
吴俊敏
2费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所；
赵方平
2费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所；
Ji Zhang（张吉）
三田纳西州孟菲斯圣裘德儿童研究医院生物化学系；
玛丽·塞拉克
4费城儿童医院和宾夕法尼亚大学儿科；和
保罗·奈伊
三田纳西州孟菲斯圣裘德儿童研究医院生物化学系；
克雷格·汤普森
2费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所；
5宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学癌症生物学系
1病理学和实验医学系
2费城宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所；
三田纳西州孟菲斯圣裘德儿童研究医院生物化学系；
4费城儿童医院和宾夕法尼亚大学儿科；和
5宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学癌症生物学系
通讯作者。 收到日期：2008年2月2日；2008年5月6日接受。
摘要
红细胞血红蛋白的产生依赖于线粒体血红素的合成。然而，成熟红细胞缺乏线粒体，依赖糖酵解产生ATP。从成熟红细胞中选择性清除线粒体的分子基础仍然存在争议。最近的证据表明，网织红细胞在核挤压后发生的线粒体和核糖体的清除依赖于自噬。在这里，我们证明了Ulk1，一种与酵母atg1p同源的丝氨酸-苏氨酸激酶，是红细胞成熟最后阶段线粒体和核糖体清除的关键调节器。然而，与核心自噬基因如第5天和第7天，的表达式ulk1号机组对于诱导大自噬以应对营养剥夺或新生小鼠的生存来说，这并不是必需的。总之，这些数据表明，ATG1同源物Ulk1是选择性自噬机制的一个组成部分，导致红细胞内细胞器的消除，而不是自噬的一个基本机制组成部分。
介绍
在新生网织红细胞去核和成熟之前，类红细胞分化包括通过形态上不同的有核前体阶段进行，从原红细胞到正色成红细胞。这一过程导致细胞体积不断减少，血红蛋白生成量大幅增加，并转化为纯糖酵解途径以生产能量。与大多数细胞不同，成熟红细胞没有细胞核或细胞器。在正色成红细胞去核后，新生网织红细胞在48至72小时内成熟，并清除所有细胞内细胞器，包括线粒体和核糖体。大约30%的红细胞血红蛋白是由网织红细胞产生的，由于血红素是在线粒体中合成的，这些细胞器是最后被消除的细胞器之一（参见Geminard等人1). 网织红细胞中线粒体的程序性清除使其成为研究线粒体降解分子途径的理想系统。了解细胞降解线粒体的过程不仅对红细胞成熟很重要，而且对其他细胞类型也很重要，因为受损或功能失调的线粒体的积累与衰老和各种病理过程有关，如糖尿病、癌症、神经退行性变，和α1抗胰蛋白酶病（在Pieczenik和Neustadt中综述2).
网织红细胞线粒体降解的分子途径尚不清楚，尽管对这一过程已有一些重要见解。15-脂氧合酶是一种脂质过氧化物酶，在细胞器降解前不久，其在网织红细胞中的表达达到峰值。三它整合到细胞器膜中，破坏线粒体膜的完整性，使蛋白质从细胞器腔中释放出来，并依赖蛋白酶体降解腔蛋白和完整膜蛋白。4，5化学抑制15-脂氧合酶会损害培养的网织红细胞的线粒体清除率。6最近，使用敲除小鼠模型，我们证明了BH3-only蛋白Nix在网织红细胞线粒体降解中起着关键作用。7溶酶体中线粒体的存在和成熟红细胞的自噬结构长期以来表明自噬与线粒体清除有关8–10; 然而，自噬在这一过程中的作用尚未确定。
自噬是一个分解代谢过程，通过这个过程，细胞内容物被输送到溶酶体进行降解。自噬有几种形式。研究得最好的是宏自噬，它是一种细胞溶质成分（包括细胞器）非特异性地隔离在双膜结合囊泡或自噬体中的过程，自噬体能介导向溶酶体的传递（在昆都和汤普森进行了综述11). 相反，在选择性自噬中，自噬体以特定成分为靶点。虽然线粒体可以通过非特异性的大自噬或选择性自噬相关过程进入溶酶体，但这些途径之间的区别只是最近才在酵母中通过32δ作者1突变体。12，13通常，将线粒体传递到溶酶体的过程统称为“线粒体自噬”或“线粒体吞噬”。可能有助于通过自噬-溶酶体途径以线粒体为靶点进行降解的信号包括酵母线粒体蛋白，如uth1p12和aup1，14BH3-only蛋白质Nix，7线粒体脂质被活性氧氧化，15线粒体膜电位的丧失，16，17在某些情况下可能与线粒体分裂和OPA1表达降低有关。18
许多参与各种形式自噬的基因在酿酒酵母其中几个，包括ATG1、ATG5、ATG6、ATG8、ATG9、ATG12、和ATG13公司似乎有助于线粒体自噬，13，17，19，20尽管对于ATG5型和ATG12型.21在酵母中，atg1p（编码为自动液位计1)是自噬途径中唯一的丝氨酸-三氢嘌呤激酶，也是诱导Tor激酶下游自噬的关键调节因子，Tor激酶协调细胞蛋白翻译以响应营养物质的可用性（在Kamada等人22). Tor激酶调节atg1p与自噬机制其他成分的相互作用，在饥饿条件下从选择性自噬相关过程转换为非选择性大自噬。23，24当营养物质的可用性受到限制时，诱导大分子自噬有助于恢复游离氨基酸库。25在从选择性自噬转变为非选择性自吞噬的过程中，atg1p招募蛋白质以促进更大自噬体的形成。26，27此外，atg1p还参与完整膜蛋白atg9p的穿梭，这可能有助于自噬体膜的再循环。28
小鼠和人类ULK1和ULK2是普遍表达的丝氨酸-三氢嘌呤激酶，在进化上与S酿酒atg1p和秀丽隐杆线虫Unc51。29–31Unc51最初是根据非协调表型秀丽C以其命名的突变体。32Unc51、Ulk1和Ulk2都参与神经递质运输和轴突生长的调节，33–37也许部分是通过调节自噬。38尽管Ulk1和Ulk2可能共享一些功能冗余，但在表达LC3-GFP的HEK293细胞中进行的RNAi筛查发现ULK1系列，但不是ULK2系列作为自噬的重要调节器。39在本研究中，我们建立了一个新的敲除小鼠模型，该模型首次提供了遗传证据，证明哺乳动物atg1p同源物Ulk1在清除网织红细胞中的线粒体和含RNA核糖体方面发挥重要作用，但在饥饿诱导的自噬中不起重要作用。
方法
这些研究中的所有动物用途都得到了宾夕法尼亚大学动物保护和使用委员会（IACUC）的批准。
朋友白血病病毒培养
通过感染FVA贫血诱导株在CD1小鼠中诱导类红细胞增殖。如前所述培养FVA细胞。40简言之，从感染小鼠的扩大脾脏中分离出红系前体，并通过与促红细胞生成素（EPO）培养体外诱导分化。收集培养细胞，并用May-Grünwald和联苯胺染色进行形态学分析。使用100×油物镜在徕卡微系统显微镜（DM2500）上检查载玻片，并使用徕卡DFC420相机和徕卡成像软件（伊利诺伊州班诺克伯恩）拍摄图像。采用先前描述的形态学标准进行分化。41
定量逆转录-聚合酶链反应和Northern印迹分析
使用TRIzol试剂（Invitrogen，Frederick，MD）从细胞中分离出总RNA。根据制造商的说明，使用RNA（1μg），使用SuperScript II逆转录酶（Invitrogen）制备cDNA。所有样本均归一化为18S RNA转录水平。老鼠ulk1、ulk2、和地图1lc3b引物和探针购自Applied Biosystems（加利福尼亚州福斯特市）。样品在7900HT序列检测系统（Applied Biosystems）上运行，并使用SDS 2.1（AppliedBiosystes）进行分析。用1.1-kb探针检测Northern blotsSal公司我-Pst（磅/平方英尺）包含外显子1至15的Ulk1 cDNA（IMAGE克隆；Invitrogen）的I片段。
蛋白质印迹分析和抗体
蛋白质提取物是在放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（150 mM NaCl，1.0%Nonide P-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠，1 mM EDTA，和50 mM Tris·HCl，pH 8.0）中通过裂解细胞制备的，该缓冲液补充有完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）。在14%三甘氨酸凝胶或4%至12%双甘氨酸凝胶（Invitrogen）上分离清除的裂解产物，然后转移到硝化纤维素上。在封闭5%脱脂牛奶后，使用以下主要抗体检测斑点：Ulk1（N17；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru z，CA）、线粒体复合物IV亚基IV（MS407；MitoSciences，Eugene，OR）、LC3、，42和肌动蛋白（AC-74；Sigma-Aldrich）。使用辣根过氧化物酶标记的二级抗体和增强化学发光检测试剂盒（伊利诺伊州阿灵顿高地Amersham）检测条带。
电子显微镜
将电子显微镜样品在pH 7.4的0.1M二碳酸钠缓冲液中的2.5%戊二醛和2.0%多聚甲醛中，在4°C下固定过夜，并按前文所述进行处理。42切片用JEOL 1010电子显微镜（JEOL USA，Peabody，MA）进行检查，该显微镜配有滨松数码相机系统（滨松光电，日本冈山市）。
ulk1漂浮小鼠和小鼠胚胎成纤维细胞的产生
包括新霉素抗性盒（neo）和5.6kb的靶向结构生态生成了包含外显子I至III的RI片段，每个外显子两侧都有loxP位点。该构建物被电穿孔成R1胚胎干细胞（ES）。43之前已经描述过ES细胞的电穿孔、选择和维护。44Southern blotting用于鉴定经过同源重组的克隆。杂合子乌尔克+/佛罗里达州（C57B/6和129Sv混合）小鼠与EIIa-Core（FVB/N）转基因小鼠（马萨诸塞州巴尔港Jackson实验室）交配，生成乌尔克+/−老鼠。这些老鼠交配后存活乌尔克−/−后代以预期的孟德尔频率产生。原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）由ulk1型杂合小鼠，并通过SV40 DNA转染永生化，如前所述。45MEF在补充有10%FBS、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2 mM的DMEM中生长我-谷氨酰胺。RNA制备自ulk1号机组+/+和ulk1号机组−/−MEF和Northern印迹用ulk1号机组cDNA探针。
全血计数和网织红细胞培养
外周血在费城儿童医院临床血液实验室每天校准的Advia 2120血液学系统（西门子，纽约州纽约市）上进行分析。如前所述，每天腹腔内注射40 mg/kg苯肼（Sigma-Aldrich）5天可诱导网织红细胞增多症。8在第7天或第8天采集网织红细胞，并在添加20%BIT（StemCell Technologies，Vancouver，BC）、0.1%单硫代甘油、100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2 mM我-谷氨酰胺和0.5mM腺嘌呤半硫酸盐。
流式细胞术
用Mitotracker Green FM、Mitotracker Red FM、TMRM（均为Invitrogen）、Retic-Count/Thiazole-Orange（BD Biosciences，加州圣何塞）和/或抗鼠CD71-PE（BD bioscience）对网织细胞和小鼠胚胎成纤维细胞进行染色，并使用FACSCalibur（BD Biosciences）进行分析。使用FlowJo软件（TreeStar，Ashland，OR）分析数据。
柠檬酸合成酶活性的测定
在412 nm减去360 nm（13.6 mM）的波长下测量MEF制备的全细胞提取物中柠檬酸合成酶的比活性−1厘米−1)如前所述，使用5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）检测辅酶A中的游离巯基。46
结果
Ulk1表达的诱导与红细胞成熟期间线粒体自噬清除的开始相关
感染贫血诱导型FVA病毒的小鼠在2周内会导致红细胞增殖失控和脾脏肥大。在感染2周后从动物脾脏中获取红细胞前体，并在促红细胞生成素存在下培养诱导分化。401小时后，培养物主要由形态类似于原红细胞（PE）和嗜碱性红细胞（BE）的细胞组成(左图），48小时后分化为网织红细胞期(中央面板）。FVA培养系统可用于跟踪红细胞成熟过程中的基因表达。47事实上，BH3-only蛋白Nix在网织红细胞线粒体清除中的作用最初是通过该系统确定的，其在培养24至36小时时达到峰值。7，48为了探索自噬在红细胞成熟过程中线粒体清除中的作用，我们在1、24、36和48小时从培养物中分离出RNA，并通过定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分析确定了参与自噬的几个基因的表达模式。表达模式类似于尼克斯包括哺乳动物自动液位计1同源，ulk1号机组、和自动液位计8同源，地图1lc3b.
Ulk1表达的诱导与红细胞终末成熟期间自噬的开始和线粒体的丢失有关。使用前面描述的FVA培养系统检查红细胞成熟度。40（A） 在促红细胞生成素（EPO）存在下培养1小时（左面板）和48小时（中面板）的脾成红细胞的May-Grünwald和联苯胺（插图）染色。右图显示了代表性实验中培养1、24、36和48小时后红系成熟不同阶段细胞的相对分布。每个时间点对300多个细胞进行分化。PE表示原红细胞；BE，嗜碱性红细胞；PCE，嗜多染红细胞；OCE，正色成红细胞；网织红细胞。（B） 定量RT-PCR（TaqMan，Applied Biosystems）分析使用培养1、24、36和48小时后从细胞中分离的RNA进行三次。的级别ulk1号机组和ulk2号机组mRNA被归一化为18秒RNA。的表达式ulk1号机组和ulk2型图中显示了相对于对照3T3细胞中的水平。误差线表示标准偏差。（C） 在培养1、24、36和48小时后，使用ulk1号机组cDNA探针（底部面板）。顶部面板显示溴化乙锭染色琼脂糖凝胶上核糖体RNA的水平。（D） 培养1、24、36和48小时后的细胞蛋白质印迹分析。（E） 在培养1、24、36和48小时后，使用从细胞中分离的RNA进行三次定量RT-PCR（TaqMan）分析。的级别立方厘米RNA水平标准化为18秒RNA。图表显示立方厘米相对于1小时时间点的RNA水平。误差线表示标准偏差。（F） 含有线粒体的自噬体的典型电子显微照片（突出显示为➚) 在网织红细胞中。
Ulk1（Unc51样激酶1）是一种与进化相关的丝氨酸苏氨酸激酶秀丽CUnc51和酵母atg1p。30对大鼠骨髓成红细胞的超微结构研究表明，线粒体的自噬清除在正色成红细胞去核过程中开始，并在网织红细胞中继续进行。9在FVA培养36和48小时时，观察到正色成红细胞和网织红细胞的百分比增加(与之前的报道一致，网织红细胞显示出频繁的自噬空泡和含有细胞器的溶酶体结构(F） ●●●●。8–10There was a dramatic increase inulk1号机组通过定量RT-PCR分析培养36和48小时mRNA的表达，使用特异性引物/探针集ulk1号机组(B） 和Northern印迹分析(C） 与正色红细胞和网织红细胞百分比增加相关。Ulk1与Ulk2具有显著同源性，31然而，相对较低的基础水平和缺乏分化诱导的表达ulk2号机组如所示B建议ulk2号机组在红细胞成熟过程中不起重要作用。培养物中Ulk1蛋白水平也增加(D） ●●●●。Ulk1蛋白和RNA水平的增加与线粒体蛋白（包括Cox IV亚单位IV）的丢失相关。同时，有生物化学证据表明诱导自噬，如脂质（磷脂酰乙醇胺）结合形式的Map1LC3，即LC3-II，在36和48小时出现。Map1LC3是一种泛素样分子，在诱导自噬后与磷脂酰乙醇胺结合；这种修饰似乎促进了LC3与自噬体膜的结合，这是自噬小体形成和扩张的重要步骤。囊泡形成后，LC3仍结合在自噬体膜表面。的转录地图1lc3也随着自噬的刺激而增加（在Tanida等人49). 因此，我们观察到立方厘米红细胞分化过程中的RNA水平(E） ●●●●。
Ulk1基因敲除动物是可行的
因为缺乏核心自噬基因，例如第5天或第7天导致围产期死亡的原因是饥饿，以及无法在肝脏、心脏和骨骼肌等关键组织中维持关键水平的氨基酸和葡萄糖，50，51Ulk1在这些组织中表现出高水平表达，30我们决定生成一个条件敲除小鼠模型来检查ulk1型体内红系成熟。生成ulk1号机组有条件淘汰赛(A） 以及正确靶向ES细胞的代表性Southern印迹(B） 如图所示。藏匿有鞭毛的动物ulk1号机组等位基因（ulk1+/弗洛克斯)与EIIA-Cre转基因动物杂交，以产生在ulk1号机组轨迹（ulk1+/−)小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）由ulk1号机组−/−动物，没有发现ulk1号机组mRNA或Ulk1蛋白表达(C、 D）。与Atg5或Atg7缺陷细胞相比，50，51与野生型相比，Ulk1缺陷的MEF在葡萄糖戒断时表现出LC3转化水平，这表明在缺乏Ulk2的情况下可以诱导自噬(E） ●●●●。与Ulk1缺陷MEF中自噬的诱导一致，ulk1号机组−/−动物存活，没有明显的发育缺陷。
产生可行的ulk1型−/−自噬无明显缺陷的小鼠。（A） 第一个面板显示了ulk1号机组基因。第二个面板描述了引入ulk1号机组等位基因，其中液氧P站点侧翼5.6 kb生态包含外显子I至III的RI片段。第三个面板显示了野生型（WT）和漂浮型（FL）的预期大小ulk1型等位基因，用巴姆用1-kb探测后HI生态RI公司-巴姆HI探头（由条指示）。（B） Southern blot分析巴姆HI消化的DNA来自代表性野生型（WT）和漂浮型（FL）ulk1号机组用探针探测克隆生态RI公司-巴姆HI探头。该探针在WT小鼠中产生大约19-kb的片段，但由于克隆到液氧P矢量a巴姆引入HI限制位点，在含有同源重组flox的克隆中产生4.3kb片段ulk1型等位基因。（C） Northern印迹分析ulk1号机组+/+（重量）和ulk1号机组−/−（KO）小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。（D） 蛋白质印迹分析ulk1号机组+/+（重量）和ulk1号机组−/−（KO）MEF。星号（*）表示非特定带。（E） 蛋白质印迹分析ulk1号机组+/+（重量）和ulk1号机组−/−（KO）在存在（C）或不存在葡萄糖（−gluc）的情况下培养24或48小时的MEFs。实验一式三份。误差线表示标准偏差。LC3转化率百分比使用以下公式计算：100*LC3-I/总LC3。
Ulk1缺乏导致新的CD71人群−保留线粒体的红细胞
为了描述Ulk1缺陷对红细胞生成的影响，从野生型（WT）和Ulk1-缺陷敲除（KO）小鼠（年龄8周至5个月）收集外周血，并使用Advia 2120血液学系统进行全血计数(). 在ulk1号机组−/−小鼠，包括网织红细胞绝对计数的增加（389.7±48.8×109WT中的细胞数/L vs 1735.7±401.6×109KO中的细胞/L）和网织红细胞百分比（WT中的0.037±.005[3.7%±0.5%]与KO中的.179±.043[17.9%±4.3%]）。平均红细胞体积（MCV）也从野生型的49.9±1.8 fL增加到Ulk1缺陷小鼠的54.5±1.8 fL.这反映了成熟红细胞和网织红细胞的MCV增加。白细胞或血小板计数无显著差异（数据未显示）；红细胞（RBC）计数轻度下降ulk1号机组−/−小鼠（10.6±1.3×1012/重量中的L vs 9.8±0.7×1012/KO中的L）未达到统计显著性。总血红蛋白（Hb）没有显著改变，但平均红细胞血红蛋白（MCH，Hb/RBC）在ulk1号机组−/−小鼠（WT中为15.5±0.6 pg，KO中为17.1±0.7 pg），与成熟红细胞（CHm’s）和网织红细胞（CHr’s）中血红蛋白含量的增加相关（WT为15.4±0.6 pg，KOs为16.9±0.7 pg）。红细胞分布宽度（RDW）的增加（WT为12.1%±0.6%，KO为15.1%±1.3%）ulk1号机组−/−小鼠反映出成熟红细胞的RDW增加；网织红细胞的RDW同时降低（WT为16.6%±0.9%，KO为12.1%±1.1%）。RDW和MCV的研究结果共同表明网织红细胞成熟缺陷特别影响细胞质含量的正常损失。
表1
野生型红细胞指数（WT，ulk1号机组+/+)和击倒（KO，ulk1号机组−/−)老鼠
| 重量，n=10 | KO，n=10 |
|---|
| 红细胞，×1012/L（左） | 10.6 ± 1.3 | 9.8 ± 0.7 |
| 血红蛋白，g/L | 164 ± 19 | 166 ± 13 |
| HCT公司 | 0.529±0.60 | 0.532 ± 0.045 |
| MCV，飞行高度 | 49.9 ± 1.8 | 54.5 ± 1.8* |
| 妇幼保健，pg | 15.5±0.6 | 17.1 ± 0.7* |
| MCHC（克/升） | 310 ± 5 | 314 ± 10 |
| RDW，% | 12.1±0.6 | 15.1 ± 1.3* |
| 视网膜，% | 0.037 ± 0.05 | 0.179 ± 0.043 |
| 视网膜，×109细胞/L | 389.7 ± 48.8 | 1735.7 ± 401.6* |
| MCV成熟，fL | 51.1 ± 1.8 | 53.8 ± 1.4* |
| CHCM成熟，g/dL | 30.1 ± 0.6 | 31.6 ± 1.2* |
| CH成熟，pg | 15.4 ± 0.6 | 16.9 ± 0.7* |
| RDW成熟，% | 11.4 ± 0.6 | 14.2 ± 1.1* |
| MCV网，fL | 62.3 ± 1.9 | 65.1 ± 1.3* |
| CHCM网，g/dL | 27.5 ± 0.5 | 28.8 ± 1.1* |
| CH网，pg | 17.0 ± 0.7 | 18.7 ± 0.7* |
| RDW利尿剂，% | 16.6 ± 0.9 | 12.7 ± 1.1* |
为了更详细地描述红细胞群体，我们使用流式细胞术检查了表面CD71表达与线粒体和RNA的存在之间的关系，这些参数用于区分网织红细胞和成熟红细胞。52CD71是转铁蛋白受体，存在于网织红细胞表面，但随着线粒体被清除，血红蛋白停止生成，CD71通过胞吐作用从红细胞膜上清除（在de Gassart等人53). 使用噻唑橙进行RNA染色是临床实验室中已建立的网织红细胞计数方法。54线粒体可以用荧光染料检测，包括Mitotracker Green FM55和Mitotracker Red 580（不依赖线粒体膜电位而在线粒体中积累），以及电位染料，如仅在完整极化线粒体中积累的四甲基罗丹明甲酯（TMRM）。通过流式细胞术对Ulk1缺陷小鼠和野生型同窝小鼠的外周血进行检测，发现网织红细胞（CD71）的百分比有不同程度的增加+（线粒体示踪剂阳性，TO阳性），以及出现大量红细胞，未检测到CD71表达，保留线粒体和可变量RNA(A-C）。这群CD71−在Ulk1缺陷小鼠中观察到保留线粒体的红细胞，但在网织红细胞计数升高的野生型动物或地中海贫血动物中未检测到（数据未显示）。这些残留线粒体的线粒体膜电位似乎保持得相对较好，因为它们可以用电位染料TMRM检测到(D） 通过添加羰基氰化物间氯苯基腙（CCCP），该信号被消除，CCCP是一种有效的线粒体解偶联剂，可导致线粒体膜电位损失。对Ulk1缺陷动物的外周血样本进行了电子显微镜检查，结果显示红细胞中存在线粒体(E） 频率与使用荧光线粒体特异性染料获得的频率相似。电子显微镜也观察到核糖体。
线粒体在小鼠成熟红细胞中的滞留ulk1号机组−/−老鼠。来自21的外周血ulk1号机组+/+（WT）和19ulk1号机组−/−采用荧光激活细胞分选（FACS）分析8周至5个月龄的（KO）小鼠。（A） 用Mitotracker Green FM（y轴）和CD71-PE（x轴）染色的WT（左面板）和KO（中面板）细胞的代表性等高线图，直方图（右面板）显示了两个群体（WT和KO）的Mitotracker Green荧光（FL1）的直接比较。（B） 噻唑橙染色的WT（左面板）和KO（中面板）细胞的代表性轮廓图(年-轴）和CD71-PE(x个-轴），直方图（右侧）显示了两个种群的噻唑橙荧光（FL1）的直接比较。（C） 图中显示了用Mitotracker Green FM（MG+）、噻唑橙（TO+）和CD71（CD71+）染色阳性的单个WT和KO动物的红细胞百分比。图形化描述了总体平均值和标准偏差（误差条），并显示了Mitotracker Green阳性率（WT为3.7%±1.2%，KO为16.5%±6.4%）、噻唑橙阳性率（WM为7.0%±2.1%，KOs为15.8%±4.4%）和CD71的统计显著差异+（WT为3.1%±1.2%，KO为8.0%±3.4%）红细胞。统计上的显著差异(P（P）<.001）WT和KO人群之间由Student确定t吨测试分析和用星号（*）标记。（D） TMRM染色的WT（左侧）和KO（右侧）红细胞的代表性直方图。标记物表示TMRM染色阳性。每个经TMRM染色的样品被分成2个试管，在分析之前，将线粒体解耦剂CCCP添加到其中一个试管中。显示了在50μM CCCP中孵育前（WT中1.4%vs KO中13.2%）和孵育后（WT的0.1%vs.KO的0.4%）TMRM阳性细胞的百分比。（E） WT（上图）和KO（下图）红细胞的代表性电子显微照片。➚ 指向完整的线粒体。核糖体可见于红细胞的一个子集（右下角）。
Ulk1缺乏导致网织红细胞线粒体清除延迟
与野生型同窝小鼠相比，Ulk1缺陷小鼠表现出轻微的脾肿大（体重增加1.7±0.4倍；每个基因型n=8）。尽管没有一致的组织学或流式细胞术证据表明髓外造血增加（数据未显示），但应激性红细胞生成可能有助于在Ulk1缺陷动物中观察到的网织红细胞增加。为了明确确定未成熟网织红细胞（也称为“应激”或“移位”网织红血球）是否通过自噬清除线粒体，以及如果Ulk1缺陷导致网织红血细胞线粒体清除缺陷，我们从野生型和Ulk1-缺陷小鼠分离网织红系细胞，并在培养中跟踪网织红红细胞成熟。为此，用苯肼治疗小鼠，以诱导溶血性贫血和代偿性网织红细胞增多症。最后一次注射后2天，从Ulk1缺陷小鼠和野生型室友的外周血中分离出的网织红细胞超过70%，这反映在Mitotracker的急剧增加(B、 未经处理与苯肼处理0小时相比），噻唑橙(C、 未经处理与苯肼处理0小时相比），CD71（数据未显示）染色。培养18小时后，野生型动物的网织红细胞经Mitotracker Green FM或Mitotracher Red 580显示线粒体染色损失20%(A、 B）并且噻唑橙染色损失大于40%(C） 和CD71（数据未显示），表明线粒体和RNA的清除以及网织红细胞的成熟。3甲基腺嘌呤（3-MA，10 mM；A） ，一种公认的自噬抑制剂，和1μM羟氯喹（数据未显示），表明自噬在红系终末成熟过程中对线粒体清除很重要。
Ulk1缺乏损害网织红细胞的线粒体清除率。（A） 野生型苯肼处理小鼠的外周血中CD71含量大于70%+/视网膜计数阳性网织红细胞。该图显示了培养开始时（0小时）和在含有或不含所示剂量的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）的培养18小时后，Mitotracker红色FM染色细胞的平均荧光强度（MFI）。（B） 该图显示了未经治疗（注射PBS）和苯肼（PHZ）治疗的Mitotracker Green染色红细胞的平均荧光强度（MFI）ulk1号机组+/+（WT，每组n=3）和ulk1号机组−/−（KO，每组n=3）小鼠在培养开始时（0小时），PHZ在完全培养基中处理18小时后，添加或不添加50μM CCCP。（C） 图中显示了面板B中所述噻唑橙染色样品的平均荧光强度（MFI）。Student确定了WT和KO人群之间的统计显著差异t吨测试分析，并标有星号：*P（P）< .05; **P（P）< .01; ***P（P）<0.005。
与野生型同胞相比，来自Ulk1缺陷动物的网织红细胞线粒体清除功能受损(B） ●●●●。这并不是因为完全不能清除线粒体，因为这种缺陷可以通过在线粒体解偶联剂CCCP存在下培养来克服(B） ●●●●。需要注意的是，添加CCCP不会改变Mitotracker Green染色，而TMRM是在细胞膜电位丧失的情况下释放出来的（数据未显示）。这些发现表明，尽管Ulk1在线粒体清除中起作用，但仍有多余的Ulk1-独立机制最终清除线粒体的红细胞(C） 以及高剂量（20 mM）的3-MA（数据未显示），表明自噬也在清除RNA结合核糖体中发挥作用。
Ulk1缺陷小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）线粒体质量增加
为了确定Ulk1在线粒体清除中的作用是否对红细胞特异，我们采用两种独立的技术检测了来自Ulk1-缺陷胚胎的小鼠胚胎成纤维细胞的线粒体质量。首先，我们通过流式细胞术观察到Mitotracker Green FM染色增加，TMRM染色相应增加(A、 B）。接下来，从野生型和Ulk1缺陷型MEF制备提取物，并分析柠檬酸合成酶活性（归一化为总蛋白）。柠檬酸合成酶是一种线粒体基质蛋白，其活性与线粒体质量密切相关。56 与野生型相比，Ulk1缺陷型MEF中柠檬酸合成酶活性在统计学上显著增加。在细胞大小没有明显差异的情况下（近似于前向散射，D） 流式细胞术分析显示，柠檬酸合成酶活性的可复制增加以及线粒体染色的增加表明，Ulk1缺陷的MEF中线粒体质量增加，并表明Ulkl在调节线粒体清除方面的作用并不局限于RBC。
线粒体质量增加ulk1号机组−/−小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。（A） MEF来源于ulk1号机组+/+（重量）和ulk1号机组−/−（KO）用Mitotracker Green FM染色并用FACS分析。直方图显示了线粒体追踪染色在两个种群中的分布。显示标记内细胞百分比的平均值（n=5）和标准偏差。标记设置为包括两个图交点上方的所有点，以突出两个群体之间的染色差异。（B） MEF来源于ulk1号机组+/+（重量）和ulk1号机组−/−（KO）用TMRM染色。直方图显示了50μM CCCP孵育前后TMRM染色在两个种群中的分布。显示标记内细胞百分比的平均值（n=5）和标准偏差。CCCP治疗后，WT MEF和KO MEF的平均FL2荧光分别降至5.8（±0.3）和5.7（±0.1）。（C） 图中显示了从野生型（WT）和Ulk1-缺陷型（KO）MEF制备的全细胞提取物中柠檬酸合成酶活性归一化为总蛋白。显示了平均值（n=5）和标准偏差。统计显著性(P（P）<.01）由学生计算t吨测试分析，并用星号（*）标记。（D） 显示MEF前向散射分布的代表性直方图ulk1号机组+/+（重量）和ulk1号机组−/−（KO）。
讨论
在这里，我们证明了自噬的关键调节因子Ulk1在网织红细胞成熟过程中的细胞器清除中起着重要作用。Ulk1缺陷小鼠的红细胞参数出现了一些具有统计学意义的变化，包括网织红细胞（百分比和绝对数）、平均细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）和成熟红细胞的相对分布宽度（RDW）的增加。总之，这些发现表明，Ulk1缺陷会导致网织红细胞成熟缺陷，从而损害细胞成分的清除。在Ulk1缺乏的红细胞群体中，线粒体和RNA-结合核糖体的保留可能导致血红蛋白生成增加，并可能导致成熟红细胞（CHm’s）和网织红细胞（CHr’s）的血红蛋白含量增加。与Ulk1在有效清除成熟红细胞的细胞器方面发挥重要作用的假设一致，流式细胞仪分析和电子显微镜显示，Ulk1-缺陷小鼠外周血中多达35%的红细胞保留完整的线粒体；这些红细胞中的许多也含有核糖体。此外，由于化学抑制自噬和Ulk1缺乏，线粒体和RNA（可能与核糖体结合）从未成熟网织红细胞中的清除受到损害。总之，这些发现暗示Ulk1参与线粒体和核糖体的自噬清除。有趣的是，最近的一项研究表明自噬与酵母中核糖体的选择性降解有关。57
尽管这些发现表明，Ulk1缺陷导致细胞器清除缺陷，但最终，大多数红细胞清除线粒体和其他细胞器。因此，在缺乏功能性Ulk1的情况下，附加系统或相关蛋白Ulk2的低水平表达可导致细胞器清除。事实上，线粒体清除缺陷ulk1号机组−/−用CCCP（一种线粒体解偶联剂，可增加活性氧（ROS）的产生并导致线粒体膜去极化）处理网织红细胞，可在体外克服网织红血球。58由于线粒体膜电位的丧失和ROS诱导的线粒体脂质过氧化与线粒体自噬独立相关，15–17CCCP可能以Ulk1非依赖性的方式提供多种信号以提高线粒体自噬的效率。酶15-lox催化线粒体脂质过氧化，Nix和15-lox均可导致线粒体膜电位的损失，59，60因此，这两者之一或两者都可能提供必要的生理信号，以促进Ulk1缺陷型网织红细胞的线粒体自噬。Ulk1与其他线粒体清除介质的关系尚待阐明。
使用靶向敲除策略在小鼠中研究的其他广泛表达的自噬基因导致胚胎或围产期死亡，从而排除了自噬对出生后细胞过程的影响。50，51，61相比之下，Ulk1对小鼠的生存并不重要。这可能是因为Ulk1和Ulk2显示出超过50%的总同源性，在诱导和执行自噬的能力方面存在功能冗余。当自噬对维持肝脏、心脏和骨骼肌中足够的氨基酸和葡萄糖供应至关重要时，Ulk1缺陷小鼠的存活能力超过新生期，这表明这种自噬机制不需要Ulkl，或者Ulk2可以弥补其缺陷。例如，在HEK293细胞中执行的RNAi屏幕中，39研究表明，Ulk1（而非Ulk2）对诱导自噬以应对氨基酸撤退至关重要。相比之下，在正常表达可检测到的Ulk2水平（数据未显示）的MEF中，我们证明Ulk1缺陷不会导致对葡萄糖戒断反应的自噬诱导出现明显缺陷。
总之，这些发现表明，Ulk1在红系细胞线粒体和RNA结合核糖体的靶向降解中起着关键作用，但对诱导饥饿诱导的大自噬并不重要。
致谢
作者感谢宾夕法尼亚大学生物医学成像中心（University of Pennsylvania Biomedical Imaging Core）的成员，特别是Neelima Shah和Ray Meade，感谢他们在电子显微镜方面的技术援助；汤普森实验室成员进行有益的讨论；和Mitch Weiss（费城儿童医院）提供地中海贫血小鼠的外周血。
这项工作得到了田纳西州孟菲斯圣犹德儿童研究医院（P.A.N.）美国、黎巴嫩和叙利亚联合慈善机构（ALSAC）的支持，并得到了美国血液学会（华盛顿特区；M.K.）、Burroughs Wellcome基金会（北卡罗来纳州三角研究基金会；M.K..）、国家癌症研究所（马里兰州Bethesda；RO1 CA099179和RO1 CA105463至C.B.T）、国家心脏、肺和血液研究所（马里兰州贝塞斯达；K08 HL084199至M.K.）和国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（医学兰州贝塞斯达；R21 DK074519至P.A.N.）。
脚注
这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，仅为了表明这一事实，根据《美国法典》第18卷第1734节的规定，本文特此标记为“广告”。
作者
贡献：M.K.设计并执行了研究，分析了数据，进行了统计分析，并起草了论文；T.L.设计并进行了研究，分析了数据，并对论文进行了批判性审查；J.W.、C.-Y.Y.、F.Z.和J.Z.进行了研究；M.A.S.和P.A.N.设计并执行研究；和C.B.T.设计了研究并修改了论文。
利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。
通讯地址：蒙迪拉·昆杜，宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所，宾夕法尼亚州费城居里大道421号，邮编：19104；电子邮件：ude.nnepu.shpu@mudnuk.
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