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.2009年5月27日；4（5）：e5701。
doi:10.1371/journal.pone.0005701。

动力蛋白相关蛋白1的钙调神经磷酸酶依赖性去磷酸化影响PINK1缺陷细胞的线粒体改变

安娜·桑德布林 1, 凯利·让·托马斯, 亚历山德拉·贝利纳, 马塞尔·范德布鲁格, 梅根·M·克莱兰德, 里利·艾哈迈德, 大卫·W·米勒, 伊巴多·赞布拉诺, 理查德·考本, 霍米拉·贝巴哈尼, 安吉尔·塞达佐·米恩格斯, 马克·库克森
附属公司

PINK1缺陷细胞的线粒体改变受到钙调神经磷酸酶依赖性动力蛋白相关蛋白1去磷酸化的影响

安娜·桑德布林等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

PTEN诱导的新激酶1（PINK1）突变与常染色体隐性帕金森综合征相关。先前的研究表明，PINK1影响线粒体功能和形态，尽管尚不清楚哪些是主要事件，哪些是次要事件。在这里，我们描述了一种新的机制，将线粒体功能障碍与PINK1相关的线粒体形态改变联系起来。通过用增加或敲除PINK1的慢病毒构建物稳定地转染人类多巴胺能M17细胞生成细胞系。与之前的研究一样，PINK1缺陷细胞具有较低的线粒体膜电位，并且对线粒体复合物I抑制剂的毒性作用更敏感。我们还表明，野生型PINK1（而非隐性突变或激酶死亡型）可防止鱼藤酮诱导的线粒体断裂，而PINK1-缺陷细胞则表现出较低的线粒体连接性。动力蛋白相关蛋白1（Drp1）的表达夸大了PINK1缺陷表型，而Drp1 RNAi可以挽救这些表型。我们还发现，由于钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶的激活，Drp1在PINK1缺陷细胞中被去磷酸化。因此，钙调磷酸酯抑制剂FK506在PINK1缺陷细胞中阻断了Drp1去磷酸化和线粒体完整性的丧失，但不能完全挽救线粒体膜电位。我们认为该系统中线粒体连接性的改变是线粒体膜电位功能效应的次要影响。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。PINK1表达改变线粒体功能和细胞活力。
（A–C）PINK1变异体的稳定过度表达。（A） 使用慢病毒转导产生的稳定细胞系的Western blot，用于PINK1的同等表达。表达LacZ的对照慢病毒显示在第1栏，第2-4栏是表达野生型（WT）、G309D或激酶死亡（KD）PINK1的细胞系。这些细胞中的PINK1在C末端标记为V5，可见PINK1的前体（箭头）和成熟（闭合箭头）形式。在下面板中，用β-肌动蛋白重新标记印迹，以显示相等的负荷。右边的分子量标记以千道尔顿为单位。（B） 使用TMRM在活细胞中使用FACS测量线粒体膜电位。结果表示为TMRM荧光高于阈值的平均细胞数，阈值是通过CCCP使一组细胞去极化（100µM，10分钟；参见补充图S1）。误差条显示SEM（n = 每条线6-7个独立实验）。两条线之间没有统计上的显著差异(P（P） = 方差分析为0.23）。（C） 细胞暴露于100 nM鱼藤酮48小时后，使用FACS测量细胞存活率。活细胞定义为AnnexinV（AnnV）和碘化丙啶（PI）阴性，表示为所有分选细胞的百分比；凋亡细胞AnnV阳性/PI阴性；坏死细胞AnnV阴性/PI阳性；晚期凋亡细胞AnnV阳性/PI阳性。每个条形图是3个实验的平均值，每个实验中计数10000个细胞，误差条形图表示实验之间的SEM。对仅表达WT PINK1的细胞来说，细胞活力的提高是显著的(第页 = 0.03). （D–F）PINK1稳定击倒。（D） 条形图显示使用定量RT-PCR估计的平均相对PINK1表达，归一化为β-actin表达。与非特异性对照shRNA相比，两种不同的PINK1 shRNA序列A和C降低了内源性mRNA的表达(P（P）整体<0.0001）和Dunnett的多重比较事后（post-hoc）与对照shRNA细胞系进行比较时的测试；***，P<0.0001（n = 6个独立实验，误差条显示SEM）。（E） 测量线粒体膜电位，并用（B）表示。对照组和PINK1 shRNA之间的差异在t吨-测试(P（P） = 0.0008,n个 = 5个独立实验）。（F） 与对照shRNA相比，PINK1缺陷细胞暴露鱼藤酮后的细胞存活率（如（C）所示）较低。存活细胞的百分比差异显著(P（P） = 通过t检验为0.009，n个 = 3).
图2
图2。PINK1对鱼藤酮的反应影响线粒体形态。
（A） M17细胞系用有丝分裂跟踪器染色，细胞分为三种形态类型之一；完整、截断或碎片。底部面板中的比例尺为10µm，适用于所有荧光显微照片。（B，C）在三个实验中的每一个实验中，对过度表达PINK1（B）或缺乏PINK1（C）的细胞系进行45–130个细胞的盲法计数，并暴露或不暴露于100 nM鱼藤酮24小时。线粒体截短或破碎的细胞表示为总数的百分比。误差条表示实验之间的SEM。通过双向方差分析评估线粒体形态和细胞系的统计学显著性。P（P）细胞组的数值显著，如上图所示。（D）对照shRNA或PINK1 shRNA系的透射电镜图像。在低倍镜下（上面板），可以看到线粒体（M）与溶酶体（L）的结合，尤其是在PINK1缺陷细胞中。偶尔也可以看到液泡，以星号表示。N个 = 核心。高倍镜下（低倍镜下），PINK1缺陷细胞的线粒体嵴被破坏（箭头所示），而对照细胞的线粒体形态正常。每个图都显示了比例尺，在顶部面板中为1µm，在下部面板中为0.5µm。（E） 对多个实验中的异常嵴进行计数表明，与对照shRNA相比，PINK1缺陷系中显示线粒体嵴异常的细胞大约是对照shRNA的两倍（*，P（P） = 通过t检验为0.032，n个 = 8).
图3
图3。PINK1可防止鱼藤酮诱导的线粒体连接丢失。
（A） 用mito-YFP转染活细胞后进行成像。与对照系相比，表达PINK1的细胞线粒体更长（此处显示激酶死亡）。鱼藤酮在对照品系中诱导裂解，但在表达PINK1的品系中不诱导裂解。右下面板中的比例尺为2µm，适用于所有荧光显微照片。（B） FRAP曲线表明，对照细胞在对照条件下（开环）比暴露于100 nM鱼藤酮24 h后（闭环）表现出更多的恢复。在本实验中，对照细胞是仅用mito-YFP载体转染以成像线粒体（标记载体）的亲本M17细胞。（C） 相反，用野生型PINK1稳定转导的细胞显示出非常相似的FRAP曲线，无论是在鱼藤酮存在的情况下（闭合圈）还是在控制条件下（开放圈，DMSO用作鱼藤酮的载体）进行测量。转染G309D或激酶死亡PINK1的细胞对鱼藤酮也有反应（数据未显示）。在B和C中，每个点都是>30个单独测量的平均值，并且代表了每个线/处理至少三次重复的实验。误差条表示SEM。（D）在所示细胞系中测量了mito-YFP的流动分数（颜色如B所示，填充的盒子经过鱼藤酮处理）。在本图和所有其他流动分数图中，总结了24-30个单元格。方框表示上四分位数和下四分位数，中心线表示中值，范围条表示10第个至90第个百分位数范围。位于该范围之外的单元格显示为单点。总体而言，各治疗组之间的差异显著(P（P）<0.0001（ANOVA）和Student-Newman-Kuells’事后的，事后的该试验用于评估鱼藤酮在每个品系中的作用*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001; 纳秒 = 不重要(P（P）>0.05). （E） 表达针对PINK1的shRNA的细胞显示出一些基本的分裂证据，一些碎片线粒体可见，对鱼藤酮和线粒体肿胀的反应过度。右下面板中的比例尺为2µm，适用于所有荧光显微照片。（F–H）FRAP分析，如（B，C）所示，显示对照shRNA系（F）和shRNA对抗PINK1（G）。开放符号是未经处理的细胞，封闭符号用100 nM鱼藤酮处理24小时。（H） 根据FRAP曲线计算流动分数值，如（D）所示。治疗之间的差异总体上是显著的(P（P）方差分析结果<0.0001；n个 = 30个细胞，代表每个细胞系至少三个实验）和Student-Newman Kuells’事后的，事后的试验用于评估鱼藤酮在每个品系中的作用*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001; 纳秒 = 不重要(P（P）>0.05). 补充图S2显示了额外的shRNA序列。
图4
图4。PINK1缺陷细胞的线粒体融合事件较少。
（A） 对照shRNA（上面板）或PINK1 shRNA（下面板）细胞转染有线粒体定向的光激活GFP，然后在一个小的感兴趣区域内进行光激活（见材料和方法）。显示光激活后单个细胞的序列图像（如上图所示，0、15、30、45和60分钟）。当细胞具有融合能力时，光激活区域的荧光会随着时间的推移而减少。请注意，上面板中对照线细胞的荧光强度在30分钟内相等，而PINK1缺陷细胞保留较高强度的区域，表明融合减少。每个比例尺为5µm，适用于该系列中的所有荧光显微照片。（B） A（N）中实验的量化 = 3个实验，n个 = 每个实验每个时间点测量的9–10个细胞）显示亲本M17细胞（黑色三角形）、对照shRNA（蓝色圆圈）或PINK1 shRNA（粉红色方块）细胞系随着时间的推移荧光消失。双向方差分析显示，细胞株间差异显著（P<0.001），时间效应也显著（P<0.0001）。博菲罗尼事后的，事后的测试用于比较PINK1shRNA系和对照shRNA系*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001. 误差条表示实验之间的SEM。
图5
图5。由于PINK1缺失引起的线粒体效应可以通过敲除Drp1来挽救。
（A） 与非特异性GFP siRNA相比，对照shRNA或PINK1 shRNA稳定细胞系暴露于Drp1 siRNA四天，Drp1（箭头）的敲除率约为70%。β-actin的负载量相等。分子量标记以千道尔顿为单位。（B） mito-YFP转染的对照shRNA（上面板）和PINK1 shRNA（下面板）细胞暴露于针对GFP的非特异性siRNA（左面板）或针对Drp1的siRNA（右面板）的活细胞图像。比例尺为2µm，适用于所有荧光显微照片。（C） FRAP曲线表明，在基本情况下，对照shRNA系和PINK1 shRNA系之间存在差异。在细胞暴露于抗Drp1的siRNA后，这些差异部分恢复正常。每个点是>30个单独测量值的平均值，误差条表示SEM。（D）在对照小RNA或PINK1小RNA细胞系中，在表达对照小RNA（对抗GFP）或表达小RNA对抗Drp1后，测量了mito-YFP的流动分数。方框图汇总数据n个 = 24-30个细胞，代表重复实验。总体而言，各治疗组之间的差异显著(P（P）<0.0001（ANOVA）和学生-Newman Kuells’事后的，事后的试验用于评估每次处理后对照shRNA和PINK1 shRNA之间的差异*P（P）<0.05; **P（P）<0.01. （E） 如图2所示，对n进行线粒体形态计数 = 来自重复实验的60个细胞。Drp1 siRNA减少线粒体截短或破碎的细胞数量。以形态学和细胞系/处理为因素，通过双向方差分析分析差异，P（P） = 对于不同的细胞组，总体上为0.001。（F） 从未固定的、有丝分裂YFP转染细胞的图像中测量线粒体长度。方框表示上四分位数和下四分位数，中心线表示中位数，范围条表示10第个至90第个百分位数范围。总体而言，各治疗组之间的差异显著(P（P）方差分析结果<0.0001，n个 = 14–29）和纽曼·库尔斯学生事后的，事后的试验用于评估每次处理后对照shRNA和PINK1 shRNA之间的差异***P（P）<0.001.
图6
图6。PINK1缺乏和Drp1表达增加具有加性效应。
（A–D）对照shRNA（A，B）或PINK1 shRNA（C，D）转染YFP-Drp1（上部为绿色），并用丝裂原追踪仪染色（上部为红色；下部仅显示丝裂原跟踪仪通道的扩大部分）。转染24小时后，PINK1 shRNA株系（D）表现出比对照shRNA株更多的线粒体损伤。箭头所示为PINK1缺陷细胞中常见的线粒体小碎片，箭头所示的圆形碎片仅在PINK1-缺陷细胞中可见。（D）下部面板中的比例尺为10µm，适用于所有显微照片。（E） 用YFP或YFP-Drp1转染对照shRNA和PINK1 shRNA细胞。作为负荷对照，对总细胞裂解物或线粒体部分进行Drp1或Hsp60的印迹。右边的标记单位是千道尔顿。（F） 对照shRNA（上面板）或PINK1 shRNA细胞（下面板）转染有mito-YFP，无（左面板）或Drp1（右面板），并拍摄实时图像。与A–D中一样，箭头显示线粒体的小碎片和箭头圆形残留物。右下面板中的比例尺为2µm，适用于所有荧光显微照片。如图3所示，使用（G，H）FRAP评估Drp1过度表达的影响。开放符号为未转染细胞，封闭符号转染Drp1达24小时。（G）中随时间变化的FRAP曲线是30个观测值的平均值，代表重复实验。误差条表示SEM。（H）流动部分的汇总数据显示于n个 = 30个细胞，代表重复实验。总体而言，各治疗组之间的差异显著(P（P）<0.0001（ANOVA）和学生-Newman Kuells’事后的，事后的测试用于比较有和无Drp1表达的每一行*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001. （一） 对来自对照shRNA或PINK1 shRNA细胞系重复实验的60个细胞进行线粒体形态计数，如图2所示。以形态学和细胞系/治疗为因素，通过双向方差分析分析差异P（P）每个图的上方都给出了单元组的值。（J） 用Drp1转染M17或稳定的PINK1 WT细胞。生成了FRAP曲线（未显示数据），并导出了流动分数。（J） 治疗之间的差异总体上是显著的(P（P）方差分析结果<0.0001，n个 = 30个牢房）和纽曼·库尔斯学生事后的，事后的使用测试来比较有Drp1表达和没有Drp1表达的每个品系*P（P）<0.05; **P（P）<0.01; ***P（P）<0.001. 数据代表重复的独立实验。（K） 对来自对照或PINK1过表达细胞系的重复实验的60个细胞进行线粒体形态计数。以形态学和细胞系/治疗为因素，通过双向方差分析分析差异P（P）每个图的上方都给出了单元组的值。
图7
图7。PINK1缺陷细胞中Drp1的去磷酸化和GTPase活性增加。
（A） 对照shRNA系或两个PINK1 shRNA系中的任何一个的裂解液通过磷酸富集与总裂解液进行比较来分离，并对印迹左侧所示的蛋白质进行印迹。Drp1在富磷组分和总组分中均存在，但在PINK1缺陷细胞中发现较少的磷酸化Drp1。我们使用磷酸-Drp1来确认磷酸纯化是有效的，DJ-1作为阴性对照。（B） 将Drp1量化为富磷组分和总组分的比率，表明磷酸-Drp1减少了约30%(n个 = 3） 这两个shRNA序列（*，P（P）方差分析结果<0.05）。（C） 在对照和PINK1 shRNA细胞系中，内源性Drp1向线粒体部分（mito）的募集类似（总数：全细胞裂解物，cyt：细胞溶质部分）。数据是重复实验的代表，印迹右侧的分子量标记以千道尔顿为单位。（D） 与对照系相比，Drp1的齐聚状态不受PINK1 shRNA的影响。裂解产物与BMH交联或未经处理以显示Drp1的等效负载。箭头表示Drp1低聚物，箭头表示单体Drp1。分子量标记以千道尔顿为单位。（E） 对从对照或PINK1 shRNA细胞系中免疫纯化的Drp1的GTPase活性进行跟踪，并以GTP转化为GDP的百分比表示。线条之间的差异非常显著(P（P）双向方差分析结果<0.01）。每个点是3个重复的平均值，代表两个独立的实验。
图8
图8。钙调神经磷酸酶介导的Drp1去磷酸化有助于与PINK1丢失相关的线粒体表型。
（A） 在对照组和PINK1 shRNA株提取物的核后上清液中测定钙调神经磷酸酶活性。重组钙调神经磷酸酶（CaN）作为阳性对照。活性表示为钙调磷酸酶底物肽中Pi的释放，根据EDTA螯合钙（***，P（P）<0.001.）（B）如图6B所示，用二甲基亚砜作为载体或1µM FK506处理PINK1 shRNA细胞株的细胞提取物1小时，并测量磷酸化部分中Drp1的富集。量化(n个 = 6） 证实与对照组相比，PINK1 shRNA细胞中磷酸化-Drp1的相对量较低，并且与DMSO处理的PINK1-shRNA细胞相比，FK506处理的PINH1 shRNA细胞显著增加（*，P（P）方差分析结果<0.05）。所有其他比较均不显著(P（P）>0.05). （C） 通过mito-YFP表达评估对照shRNA和PINK1 shRNA细胞的线粒体形态。仅用载体或1µM FK506处理细胞1小时或3小时。增加FK505处理的长度可以改善线粒体连接，尤其是在PINK1 shRNA系中。比例尺为2µm，适用于所有面板。（D） 根据未经处理或使用1µM FK506处理1小时或3小时后的FRAP曲线估算流动分数值。每个盒子是来自重复实验的细胞的60个测量值的平均值。*，P（P）<0.05; **,P（P）<0.01, ***,P（P）<0.001，使用Student-Newman Kuells的单向方差分析事后的，事后的测试。为了清楚起见，无显著差异(P（P）>0.05）未注明。（E） 对n进行线粒体形态计数，如图2所示 = FK506处理1或3小时后，在对照shRNA或PINK1 shRNA细胞系中重复实验的60个细胞。以形态学和细胞系/治疗为因素，通过双向方差分析分析差异P（P）每个图的上方都给出了单元组的值。（F） 使用TMRM染色和FACS分析评估PINK1敲除细胞中的线粒体膜电位，使用1µM FK506处理1或3小时，也可以不使用。有一个显著的（*，P（P）<0.05; ***,P（P）<0.001,n个 = 用Student-Newman Kuells’进行单向方差分析，在基础条件下或处理1小时后，各品系之间的差异事后的，事后的测试，尽管这在3小时时不显著（ns）。
图9
图9。提出PINK1缺失导致线粒体形态改变的机制。
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