Ann Neurol公司。作者手稿；PMC 2009年11月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：PMC2613566型
美国国立卫生研究院：NIHMS68492标准
帕金突变成纤维细胞线粒体功能和形态受损
，博士，1 ，博士，2 ，博士，三 ，医学博士，1 ，博士，4 ，博士，5 ，博士，4 ，博士，三 ，博士，6 ，博士，2和医学博士1
希瑟·莫蒂波伊斯
1英国谢菲尔德大学医学院学术神经科
凯利·让·托马斯
2美国国立卫生研究院国家老龄研究所神经遗传学实验室
沃纳·J·H·科普曼
三荷兰奈梅根奈梅根医学中心Radboud大学生物化学系奈梅根分子生命科学中心
斯蒂芬妮·克拉夫克
1英国谢菲尔德大学医学院学术神经科
帕特里克·阿布·苏莱曼
4英国伦敦皇后广场神经病学研究所
尼古拉斯·W·伍德
4英国伦敦皇后广场神经病学研究所
Peter H.G.M.Willems（彼得·威廉姆斯）
三荷兰奈梅根奈梅根医学中心Radboud大学生物化学系奈梅根分子生命科学中心
Jan A.M.Smeitink公司
6荷兰奈梅亨Radboud大学儿科奈梅亨·线粒体疾病中心。
马克·库克森
2美国国立卫生研究院国家老龄研究所神经遗传学实验室
1英国谢菲尔德大学医学院学术神经科
2美国国立卫生研究院国家老龄研究所神经遗传学实验室
三荷兰奈梅根奈梅根医学中心Radboud大学生物化学系奈梅根分子生命科学中心
4英国伦敦皇后广场神经病学研究所
5英国谢菲尔德儿童医院
6荷兰奈梅亨Radboud大学儿科奈梅亨·线粒体疾病中心。
- 补充资料
1
GUID:79DD1F9D-02D2-4E7B-80CC-C65981AFB187
摘要
目标
有明显的线粒体异常停车场-淘汰果蝇和其他模型系统。我们研究的目的是确定停车场-突变患者。我们还研究了线粒体功能受损的药物治疗在帕金-变异的人体组织。
方法
我们使用了三套技术，即线粒体功能的生化测量、定量形态学和功能连接的活细胞成像，来评估线粒体呼吸链，纯合或复合杂合患者成纤维细胞线粒体的外形和连接性及其功能性内部连接性停车场突变。
结果
帕金-突变体细胞线粒体复合物I活性较低，与线粒体分支程度较高相关的复合物I连接ATP产生，提示帕金的功能和形态效应相关。击倒停车场对照组成纤维细胞证实帕金缺乏足以解释这些线粒体效应。相比之下，50%的停车场模拟人类患者组织中的单倍体不足，并没有导致线粒体功能或形态受损。光漂白后荧光恢复（FRAP）分析表明线粒体基质的功能连接水平较低，鱼藤酮暴露后进一步恶化。用实验性神经保护化合物治疗导致线粒体膜电位的恢复。
解释
我们的研究表明，帕金森病突变患者的线粒体功能和形态出现显著异常，并为这种新模型系统作为筛查基因同源性帕金森病疾病中疾病修饰化合物的工具的潜在有用性提供了主要数据证据。
帕金森病（PD）的主要组织病理学特征是黑质多巴胺能神经元的丢失，但越来越多的证据表明PD患者中枢神经系统内外广泛存在生化和形态学异常。1遗传因素和外源毒素都参与了PD的发病机制。2PARK2基因的常染色体隐性遗传、纯合或复合杂合突变停车场是早发性帕金森综合征最常见的可识别遗传原因。三对于单个杂合子是否为停车场突变可能导致对PD的敏感性增加。4-6最近，越来越多的证据表明，不同模型系统的帕金缺乏症线粒体功能和形态受损。7
我们研究的目的是描述人体组织中线粒体呼吸链的功能和形态，以进一步研究线粒体异常是否也存在于停车场-突变患者。我们使用了三套技术，即线粒体功能的生化测量、线粒体连接的定量形态学和活细胞成像，来证明停车场突变患者细胞存在严重的线粒体功能缺陷，对复合物I抑制剂鱼藤酮的敏感性增加。定量形态学和使用光漂白后荧光恢复（FRAP）分析的活细胞成像相结合，使我们能够评估线粒体的外部形状和线粒体基质的功能连接程度。
同时，我们进行了siRNA敲除研究，以确认这些影响是由于帕金缺乏本身而非次要机制造成的。这包括部分siRNA敲除，内源性parkin水平降低至50%，以更好地了解停车场人类疾病中的单倍体不足。
我们最终用实验性神经保护剂进行了救援实验，以确定停车场-突变成纤维细胞可能是筛选PD中疾病修饰化合物的有用的新工具。
方法
对5例纯合子或复合杂合子突变的患者进行了皮肤活检帕金基因遵循常规临床程序。使用直接DNA测序和MPLA进行基因分型帕金基因剂量试剂盒（P051和P052B，MRC Holland），涵盖停车场基因以及其他已知的孟德尔PD基因；使用的协议符合制造商的说明。对照组成纤维细胞取自6名健康对照组（Corriell Cell Repositories）。对照组和患者组（对照组37±5.2岁，停车场患者42±5.8岁，平均+/-标准差）。
使用对照的所有生化测量，停车场突变和siRNA介导停车场在3个单独的样本上进行敲除成纤维细胞。每天对每个细胞系25个细胞进行形态学评估，然后分别进行3次。
成纤维细胞培养
原代成纤维细胞在含有10%FBS、100 IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1 mM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM氨基酸、50μg/ml尿苷和1 X MEM维生素的最低必需培养基中连续培养。除非另有说明，否则该含葡萄糖培养基用于所有测量（生化和形态学）。
线粒体膜电位的测量
成纤维细胞在96孔板中以40%的汇合度进行电镀，24小时后将细胞转化为如上所述的半乳糖培养基。8如前所述，再过24小时，使用荧光染料四甲基罗丹明甲酯（TMRM）测量线粒体膜电位。9为了消除质膜对TMRM荧光的贡献，每项检测都与上述10μM羰基氰化物3-氯苯肼（CCCP）平行进行，CCCP会破坏线粒体膜电位。所有数据均表示为总TMRM荧光减去CCCP处理的TMRM荧光。冷冻解冻后，用乙炔同二聚体荧光染料在平行板上测量细胞数量。
线粒体呼吸链功能评估
如前所述，对富含线粒体的成纤维细胞部分进行线粒体呼吸链复合物I、II、III和IV的测量。10每个复合物的比活性归一化为柠檬酸合成酶的比活性。11
ATP生产
根据制造商的说明，使用ATPlite试剂盒（Perkin Elmer）测量细胞ATP水平。如其他地方所述，对经洋地黄素处理的成纤维细胞进行ATP生成分析。12细胞ATP水平测量细胞ATP总量，而ATP生成分析测量呼吸链在线粒体内生成ATP的能力。
线粒体形态学评估
成纤维细胞用荧光染料罗丹明123染色，如前所述进行镀膜和成像。13对原始图像进行二值化，并对线粒体形态特征进行量化。这些是长度或长宽比（AR，相当于线粒体的椭圆长轴和短轴之间的比率）、分支程度或形状因子（FF，定义为（Pm2)/（4πAm），其中Pm是线粒体轮廓的长度，Am是线粒体的面积），以及每个细胞的线粒体数量（Nc）。
siRNA介导的parkin基因敲除
siRNA寡核苷酸靶向的碱基对为1102-1123帕金基因（序列义链5′-3′TGTAAAGAAGCGTACATtt）。10nM siRNA(停车场根据制造商的说明，使用0.5mM脂质体2000将靶向或干扰阴性或GAPDH阳性（Ambion）转染到对照原代成纤维细胞。通过流式细胞术检测打乱（荧光标记）siRNA转染细胞的转染效率。
毒素暴露
在线粒体膜测量或线粒体形态分析之前，细胞暴露于100nM鱼藤酮（Sigma）72小时。
光漂白后的荧光恢复
如前所述，进行光漂白后的荧光恢复（FRAP）。14简单地说，用0.5μg线粒体基质定位YFP瞬时转染细胞。在光漂白前后用4次514-nm激光迭代至100%功率，对直径为2.5μm的圆形感兴趣区域（ROI）进行成像。
以0.25秒的间隔进行扫描，共获得40张图像，并使用LSM 510软件（蔡司显微成像）对成像ROI中的荧光强度进行数字化。每个FRAP曲线代表2-3个单独场合获得的≥30个测量值的平均值。流动分数计算如下：流动分数=[（FRAPt吨-背景）/FRAP我][（NSPB）我-背景）/NSPBt吨].
蛋白质印迹
如前所述，使用Bradford方法溶解细胞颗粒并测量蛋白质量。15使用单克隆小鼠抗帕金一级抗体（细胞信号转导）、单克隆小鼠肌动蛋白一级抗体或单克隆小鼠GAPDH一级抗体，在10%SDS-PAGE凝胶上解析蛋白质。使用MultiImage Lite系统（Alpha Innotech）进行密度测定。
药理学救援
使用谷胱甘肽前体物质4-羧酸氧噻唑烷（OTCA）和细胞渗透性谷胱甘酮（谷胱甘苷甲酯，GME）进行救援实验。在0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10和30mM的OTCA治疗24小时后，按照上述方法测量线粒体膜电位的剂量-反应曲线。对于随后的所有实验，在测定线粒体膜电位或测量细胞ATP水平之前，用10μM OTCA或100μM GME处理细胞24小时。
细胞生长和活力测定
使用CytoTox-ONE均质膜完整性检测试剂盒（Promega）评估细胞活力，该试剂盒测量膜受损细胞中乳酸脱氢酶的释放。使用CyQuant NF细胞增殖检测试剂盒（Invitrogen）评估细胞生长，该试剂盒通过荧光染料结合测量细胞DNA含量。这两种分析都是根据制造商的说明进行的。
统计分析
多个实验的值表示为平均值+/-SE（标准误差）。对于正态分布数据，使用Student t检验评估统计显著性（Bonferroni校正），对于偏态分布数据使用非参数t检验。使用双向方差分析测试评估多因素的影响。R（右）2在线性回归分析中用作拟合优度的度量。
结果
成纤维细胞线粒体功能性损伤停车场突变
我们首先研究了5名纯合或复合杂合患者的原代成纤维细胞培养物中的线粒体膜电位停车场突变（参见)和6个年龄匹配的对照，以确定parkin突变患者组织中线粒体呼吸链的总体氧化磷酸化活性。5例患者的线粒体膜电位均较低停车场突变成纤维细胞培养平均30%(; p<0.01）。然而，当培养基改变为包括作为能量来源的半乳糖而不是葡萄糖，从而将其转换为更氧化的状态时，线粒体膜电位甚至平均降低了70%(; p<0.0001）。
对照组和对照组的线粒体呼吸链功能停车场突变体成纤维细胞。（A）当细胞在含有葡萄糖的培养基中生长时，患者组的线粒体膜总电位降低30%，**p<0.01，但当细胞在含半乳糖的培养基生长时，这种降低在患者组更为严重（降低70%，**p<0.0001）。对所有样品的线粒体膜电位进行了3次单独的测量，数据以平均+/-SEM表示。所有随后的生化和形态分析也分别进行了三次，除非另有说明，否则均以平均+/-SEM表示。（B）随后对单个呼吸链复合物的分光光度评估表明，患者组复合物I的活性降低了45%，**p<0.01。（C）相反，患者和对照组的复合物II活性相似，p>0.05。
表1
帕金5例早发性帕金森综合征纯合或复合杂合患者任一等位基因突变的检测停车场突变。有关详细信息，请参阅方法部分。
| 第一次突变 | 第二次突变 |
|---|
| 患者1 | 255del_A het（外显子2） | 第5外显子缺失 |
| 患者2 | 202_203delAG（外显子2） | 202_203delAG（外显子2） |
| 患者3 | 202_203delAGhet（外显子2） | 缺失外显子2 |
| 患者4 | 202_203delAG（外显子2） | 缺失外显子4 |
| 患者5 | 约101-102delAG
p.Gln34ArgfsX38 | c.1289G<安
p.Gly430Asp公司 |
接下来，我们确定观察到的线粒体膜电位下降是否与线粒体呼吸链特定复合体的功能受损有关，还是由于整体功能受损。对富含线粒体的组分中每个单独复合物的活性的分光光度法评估表明，复合物I的活性在停车场突变成纤维细胞与对照组的比较(; p<0.005）。复合物II活性呈现出更高活性的趋势，但这并不显著(; p＞0.05）。复合物III和复合物IV的活性在停车场突变患者和对照组（数据未显示）。
接下来，我们确定观察到的复合物I缺乏是否会导致线粒体ATP生成整体受损，或仅导致复合物I连接ATP生成受损。复合物I在特定底物（谷氨酸和苹果酸）作用后，ATP生成降低（p<0.05；)，但未添加复合物II（琥珀酸盐）(). 较低的复杂I连接ATP生成也导致细胞ATP水平总体下降58%停车场突变成纤维细胞(; p<0.05）。
控制装置和停车场突变体成纤维细胞。（A）患者组复合物I连接的ATP生成减少了48%，*p<0.05。（B）相反，对照组和患者组之间复杂II连接的ATP生成没有显著改变。（C）复合物I相关ATP生成的减少也导致细胞ATP水平整体降低58%，*p<0.05。
线粒体形态在停车场突变成纤维细胞
个人定性评估停车场突变患者的线粒体分支有时明显增加()通过定量形态学分析证实停车场突变患者队列（形状因子，p<0.05，)线粒体长度无显著组间变化（长宽比，p>0.05，). 线粒体的总数在停车场突变体成纤维细胞，但未达到统计学意义（p>0.05，). 较低的复合物I连接的ATP生成与线粒体分支程度的增加相关（形状因子，R2=0.903，p<0.001；)和长度（纵横比R2=0.58，p<0.05，). 此外，线粒体分支程度的增加（形状因子）与较低的复合物I活性（R2=0.632。p<0.01；). 这表明帕金缺乏对线粒体的功能和形态影响是相互关联的。
对照组和对照组的线粒体形态停车场突变体成纤维细胞。（A）对照组和患者成纤维细胞中线粒体的图像，说明患者细胞中线粒体分支的增加。（B）患者组的线粒体分支（形状因子）显著增加，*p<0.05。每天对每个细胞系的25个单个细胞的图像进行评估，并在3个不同的场合进行重复。数据通过SEM和平均值以方框图和晶须图的形式呈现。所有随后的形态分析均以相同的方式进行。（C）相反，对照组和患者组的线粒体长度（长宽比）相似。（D）每个细胞的线粒体数量减少了20%，但没有达到统计学意义，p>0.05。（E+F）在个别患者中，复合物I连接的ATP生成与线粒体分支（形状因子、R2=0.903，p<0.0001）和线粒体长度（长宽比，R2=0.58，p<0.05）。（G）线粒体分支（形状因子）的变化也与复合物I活性相关（R2=0.632，p<0.01）。
帕金siRNA敲除证实帕金缺乏症线粒体呼吸链功能和形态受损
与模拟转染对照组相比，在转染后5天，siRNA处理的对照组成纤维细胞中Parkin蛋白水平降低了80%(). siRNA介导的线粒体膜电位显著降低停车场转染后5天击倒细胞(，p<0.01）。siRNA介导的细胞ATP水平也显著降低停车场转染后5天击倒细胞(，p<0.01）。转染9天后，Parkin蛋白水平、线粒体膜电位和细胞ATP水平恢复到对照水平（数据未显示）。
siRNA介导的停车场对照组成纤维细胞。（A）肌动蛋白和帕金蛋白水平的Western blot。siRNA转染后，Parkin蛋白水平降低了80%。干扰siRNA或GAPDH siRNA转染细胞中的parkin或actin蛋白水平没有变化。（B）通过GAPDH蛋白的蛋白质印迹评估并使用密度计定量的GAPDH效率的siRNA敲除显示GAPDH蛋白水平降低70%。（C）这种siRNA介导的停车场导致线粒体膜电位降低80%，**p<0.01，而scramble或GAPDH siRNA均无影响。（D）细胞ATP水平也降低了42%，**p<0.01，没有干扰或GAPDH siRNA的影响。（D）siRNA中线粒体分支（形状因子，FF）显著增加停车场细胞**p<0.01。相比之下，用打乱siRNA、GAPDH siRNA或parkin siRNA转染的细胞中，线粒体长度（纵横比，AR）和每细胞线粒体数量（Nc）相似。（E）50%的parkin基因敲除不会引起线粒体膜电位的改变。（F）50%帕金基因敲除对每个细胞的长度（长宽比）、分支（形状因子）或线粒体数量也没有影响。
接下来，我们研究了是否在患者的成纤维细胞中观察到线粒体形态的变化停车场突变也存在于停车场击倒成纤维细胞。线粒体分支显著增加70%(，p<0.01）停车场5天时击倒成纤维细胞。相反，线粒体长度和数量在停车场击倒成纤维细胞。干扰siRNA或GAPDH siRNA对任何测量参数均无影响。siRNA介导停车场击倒数据表明停车场这种缺陷足以解释患者成纤维细胞中出现的线粒体缺陷。相比之下，50%的停车场模拟人体患者组织中的单倍体不足，不会导致线粒体跨膜电位受损或线粒体形态改变().
帕金突变的成纤维细胞更容易接触线粒体毒素
帕金-然后将突变成纤维细胞和对照成纤维细胞暴露于线粒体复合物I抑制剂鱼藤酮，以确定内源性帕金是否对鱼藤酮对人体组织线粒体膜电位和线粒体形态的影响具有保护作用。16暴露于鱼藤酮的对照组成纤维细胞线粒体膜电位降低了52%，但在帕金-siRNA-介导的突变成纤维细胞或细胞帕金击倒（p<0.05）；). 这可能表明我们的实验方案存在底线效应，或者线粒体膜电位已经因线粒体中存在的复合物I缺陷而最大程度降低帕金-突变成纤维细胞（另见).
鱼藤酮治疗对对照组和帕金突变型成纤维细胞的影响。（A）鱼藤酮治疗导致对照细胞线粒体膜电位降低54%，*p<0.05。鱼藤酮暴露后，parkin突变细胞已经显著降低的线粒体膜电位并没有进一步降低。（B）鱼藤酮治疗前后帕金突变患者的成纤维细胞图像，说明暴露毒素后线粒体的绝对长度减少（另见图5B）。（C）线粒体长度（长宽比）在年缩短了42%停车场鱼藤酮暴露后的突变细胞，**p=0.01。在siRNA介导的细胞中观察到类似的线粒体缩短停车场鱼藤酮暴露后击倒，**p=0.01。相反，对照组成纤维细胞的线粒体长度在鱼藤酮暴露后保持不变。（D）鱼藤酮暴露后，对照组和患者细胞中的线粒体分支（形状因子）增加（*p<0.05），与siRNA-介导的线粒体分支增加程度相似停车场敲除细胞，在鱼藤酮暴露后，其分支没有进一步增加。
暴露于鱼藤酮的细胞线粒体形态发生改变，有形成短而不规则形状线粒体的趋势，表明分裂增加，尤其是在患者的成纤维细胞中(). 为了量化这些影响，我们测量了患者和对照细胞在基础和鱼藤酮条件下的分支（形状因子）和长度（纵横比）。鱼藤酮暴露导致停车场-突变的成纤维细胞，但在对照组中没有（长径比，p<0.01，). 通过siRNA介导的敲除鱼藤酮对成纤维细胞线粒体长度的影响，证实鱼藤酮暴露后线粒体长度减少停车场（p<0.02，).
暴露于鱼藤酮的对照组成纤维细胞线粒体分支增加50%（形状因子，p<0.02，)，类似于突变体中观察到的分支程度停车场成纤维细胞在正常条件下。突变体停车场与鱼藤酮治疗前相比，成纤维细胞也显著增加了线粒体分支(，p<0.02）。如上所述，siRNA-介导的线粒体分支已经显著增加帕金击倒（参见)，与在停车场鱼藤酮暴露后的突变细胞(). 在siRNA介导的鱼藤酮暴露后，分支没有进一步增加停车场击倒细胞。
parkin突变和药理复合物I抑制对线粒体功能连接的加性效应
上述结果表明，帕金缺乏的成纤维细胞具有形态学改变，而暴露于鱼藤酮等额外的应激源会加剧这种改变。接下来，我们使用FRAP分析进一步确定帕金突变细胞中的功能连接是否受损。FRAP定量显示，在基础条件下，parkin缺陷细胞的mito-YFP恢复率低于对照组，鱼藤酮暴露后更是如此(). 为了对FRAP结果进行全面总结，我们计算了一段时间内mito-YFP的流动分数(). 以此作为衡量标准，基因型和鱼藤酮的影响均显著（双向方差分析，P（P）基因型=0.0036,P（P）鱼藤酮=0.006). 流动分数值与细胞内复杂I活性相关(;第页=0.79,P（P）=0.01). 总的来说，这些结果表明帕金缺乏的成纤维细胞在功能连接方面有一个基本缺陷，而鱼藤酮可以增强这种缺陷。
鱼藤酮诱导的线粒体分裂因帕金缺乏而增强。（A）对照组（n=4；开放符号）和parkin缺陷细胞系（n=5封闭符号）在光漂白（FRAP）后的荧光恢复曲线，无需治疗（圆形）或暴露于鱼藤酮（方形）后。每个点是mito-YFP的荧光强度，在x轴上指示的时间标准化为预漂白。（B）parkin缺陷线（填充条）中可移动的mito-YFP分数（可移动分数，y轴）低于对照组（开放条：*p<0.05）；鱼藤酮增强了这些作用（p<0.05）。（C）与对照组（开放符号）相比，帕金缺陷线（填充符号）中活动分数的基础缺陷与较低的复杂I活动相关（r=0.79，P（P）=0.01). 式中，n=3表示复合I活性，n=27-30表示流动分数。
线粒体呼吸链缺陷可以在停车场谷胱甘肽替代物处理突变体成纤维细胞
控制和停车场-突变成纤维细胞暴露于谷胱甘肽前体OTCA。使用OTCA进行24小时治疗，绘制浓度-反应曲线(). 使用最高剂量的OTCA（30μM）可以完全恢复帕金缺乏细胞的线粒体膜电位。救援效果取决于浓度，计算的EC90为10μM，用于所有后续实验。
实验性神经保护化合物拯救线粒体膜电位。（A）测量3种不同动物线粒体膜电位的浓度响应曲线停车场用2-氧代-4-噻唑烷羧酸（OTCA）处理的突变成纤维细胞系。水平线标记线粒体膜电位的控制值。（B）经OTCA治疗后，线粒体膜电位几乎正常化（95%的对照组）。用谷胱甘肽甲酯（GME）治疗后，效果不明显（对照组的65%），但仍显著增加，**p<0.01。（C）经OTCA治疗后，复合物I活性没有增加。（D）相反，在患者细胞中使用-氧代-4-噻唑烷羧酸（OTCA）治疗后，复合物II活性增加*p<0.05。（E）经OTCA治疗后，患者细胞内的细胞ATP水平显著升高**p<0.01。
用10μM OTCA治疗所有5个帕金突变成纤维细胞后，每个患者的线粒体膜电位都有所改善，平均膜电位恢复到对照水平的95%(). 相反，100μM剂量的GME处理使线粒体膜电位增加到对照值的60%，但不能完全补充线粒体膜电位(). 较高剂量的GME也获得了类似的结果（数据未显示）。这些数据表明，观察到的OTCA的近完全拯救效应可能仅部分是由于其对细胞内谷胱甘肽水平的影响。为了研究OTCA对线粒体膜电位的这种拯救作用的潜在机制，我们进行了进一步的深入实验。用10μM OTCA培养细胞不会改变线粒体复合物I的活性(). 相反，复合物II活性显著增加(). 用10μM OTCA治疗后，所有患者的细胞ATP水平均完全恢复(). 这表明，观察到的线粒体膜电位的挽救效应是由于复合物II活性的代偿性增加，而不是对复合物I缺陷的挽救。
细胞活力和细胞生长不受停车场突变
来自对照组和患有停车场突变（细胞存活率-对照：100%+/-8.3%，平均+/-SD；停车场突变患者96%+/-10.7%；细胞生长-对照：100%+/-5.6%，停车场突变患者：95.4%+/-14.3%）。此外，细胞生长不受对照或停车场-含有10μM OTCA的突变患者细胞（对照组：102.3%+/-9.6%，停车场突变患者：98%+/-10.8%）。用10μM OTCA预处理后，患者细胞和对照细胞的细胞活力增加了约8%（对照组：106.6%+/-12.6%，停车场突变患者：104.3%+/-18.8%），但这没有达到统计学意义（p>0.05）。
讨论
初步数据表明，在散发性帕金森病中，复合物I的功能受损可能仅限于黑质，但最近的研究也揭示了帕金森病患者额叶皮质中的单一复合物I缺乏。17,18一些研究还报道了非神经元组织（如血小板或肌肉）中复合物I缺乏，尽管非神经元组织的结果并不总是一致的，可能是由于方法上的差异。17然而，我们的结果表明，在一组由基因定义的帕金森病患者中，线粒体缺陷可以在大脑外发现。OTCA治疗对细胞生长或生存能力均无影响，这表明OTCA的拯救效应是线粒体功能特有的。
如果细胞在半乳糖而不是含葡萄糖的培养基中生长，parkin缺陷细胞的线粒体膜电位会受到更明显的损害。培养物中的成纤维细胞通过糖酵解而非氧化磷酸化生成大部分ATP。19,20然而，通过用半乳糖取代葡萄糖，成纤维细胞可以依赖氧化磷酸化来产生能量。8
已知几种泛素E3连接酶在调节线粒体融合和分裂中起作用。14我们的结果表明，parkin也在线粒体动力学中发挥作用，可能与其E3连接酶活性有关。我们尚未发现帕金缺乏对这些细胞系净蛋白酶体功能的影响（数据未显示）。然而，介导线粒体动力学的parkin底物并不为人所知，因为目前提出的任何parkin基质都不是线粒体。线粒体融合和分裂缺陷都与一些神经退行性疾病的发病机制有关。21融合和裂变有助于脂质膜和线粒体内物质的交换，这对维持线粒体的健康至关重要。尽管我们的结果表明，帕金缺乏细胞在应激时更容易进入裂变，目前尚不清楚这是继发于复杂I功能和ATP生成受损，还是导致线粒体功能受损的沉淀事件。22,23
我们可以推断，观察到的线粒体功能和形态异常是由于parkin缺乏，因为它们可以通过控制系中parkin的瞬时siRNA敲除来复制。干扰或GAPDH siRNA敲除对线粒体功能和形态没有影响，进一步表明所观察到的影响是针对停车场缺乏。值得注意的是，部分击倒停车场不足以导致线粒体膜电位或形态改变。这与真正的隐性遗传是一致的，不支持杂合性停车场是帕金森病的危险因素。总的来说，我们的结果与PINK1缺陷细胞中的结果一致，并提示可能存在一种共同的途径介导人类细胞中的隐性帕金森病，正如果蝇属.22,24-26
此前对帕金突变患者线粒体呼吸链功能进行研究的唯一一项其他研究描述了白细胞复合物I活性降低，但没有提供关于降低复合物I活性可能产生的功能后果的进一步信息，例如整体或复合物I特异性ATP测量或线粒体形态。27对帕金森病患者无明确病因的成纤维细胞进行的类似研究导致了不一致的结果，这可能反映了这种疾病的病因异质性。28
迄今为止，所有对帕金森病可能的神经保护剂进行的研究都未能确定对人类患者具有这种效果的药物。29这可能至少部分是由于目前常用的动物模型系统的弱点，这些系统通常用于测试有希望的化合物。30如果能够首先筛选化合物对导致人类组织中PD的机制的影响，那么在人类PD患者中研究假定的疾病修饰剂的未来试验可能会更加成功。我们的救援实验证明皮肤成纤维细胞停车场突变患者可能是测试新治疗方法的合适系统，至少是基于线粒体表型拯救的治疗方法，但任何有希望的化合物的效果显然需要在适当的动物模型中在神经元组织中得到证实。另一个警告是停车场突变有一个特定的已知原因导致帕金森综合征，因此尚不确定致病过程是否在停车场-突变患者与导致散发性PD的致病过程具有共同特征。然而，有证据表明，至少一些PD基因可能是导致线粒体功能受损的同一途径的一部分。31,32还有一种趋势是复合物I的活性降低以及活性氧的产生增加粉红色1突变体成纤维细胞。33此外，在辅酶Q10存在的情况下，培养来自迟发、散发性帕金森病患者的成纤维细胞恢复了缺陷复合物I活性，这在18名散发性帕金森病患者中的9名中观察到。28
有趣的是，线粒体膜电位受损停车场-突变细胞并没有因为潜在的功能缺陷（即复合物I缺乏）的纠正而正常化，而是似乎是由于复合物II活性的代偿性增加。这表明，任何有效的神经保护化合物可能不一定必须纠正导致细胞或特定细胞器（如线粒体）整体功能紊乱的特定缺陷。
致谢
感谢英国帕金森氏病学会和谢菲尔德大学谢拉·麦肯齐基金会的资助（HM，OB）。这项研究部分得到了NIH国家老龄研究所（KJT，MRC）的校内研究计划的支持。这项工作还得到了IOP-基因组学项目的支持，该项目题为：“鉴定线粒体活性营养调节剂的新工具：促进健康和抗击疾病的小分子”（#IGE05003，WJHK，PHGMW，JAMS）。
工具书类
1兰斯顿JW。帕金森综合症：帕金森综合征只是冰山一角。Ann Neurol公司。2006;59:591–596.[公共医学][谷歌学者] 2
Thomas B，Beal医学博士。帕金森氏病人类分子遗传学200716规范编号2:R183–194。[公共医学][谷歌学者]
三。Lucking CB、Durr A、Bonifati V等。早发性帕金森病与parkin基因突变之间的关系。N英格兰医学杂志。2000;342:1560–1567.[公共医学][谷歌学者] 4Kay DM、Moran D、Moses L等。杂合子parkin点突变在对照组和帕金森病患者中同样常见。Ann Neurol公司。2007;61:47–54.[公共医学][谷歌学者] 5Klein C、Lohmann-Hedrich K、Rogaeva E等。解读帕金森综合征相关基因杂合突变的作用。柳叶刀神经病学。2007;6:652–662.[公共医学][谷歌学者] 6Langston JW、Tanner CM、Schule B.Parkin基因变异和帕金森综合征：关联并不意味着因果关系。Ann Neurol公司。2007;61：4-6。[公共医学][谷歌学者] 7Abou-Sleiman PM，Muqit MM，Wood NW公司。对帕金森病线粒体功能障碍的深入了解。Nat Rev神经科学。2006;7:207–219.[公共医学][谷歌学者] 8Hofhaus G、Johns DR、Hurko O等。携带11778突变的与Leber遗传性视神经病变相关的传递性软骨细胞系的呼吸和生长缺陷。生物化学杂志。1996;271:13155–13161.[公共医学][谷歌学者] 9黄世光。活细胞线粒体膜电位高通量筛选试验的开发。生物分子筛。2002年；7:383–389.[公共医学][谷歌学者] 10Birch-Machin MA、Briggs HL、Saborido AA等。人体骨骼肌线粒体呼吸链中复合物I-IV活性测量的评估。生物化学-医学-代谢-生物。1994;51:35–42.[公共医学][谷歌学者] 11Shepherd D、Garland PB。大鼠肝线粒体柠檬酸合成酶的动力学特性。生物化学杂志。1969;114:597–610. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Manfredi G，Yang L，Gajewski CD，Mattiazzi M.哺乳动物细胞中ATP的测量。方法。2002年；26:317–326.[公共医学][谷歌学者] 13Koopman WJ、Visch HJ、Smeitink JA、Willems PH。活体人类皮肤成纤维细胞线粒体形态、质量、电位和运动的同时定量测量和自动分析。细胞计量学A。2006;69:1–12.[公共医学][谷歌学者] 14Karbowski M，Neutzner A，Youle RJ。线粒体E3泛素连接酶MARCH5是依赖于Drp1的线粒体分裂所必需的。细胞生物学杂志。2007;178:71–84. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Bradford MM。一种利用蛋白质-染料结合原理快速、灵敏地定量微克蛋白质的方法。分析生物化学。1976;72:248–254.[公共医学][谷歌学者] 16Koopman WJ、Visch HJ、Verkaart S等。线粒体网络复杂性和复合物I活性的病理性降低在孤立的人类复合物I缺乏症中密切相关。美国生理学杂志《细胞生理学》。2005;289：C881–890。[公共医学][谷歌学者] 17Parker WD，Jr.、Parks JK、Swerdlow RH。帕金森病额叶皮质的复合物I缺乏症。大脑研究。2008;1189:215–218. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Schapira AH，Cooper JM，Dexter D等。帕金森病线粒体复合体I缺乏症。柳叶刀。1989;1:1269.[公共医学][谷歌学者] 19Benard G、Bellance N、James D等。线粒体生物能量学和结构网络组织。细胞科学杂志。2007;120:838–848.[公共医学][谷歌学者] 20Rossignol R、Gilkerson R、Aggeler R等。能量底物调节癌细胞的线粒体结构和氧化能力。癌症研究。2004;64:985–993.[公共医学][谷歌学者] 21Detmer SA，Chan DC。线粒体动力学的功能和功能障碍。Nat Rev Mol细胞生物学。2007;8:870–879.[公共医学][谷歌学者] 22Exner N、Treske B、Paquet D等。人类PINK1功能丧失导致线粒体病理改变，可以通过帕金进行挽救。神经科学杂志。2007;27:12413–12418. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Greene JC、Whitworth AJ、Kuo I等。果蝇帕金突变体的线粒体病理学和凋亡性肌肉变性。美国国家科学院院刊。2003;100:4078–4083. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Clark IE、Dodson MW、Jiang C等。果蝇pink1是线粒体功能所必需的，并且在基因上与parkin相互作用。自然。2006;441:1162–1166.[公共医学][谷歌学者] 25Abeliovich A，Beal MF。帕金森症基因：罪魁祸首和线索。神经化学杂志。2006;99:1062–1072.[公共医学][谷歌学者] 26Yang Y，Gehrke S，Imai Y，等。帕金挽救了由果蝇Pink1失活引起的线粒体病理和肌肉和多巴胺能神经元变性。美国国家科学院院刊。2006;103:10793–10798. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Muftuoglu M、Elibol B、Dalmizrak O等。帕金突变患者白细胞线粒体复合物I和IV活性。Mov Disord公司。2004;19:544–548.[公共医学][谷歌学者] 28Winkler-Stuck K，Wiedemann FR，Wallesch CW，Kunz WS。辅酶Q10对帕金森病患者皮肤成纤维细胞线粒体功能的影响。神经科学杂志。2004;220:41–48.[公共医学][谷歌学者] 29Suchowersky O，Gronseth G，Perlmutter J等。实践参数：帕金森病的神经保护策略和替代疗法（循证综述）：美国神经病学学会质量标准小组委员会的报告。神经病学。2006;66:976–982.[公共医学][谷歌学者] 30Lang AE.帕金森氏病的神经保护：现在是为了完全不同的东西吗？柳叶刀神经病学。2006;5:990–991.[公共医学][谷歌学者] 31Plun-Favreau H、Klupsch K、Moisoi N等。线粒体蛋白酶HtrA2受帕金森病相关激酶PINK1调节。自然细胞生物学。2007;9:1243–1252.[公共医学][谷歌学者] 32Ved R、Saha S、Westlund B等。秀丽隐杆线虫α-突触核蛋白、parkin和DJ-1基因修饰诱导的线粒体脆弱性和拯救的类似模式。生物化学杂志。2005;280:42655–42668. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Hoepken HH、Gispert S、Morales B等。PARK6中线粒体功能障碍、过氧化损伤和谷胱甘肽代谢变化。神经生物学疾病。2007;25:401–411.[公共医学][谷歌学者] 
