谷胱甘肽增加S公司-转移酶活性对多巴胺能神经元损伤的修复作用果蝇属帕金森病模型

摘要

帕金森病（PD）是一种常见的神经退行性疾病，其特征是黑质多巴胺能（DA）神经元的丧失和被称为路易体的蛋白质性神经内包涵体的积累。帕金森病神经退行性变的机制在很大程度上是未知的，尽管先前的研究表明线粒体复合体I功能障碍、氧化应激和异常蛋白水解降解可能是发病机制的原因(1). 最近对罕见遗传型帕金森综合征相关基因的鉴定为建立可能与散发型帕金森病相关的神经退行性机制提供了机会。

功能丧失突变停车场是常染色体隐性遗传青少年帕金森综合征（ARJP）的常见病因，帕金森功能障碍也可能导致迟发性散发性PD(2–6). 患有以下疾病的患者停车场突变表现出特发性帕金森病的许多典型特征，包括运动功能障碍、线粒体复合体I活性降低和黑质DA神经元变性。然而，大多数ARJP病例发病年龄明显提前，缺乏路易体病理学。Parkin被证明具有泛素蛋白连接酶活性(7–9)，在泛素/蛋白酶体蛋白降解途径中赋予底物靶向特异性。这一发现导致了帕金底物的毒性积累可能是DA神经元死亡的原因。已经确定了许多帕金的假定底物(10). 其中一些parkin底物，包括路易体成分α-突触核蛋白(11)和假定的G蛋白偶联受体Pael-R(12)，受到了相当大的关注，部分原因是它们牵涉到特定的细胞途径停车场-介导的发病机制。然而，许多已确定的帕金底物参与ARJP的病因学仍存在争议。

为了确定与帕金发病相关的途径，我们正在使用遗传学方法研究果蝇属正交的停车场基因。尽管果蝇属大脑不同于脊椎动物的大脑，苍蝇和人类的神经系统发育和功能的许多特征都是保守的，这种保守使得果蝇属一个优秀的神经退化模型系统(13). 在之前的工作中，我们表明果蝇皮功能导致肌肉退化和精子细胞形成的晚期发育缺陷(14). 线粒体病理学是与肌肉变性和精子细胞缺陷相关的最早可检测的表型果蝇皮突变体，表明parkin是线粒体完整性所必需的。

在这项研究中，我们检测了果蝇皮突变体。我们证明了这一点停车场需要细胞自主地防止大脑中DA神经元亚群的退化。神经退行性表型停车场突变体被功能丧失的等位基因增强谷胱甘肽S-转移酶S1(GstS1公司)在一个修饰因子筛选中鉴定的基因帕金部分致死表型(15). 此外，我们证明了GstS1公司预防DA神经元变性停车场突变体。这些观察表明，已知的多种化合物可诱导谷胱甘肽S公司-哺乳动物中转移酶的表达可能为帕金森病提供一种有前景的治疗策略。

方法

苍蝇应变。这个公园²⁵等位基因缺失公园^Z472号等位基因，等基因控制公园^rvA公司和上游激活序列（UAS）-公园^{指挥与控制}参考文献中描述了转基因。14. The公园^Z3678号低形态，不能补充其他停车场等位基因具有非编码点突变。酪氨酸羟化酶（TH）-GAL4驱动器是S.Birman（法国马赛马赛发展生物学研究所）赠送的礼物(16).GstS1公司^K9303公司，GstS1^K8805公司，GstS1⁴²²⁷、和GstS1公司^EP2223型、24B-GAL4和Df（2R）ED1是从布鲁明顿库存中心（印第安纳州布鲁明顿）获得的。GstS1公司^M26型通过切除GstS1公司^EP1227型（H.B.，未发布数据）。无人机-GstS1公司是通过克隆构建的GstS1型cDNA LD21131（伯克利果蝇属基因组项目，加州伯克利）转化为转化载体pUASP。使用标准程序生成生殖系转化子。果蝇属培养物保存在标准条件下，所有实验均在25°C下饲养的苍蝇上进行。

蛋白质羰基和谷胱甘肽含量分析。使用既定程序计算蛋白质羰基含量(17). 根据制造商的说明，使用谷胱甘肽检测试剂盒（Chemicon）检测谷胱甘苷水平。

DA和血清素能神经元的分析。分析DA和5-羟色胺能神经元就地分别使用抗TH抗血清Ab152（1:100，Chemicon）和抗性欲抗血清（1:100（Immunostar，Hudson，WI）。在冷PBS中解剖成人头部，将分离的大脑固定在4%多聚甲醛/PBS中30分钟。样品在PBS/0.1%Triton X-100中清洗，并在0.1 M Tris·Cl中封闭1小时，pH 7.5/0.15 M NaCl/0.1%Triton X-100/10%热灭活FBS中。抗-TH在4°C的封闭溶液中培养过夜。在清洗和孵育荧光次级抗血清后，再次清洗样品，并使用ProLong防褪色介质（分子探针）将其安装在两个玻璃盖玻片之间。这种样本安装方法允许可视化幻灯片两侧的样本，以优化所有DA神经元簇的检测。共焦显微镜用于收集间隔1μm的光学切片。通过对单个共焦Z序列图像的目视检查，确定每个主要DA神经元簇内TH阳性神经元的数量。此外，成年苍蝇的大脑将TH-GAL4公司驾驶员和UAS-GFP公司如上所述，对转基因进行解剖和固定。通过共焦显微镜检测内源性GFP荧光来鉴定DA神经元，并如上所述测定GFP阳性神经元的数量。在所有研究中，研究人员对DA神经元进行了计数，但不考虑基因型。在三名不同研究人员（A.J.W.、D.A.T.和P.D.W.）在不同机构进行的完全独立的实验中观察到相同的神经元表型。

行为。按照参考文献所述进行爬升试验。14.在24B-GAL4和两条染色体之间生成了重组染色体停车场低形态突变，公园^Z472号和公园^Z3678号。这些重组体分别在有无UAS的情况下进行了测试-GstS1公司转基因。

结果

在之前的研究中，我们分析了DA神经元在停车场通过评估石蜡包埋头部切片中DA神经元特异性标记TH阳性神经元的数量，将突变体与对照组进行比较(14). 虽然没有检测到神经元丢失，但样本分析中的大量差异可能掩盖了DA神经元的细微丢失。因此，我们用共焦显微镜对TH抗血清染色的成人全脑进行了重复分析(图1). 这种方法使我们能够可视化成人的单个DA神经元果蝇属以高分辨率识别大脑，并可重复识别所有先前报道的DA神经元(18)，从而为脑内DA神经元的定量分析提供了一种灵敏的方法停车场突变体。

在单独的窗口中打开

图1。

DA神经元的一个子集在停车场突变体。(A类)图中显示了成人主要DA神经元簇的位置果蝇属大脑。PAL，前脑前外侧；前脑后内侧；VUM，腹侧不成对内侧。PAL簇位于相同位置，但位于PPL1簇的前面，如箭头所示。(B类)用抗TH染色的WT成人大脑的投影Z系列共焦图像标记DA神经元。盒状断面内的DA神经元在高倍镜下显示C类和D类(C类和D类)来自WT的代表性图像(C类)和停车场突变体(D类)大脑老化20天。在PPL1簇中检测到较少的DA神经元停车场与WT相关的突变体(E类和F类)WT中每个主要DA神经元簇中DA神经元的数量（黑条）和停车场1日龄突变体（灰条）(E类)和20日龄(F类)成虫苍蝇。停车场突变体在1日龄时PPL1神经元数量显著减少(*，P（P）< 0.05). 神经元缺失停车场20日龄时，PPL1簇中的突变体更为广泛(***，P（P）< 0.0001). 使用Student’st吨测试。n指用于神经元计数的大脑数量。动物纯合子停车场无效等位基因公园²⁵或携带同基因公园^rvA公司具有WT等位基因的染色体停车场，用于这些分析。

使用此方法，我们比较了帕金突变体和等基因对照动物。重要的是，为了控制研究者的偏见，在整个分析过程中，所有实验都是在实验者对样本基因型一无所知的情况下进行的。与之前的工作一致(14，19)，在成人的皮层或神经膜区域没有观察到明显的解剖缺陷果蝇属TUNEL染色实验并没有发现停车场突变体和对照（数据未显示），表明绝大多数神经元在帕金突变体。此外，未观察到DA神经元之间的显著差异停车场突变体和对照动物(图1). 然而，对1日龄的不同DA神经元簇进行量化停车场与年龄匹配的对照组相比，其中一个簇中DA神经元的数量显著减少，即原大脑后外侧（PPL）1(图1). 20天内停车场成年后，TH阳性PPL1神经元数量进一步减少(图1). 同样，在20日龄的其他DA神经元簇中也未检测到显著差异停车场突变体。相比之下，在蛹晚期PPL1簇中TH阳性神经元的数量在以下两组之间无法区分，蛹晚期已完全形成成年中枢神经系统停车场突变体和对照（数据未显示）。这些数据表明果蝇属结果成人脑PPL1簇DA神经元进行性变性。

还进行了其他实验，以进一步表征停车场突变体。为了证实TH阳性神经元的丢失停车场突变体不是抗TH免疫染色的伪影，我们使用另一种方法检测DA神经元。DA神经元特异性驱动因素TH-GAL4公司用于驱动GFP在停车场突变体和GFP荧光被用作DA神经元的标记。尽管该GAL4驱动因子并没有在PPL1簇中的所有TH阳性神经元中表达GFP（参考文献。16和图2)，使用该驱动器的实验表明，20日龄PPL1簇中DA神经元的数量显著减少停车场相对于年龄匹配的对照动物的突变体(图2). 为了验证PPL1神经元的损失源于parkin功能的损失TH-GAL4公司driver被用来诱导停车场转基因(UAS园区)努力挽救观察到的退化。该分析结果表明停车场在DA神经元中，PPL1簇中的DA神经元损失显著减弱(图2). 这些结果证实了停车场突变体，并证明帕金是DA神经元完整性所需的细胞自主性。转基因表达的多巴胺神经元损伤的不完全修复停车场可能反映了TH-GAL4公司驱动部分PPL1神经元，转基因表达效率低下停车场和/或parkin在DA神经元完整性中的额外非自主作用。

在单独的窗口中打开

图2。

神经元缺失停车场突变体是DA神经元的特异性突变体，主要是由于DA神经元失去了对细胞的自主需求停车场.(A类–C类)TH-GAL4驱动GFP表达(A类)和抗TH(B类)染色显示信号高度共定位(C类). 中的装箱区域C类标记PPL1簇并在中放大C类′.(D类)20日龄成人GFP阳性神经元的分析停车场携带TH-GAL4驱动因子和UAS-GFP转基因的突变体和年龄匹配的WT对照证实了PPL1-DA神经元簇中的细胞丢失停车场突变体(**，P（P）<0.005，学生的t吨测试）。(E类)通过表达停车场使用TH-GAL4驱动程序的转基因与帕金突变体或帕金仅携带TH-GAL4驱动器的突变体。TH-GAL4驱动因子中GAL4的表达对DA神经元的活性没有显著影响。(**，P（P）< 0.001; Δ,P（P）= 0.3) (F类)图中显示了成人大脑中所有主要的5-羟色胺能神经元。SP，食管下；LP，侧前脑；IP，大脑下内侧。(G公司)用抗5-羟基酪氨酸染色的WT成人大脑的典型共焦显微照片显示了5-羟色胺能神经元。(H（H）)20天大的成人血清能神经元的数量没有显著差异停车场与年龄匹配的对照组相关的突变体，表明神经元丢失是DA神经元的一个子集所特有的。使用ANOVA和Bonferroni的事后检验来计算计划比较的统计显著性。直方图中显示的数字是指用于神经元计数的大脑数量。公园²⁵或公园^rvA公司纯合子用于所有神经元活性分析。

PD的神经变性主要局限于大脑中DA神经元的一个子集。评估神经元丢失的特异性果蝇皮突变体，评估其他儿茶酚胺能神经元的完整性。具体来说，使用抗5-羟色胺（5-羟基酪氨酸）的抗血清来分析20天大的五羟色胺能神经元停车场突变体和年龄匹配的等基因对照(20). 与我们对DA神经元的分析相比，在所有的5-羟色胺能簇中均未观察到明显的神经元丢失停车场突变体(图2). 这些结果，加上我们之前的工作以及观察到的大脑总体积在停车场突变体表明停车场突变体对中枢神经系统中DA神经元的子集具有选择性。

为了确定影响果蝇皮表型，我们对a停车场部分蛹致死表型，似乎是肌肉功能障碍所致(15). 一个失去功能的等位基因GstS1公司是从该屏幕中恢复的最强增强剂。为了进一步评估GstS1公司在里面帕金发病机制，我们探讨了GstS1公司其他功能停车场表型。在之前的工作中，我们表明正常的地缘攀爬行为需要肌肉组织的驻车功能。因此，我们测试了GstS1公司突变影响停车场突变体。所有GstS1公司测试的等位基因，包括我们的基因筛查中没有使用的几个，也被发现增加了停车场杂合子具有WT等位基因的突变体GstS1公司(图3). 相比之下，GstS1公司在WT背景下，仅突变对攀爬能力没有影响停车场或在中停车场杂合子(图3和数据未显示）。此外，UAS的过度表达-GstS1公司肌肉组织中的转基因，使用中胚层GAL4驱动程序，24B-镀锌4，足以恢复两个低形态的攀爬能力停车场WT突变体(图3). 考虑到在停车场本试验中使用了空突变体、低形态突变体来加强对攀爬能力微小差异的检测。

在单独的窗口中打开

图3。

GstS1活性改变停车场突变体。(A类)功能丧失等位基因GstS1公司加强攀爬缺陷帕金突变体。每次功能丧失GstS1公司等位基因，EP2223型，k09303型，k08805型、和04227该分析中使用的是杂合子，WT等位基因为GstS1型.公园²⁵或公园^rvA公司纯合子用于所有攀爬试验。增强停车场攀爬缺陷GstS1公司等位基因显著(P（P）<0.005，学生的t吨测试）。(B类)肌肉GAL4转基因（24B）直接表达GstS1转基因（UAS-GstS1）可缓解两组患者的部分攀爬缺陷停车场低形态突变体(公园^Z472号和公园^Z3678号). 抑制GstS1过度表达引起的上升缺陷是显著的(**，P（P）<0.001）由学生t吨测试。

将这些发现扩展到神经退行性表型停车场突变体，我们分析了改变GstS1公司多巴胺神经元完整性活动停车场突变体。虽然GstS1主要在飞行肌肉中表达，但在成人头部也检测到GstS1的表达(21). 探讨降低GstS1剂量对停车场DA神经元丢失表型，停车场突变体被杂交到带有GstS1指定的活性空等位基因的砧木上GstS1公司^M26型.停车场携带GstS1型^M26型反式突变到删除GstS1公司基因[Df（2R）ED1]以低频率恢复，显示寿命显著缩短（数据未显示）。1日龄DA神经元完整性分析帕金携带这种组合的突变体GstS1公司等位基因显示DA神经元丢失与停车场仅突变体(图4). 损失GstS1公司仅功能对1日龄成人DA神经元活性没有影响(图4). 相反，转基因过度表达GstS1公司仅在DA神经元中，使用TH-GAL4公司驱动程序与无人机-GstS1转基因能够显著减弱20日龄DA神经元的丢失停车场突变体(图4). 此外GstS1公司表达与转基因观察结果相当停车场表达式(图4). 这些结果表明GstS1公司有效调节DA神经元活性停车场突变体。

在单独的窗口中打开

图4。

GstS1活性影响DA神经元活性停车场突变体。(A类)A类GstS1公司无效等位基因(GstS1公司^平方米26)转为删除（Df）GstS1公司地区[Df（2R）ED1]增强1日龄PPL1簇中检测到的DA神经元丢失停车场突变体。GstS1公司无效突变体(GstS1公司^M26型/英国国防部)在WT中单独显示DA神经元没有丢失停车场背景。(B类)转基因过表达GstS1可显著抑制20日龄DA神经元的丢失停车场突变体（公园²⁵，TH-G4；UAS-GstS1）。GstS1的拯救程度与转基因表达停车场DA神经元（公园²⁵，TH-G4；UAS园区）。使用ANOVA和Bonferroni的事后检验来计算计划比较的统计显著性。(*，P（P）<0.05;**，P（P）< 0.001; Δ,P（P）= 0.3). 条形图中显示的数字是指为神经元计数而分析的大脑数量。公园²⁵或公园^rvA公司纯合子用于所有神经元活性分析。

谷胱甘肽S公司-转移酶催化还原型谷胱甘肽与多种底物的结合，包括活性氧的产物(22)大量证据表明，氧化应激是散发性PD的主要促发因素(23). 我们的结果证明GstS1公司修改停车场功能丧失表型表明，parkin可能起到限制氧化应激诱导的细胞损伤的作用。为了开始研究这个假设，我们测试了停车场突变体显示出氧化应激的其他证据。氧化应激的一个后果是蛋白质羰基的产生。对蛋白质羰基含量水平的检查显示，1日龄成年人的蛋白质羰基含量水平显著升高停车场与年龄匹配的等基因对照（每毫克蛋白质2.6 nmol羰基）相比的突变（每毫克蛋白10.4 nmol羰基）。这些结果表明，派金可以保护机体免受活性氧的损伤。然而，我们没有发现1日龄儿童谷胱甘肽水平的显著变化停车场突变体，表明氧化损伤帕金突变不仅仅是谷胱甘肽水平下降的结果。

讨论

大量证据表明，氧化应激导致散发性帕金森病DA神经元丢失(24). 特别是，在PD患者的黑质中，脂质过氧化水平增加，氧化损伤蛋白质和DNA，谷胱甘肽水平降低(23). 这种氧化应激的一个潜在来源是线粒体复合物I的部分抑制导致自由基形成增加。许多帕金森病患者的大脑和外周组织中的复合物I活性降低，一些复合物I抑制剂在人类和动物模型中导致类帕金森病综合征(25). 我们的研究果蝇皮突变体显示出许多与散发性PD相似的特征。我们以前曾报道过果蝇皮导致多种组织类型的线粒体严重缺陷。在本报告中，我们展示了这种飞行停车场突变体还显示DA神经元亚群的进行性退化，这种退化可以通过谷胱甘肽的过度表达来挽救S公司-转移酶，一种与细胞对氧化应激反应有关的因子(26). 这些观察表明停车场突变体重述了ARJP的关键特征，并表明ARJP中DA神经元丢失的机制与散发性PD的机制相似。

关于神经完整性的三个先前分析果蝇皮突变体，包括我们实验室的一项研究，未能检测到DA神经元的缺失(14，19，27). 然而，在停车场其中两项研究没有分析突变株（PPL1）(19，27). 虽然PPL1神经元簇在我们之前的研究中进行了评估果蝇皮突变体，本研究中观察到的DA神经元数量的实质性变化不允许检测到我们当前研究中报告的DA神经元减少。本研究的一个主要动机是应用无偏见的定量方法来分析成人所有DA神经元簇果蝇属大脑努力检测神经元结构和完整性的细微变化。这里描述的结果表明，共焦显微镜是一种强有力的方法，有助于检测果蝇属.

了解基因突变停车场导致DA神经元在人类疾病中死亡的结果是，人们投入了大量精力来确定parkin泛素蛋白连接酶活性的靶点。已确定了许多停车场基底(10). 其中两种底物，α-突触核蛋白和Pael-R，受到了相当大的关注，部分原因是在体外研究表明，这些成分在过表达时具有细胞毒性，并且这两种蛋白质似乎都在ARJP个体的大脑中积累(11，12). 此外，parkin的过度表达已被证明可以减弱这些蛋白质的毒性在体外和体内(11，12，27–31). 这些发现导致了一个模型，即这些蛋白质的积累导致ARJP个体DA神经元死亡。虽然之前确定的大多数停车场基质似乎都有果蝇属正交曲线，爆炸搜索果蝇属基因组序列未能检测到α的同源基因-同核蛋白或儿科-R因此，我们的结果显示DA神经元在果蝇皮突变体表明α-突触核蛋白和Pael-R在DA神经变性中不是专性的。虽然我们的工作挑战了ARJP病因学中α-突触核蛋白和Pael-R的绝对需求，但这些因素可能会导致ARJP患者细胞丢失的严重程度和/或程度。然而，在缺乏α-突触核蛋白和Pael-R的情况下DA神经元变性的事实表明，其他因素明显参与了ARJP的发病机制。这些因素的识别对我们理解这种疾病的分子病因至关重要。

中GstS1函数的先前工作果蝇属提示该因子可能在氧化损伤产物的解毒中发挥作用(26). 我们的发现改变了GstS1公司活动影响停车场突变表型增加了parkin也可能提供保护免受氧化应激影响的可能性。这一假说的进一步支持来自以下发现：苍蝇、小鼠和细胞系的氧化损伤以及苍蝇和细胞系对氧化应激剂的敏感性与帕金活性呈负相关(19，32–34). 我们最近的转录谱分析结果停车场突变体和基因筛查停车场修饰物还表明氧化应激反应元件上调，氧化应激反应成分的突变增强了停车场突变表型(15).

帕金可能通过多种方式保护机体免受氧化应激的影响。例如，帕金可以识别带有特定氧化修饰的底物，并以这些受损蛋白质为降解目标。HOIL-1泛素蛋白连接酶是一种结构域与parkin相似的蛋白质，最近发现它能识别并泛素化其底物IRP2的氧化修饰形式，这一发现支持了这一模型(35). 另外，帕金功能改变导致细胞系、苍蝇、小鼠和人类的线粒体缺陷的发现增加了帕金可能直接影响线粒体完整性的可能性(14，32，36，37). 对酵母的研究已经确定了一种参与线粒体分裂的泛素连接酶(38)泛素化对蛋白质插入线粒体外膜也很重要(39，40). 一个有趣的可能性是，帕金可能会标记氧化损伤的线粒体蛋白，并以整个线粒体为目标，通过自噬进行破坏。的确，线粒体的超微结构形态停车场突变苍蝇与自噬过程中被吞噬的线粒体的外观惊人地相似(41). 此外，先前的研究表明，线粒体蛋白的泛素化和其他泛素样缀合物的形成可以靶向线粒体进行自噬降解(42，43).

我们的发现为ARJP和可能的散发性PD提供了一种潜在的治疗方法。已知有许多化合物可诱导谷胱甘肽S公司-脊椎动物的转移酶活性(44). 虽然研究这些化合物主要是因为它们对癌症的保护作用，但我们目前的结果表明，这些化合物可能在ARJP的治疗中有用。有几个理由相信，这种潜在的治疗策略可以扩展到ARJP以外。首先，如上所述，大量证据表明氧化应激与散发性PD的病因有关(24). 此外Gstω-1已发现基因会影响人类帕金森病的发病年龄(45)和酵母功能丧失突变GstS1公司同源，全球技术法规1，增强α-突触核蛋白在该生物体中的毒性(46). 由于增加α-突触核蛋白表达的突变导致帕金森病的遗传形式，而α-突触核蛋白是与散发性帕金森病相关的路易体内含物的组成部分，这一发现减少了全球技术法规1酵母活性增强α-突触核蛋白毒性表明谷胱甘肽的改变S公司-转移酶活性可能与散发性PD发病有关。目前存在许多优秀的α-同核蛋白病模型(46–49)可以用来检验这个假设。

总之，我们发现DA神经元的缺失发生在果蝇皮突变体和多巴胺神经元的丢失可以被假定的氧化损伤解毒因子所修饰，这表明多巴胺神经元死亡的机制果蝇皮突变体和散发性PD是保守的。此外，观察到一个修饰物的活性降低和表型上升果蝇皮突变体还可以改变DA神经元的丢失表型，这表明在肌肉和神经元表型的病因方面存在潜在的相似性果蝇皮突变体。易于检测的修饰符果蝇皮生存能力和行为表型以及我们目前对其中一个因素与DA神经元完整性相关性的研究表明，该系统具有识别与理解PD发病机制和治疗相关的遗传途径和治疗因素的潜力。

致谢

笔记

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：PD、帕金森病；DA，多巴胺能；GstS1，谷胱甘肽S公司-转移酶S1；ARJP，常染色体隐性遗传青少年帕金森综合征；TH，酪氨酸羟化酶；PPL，前脑后外侧；UAS，上游激活序列。

工具书类