线粒体动力蛋白样蛋白Opa1的蛋白水解调控

线粒体蛋白酶的siRNA

为了找出哪些蛋白酶影响Opa1，我们使用针对已知线粒体蛋白酶的siRNA进行了敲除实验。菱形蛋白酶PARL被认为是可能的候选酶，因为它与酵母Pcp1非常相似。PARL siRNA非常有效(图2A). 然而，PARL siRNA转染对Opa1成熟或诱导蛋白水解没有影响。因为少量残留的PARL仍然可以解释诱导性卵裂，我们还测试了PARL基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞系(Cipolat等人，2006年). 我们发现PARL^−/−即使没有CCCP，细胞也已经显示出大量Opa1蛋白水解。这种分裂可能反映了PARL先前观察到的细胞凋亡敏感性增加^−/−老鼠(Cipolat等人，2006年)我们使用PARL siRNA（未公开的数据）。然而，这种细胞系仍然能够诱导分裂(图2 C). 通过转染选定的Opa1亚型和CCCP处理证实了这些细胞中存在诱导性分裂。Opa1亚型7在PARL基因敲除细胞中的过度表达显示了带c和带d强度的一些变化(图2 C，底部），但这些强度在实验之间有所不同，表明PARL既不需要用于本构解理，也不需要用于诱导解理。

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图2。

已知线粒体蛋白酶对Opa1蛋白水解的影响。（A） 用不同蛋白酶的siRNA转染细胞。杂乱的寡核苷酸作为对照。蛋白质印迹显示，PARL减少92%，Yme1减少72%，HtrA2/Omi减少99.4%。用CCCP（60分钟）诱导蛋白质水解。DMSO（溶剂）作为对照。对于Yme1和PARL siRNA，也用staurosporine诱导蛋白水解（3小时）。数据代表了三个独立的实验。（B） 含或不含CCCP的Yme1 siRNA转染细胞Opa1带密度测定。直方图显示了条带的相对强度。（C） 帕尔^−/−细胞表现出更强的降解，但仍具有Opa1的诱导性分裂。用Opa1抗体检测内源性蛋白。用C末端myc标记检测转基因亚型。亚型7的两个裂解产物对应于外显子5（S1）和外显子5b（S2）中的裂解。（D） Yme1 siRNA对亚型1、5和7切割的影响，有或没有CCCP诱导和S1切割位点缺失。（E） D中未诱导泳道（DMSO）的密度测定。德尔塔S1后的加号表示S1切割位点缺失(石原慎太郎等人，2006年). Yme1后的加号表示转染了Yme1 siRNA。

另一个候选者是HtrA2/Omi，它面对线粒体膜间隙(Seong等人，2004年). HtrA2/Omi-siRNA是高效的（根据Western blot的密度测定判断减少>99.4%），但这并没有显著影响Opa1蛋白水解(图2 A). 最后，我们测试了线粒体AAA蛋白酶。哺乳动物有三种，即Yme1、截瘫和AFG3L2(Langer等人，2001年). Yme1的催化结构域面向线粒体膜间隙，而截瘫和AFG3L2的催化结构区面向线粒体基质。截瘫和AFG3L2-siRNA转染并不影响Opa1蛋白水解，但敲除不完全（10%和34%残留RNA），因此截瘫或AFG3L2可能仍然介导诱导性切割。

相反，即使没有CCCP，Yme1 siRNA也会影响Opa1。Western blot显示经处理和未经处理细胞的带型发生变化(图2 A). CCCP仍能诱导Yme1 siRNA转染细胞的蛋白水解，但并非所有条带都同样受到Yme1 siRNA和CCCP的影响(图2 B)这表明解理模式由选择性剪接控制。我们得出结论，Yme1影响Opa1亚型子集的组成性蛋白水解，但不需要诱导性蛋白水解。

Opa1在解理位点附近有广泛的选择性剪接(石原慎太郎等人，2006年). 为了确定哪些剪接变异体受诱导蛋白水解的影响，哪些受Yme1介导的蛋白水解影响，我们用代表性表达结构转染细胞（亚型1没有额外的外显子，亚型5有4b但没有5b，亚型7有5b但没有4b；Satoh等人，2003年). 这三种亚型在HeLa细胞中相对丰富(Satoh等人，2003年;Olichon等人，2007年). 此外，我们用表达结构转染细胞，其中第5外显子包含的主要诱导分裂位点S1被删除(石原慎太郎等人，2006年). 转染细胞经CCCP或不经CCCP处理以测定其对诱导蛋白水解的敏感性，并与Yme1 siRNA共转染或不转染以测定其对于组成蛋白水解的敏感度。

我们的结果证实，亚型1被CCCP诱导的蛋白质水解分解(图2、D和E). S1的突变，即先前在外显子5中发现的切割位点，使该亚型对诱导性切割不敏感(石原慎太郎等人，2006年). 然而，这种亚型不受Yme1 siRNA的影响。相反，分别包含外显子4b和外显子5b的亚型5和亚型7受Yme1 siRNA的影响。在这两种情况下，都有向未切割带的实质性转移。在未诱导的细胞中残留到较低条带的裂解以及用CCCP诱导后的进一步裂解可归因于诱导蛋白酶。

包含外显子4b的等位基因5即使没有CCCP诱导也会被完全裂解(图2、D和E). 通过删除S1可以减少但不能完全消除这种切割，通过转染Yme1 siRNA可以减少但无法完全消除这种剪切。然而，在这些条件下积累的未分离蛋白可以通过诱导蛋白水解进行切割，即使S1被删除。我们的结论是，亚型5具有类似于亚型7中的选择性切割位点的选择性切割部位。通过SDS-PAGE进行的大小测定表明，该位点位于外显子4b（未发表的数据），其类似于同种型7的外显子5b中的选择性切割位点S2。

异构体7产生三条带（未分离蛋白和两个裂解产物），这与以前的结果一致(石原慎太郎等人，2006年). 较长的裂解产物反映了外显子5中的裂解位点（S1），较短的裂解产物则反映了外显子5b中的裂解部位（S2）。S1的缺失消除了较长的切割产物，并导致未切割蛋白质的积累。用CCCP处理后，未分离的蛋白质裂解效果较差，表明S2位点被诱导蛋白酶裂解的效率较低。Yme1 siRNA也获得了类似的结果。在CCCP诱导下，与Yme1 siRNA积累的未分离蛋白优先在S1处裂解(图2 D，底部；车道5和6）。

为了证实含外显子4b和5b的亚型受到Yme1的影响，我们用siRNA寡核苷酸转染细胞，如前所述，这些寡核苷酸对外显子4和5b具有特异性(Olichon等人，2007年). 外显子4b和5b siRNA都降低了带d的强度（图S2 A，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200704112/DC1). 外显子5b siRNA也降低了带a和带c的强度，尽管它们在野生型细胞中已经很微弱。用Yme1 siRNA转染产生的模式似乎是外显子4b和5b siRNA的总和。我们得出结论，未诱导细胞中的较短产物由外显子4b或5b的亚型组成。这些亚型需要Yme1进行结构性切割，而其他亚型仍然容易诱导切割。

Yme1和Opa1异构体特异性siRNA对线粒体形态的影响

令我们惊讶的是，转染Yme1 siRNA的细胞线粒体异常连接(图3、C和D). 转染后第2天，40%的细胞有更多连接的线粒体，56%的细胞表现正常，4%的细胞有破碎的线粒体(n个=400），而在未转染细胞中，100%的线粒体形态正常(n个= 100). 另外两个Yme1 siRNA寡核苷酸也观察到类似的形态缺陷（图S2，B-D），证实这些效应对Yme1的敲除是特定的。增加的连接性与Drp1 siRNA观察到的连接力惊人地相似(图3 B). 随后，相当一部分细胞发生细胞死亡（图S2 E），线粒体碎片（转染后第3天，23%的细胞连接线粒体，45%正常，而31%的细胞线粒体碎片；n个= 300). 这些片段比Opa1 siRNA细胞中的线粒体片段更不规则(图3、E和F). 在以后的时间点，强Drp1突变体也观察到类似的线粒体解体(Smirnova等人，2001年).

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图3。

Yme1 siRNA对线粒体形态的破坏。用线粒体追踪仪检测线粒体。（A） 用干扰寡核苷酸转染Yme1的细胞。（B） 转染Drp1 siRNA后2天的细胞。（C和d）转染Yme1 siRNA 2天后的细胞。（I和J）转染Opa1外显子4b–和5b特异性siRNA的细胞（形态缺陷的量化参见图S2；可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200704112/DC1). 棒材，10μm。

为了确定Yme1 siRNA细胞连接性的增加是由融合的增加还是分裂的减少引起的，我们通过将转染的细胞与CCCP孵育并使其恢复来诱导线粒体断裂（类似于放线菌酮实验；图S1）。我们发现，转染Yme1 siRNA既不能阻止CCCP诱导的片段化，也不能阻止洗脱后的恢复(图4，A–F). 对这些结果的定量分析表明，恢复过程中存在一些延迟(图4 G)但事实上，恢复完全可以发生，这表明Yme1对线粒体融合不是必需的。与转染Drp1显性阴性突变体的细胞不同，CCCP仍能诱导Yme1 siRNA细胞线粒体断裂(Duvezin-Caubet等人，2006年)表明线粒体分裂也可能发生。因此，我们在Yme1 siRNA细胞中观察到的形态异常一定是由于线粒体分裂和融合之间的平衡发生了微妙的变化，而不是由于这两个过程的强烈影响。

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图4。

从CCCP诱导的线粒体断裂中恢复Yme1 siRNA转染细胞。（A–F）细胞被打乱（A–C）或Yme1 siRNA寡核苷酸（D–F）转染。通过与线粒体靶向DsRed共转染观察线粒体形态。转染（A和d）后2天，用CCCP孵育60分钟（B和E），或用CCCP培养60分钟，然后洗脱和3.5小时恢复（C和F），观察到细胞未经进一步处理。（G） 不同线粒体形态的细胞百分比以及A-F中描述的处理方法。形态分为连通（高度互联）、正常（管状形态）、中间（部分碎片化）和碎片化（完全碎片化）。加扰控制的样本大小如下：n个=添加CCCP前计数的506个细胞，n个=添加CCCP后计数的246，以及n个=冲洗后3.5小时计数的100个细胞。Yme1 siRNA的样本大小为n个= 384,n个=332，以及n个分别为169。棒材，10μm。

Opa1外显子4b–和5b特异性siRNA也观察到类似的形态学异常(Olichon等人，2007年). 用这些寡核苷酸转染可增加线粒体连接(图3、I和J)，但在外显子4b和5b siRNA观察到的形态之间存在微小差异。外显子6b siRNA产生较薄且连接较多的线粒体，而外显子5b产生具有局部肿胀的连接线粒体，类似于Yme1 siRNA。此外，Opa1外显子4b和5b特异性siRNA增加了凋亡细胞的数量（未公布的数据），这与之前公布的数据一致(Olichon等人，2007年). 为了确定Opa1是否是Yme1 siRNA连接增加所必需的，我们共转染了Yme1 siRNA和pan-Opa1 siRNA。Western blotting显示Opa1水平降低了82%，这通常会影响线粒体形态(Cipolat等人，2004年)和Yme1水平降低99%（参见图S3 a的蛋白质印迹；可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200704112/DC1). 令我们惊讶的是，几乎所有与Opa1和Yme1 siRNA共同转染的细胞都有更多连接的线粒体(图3 H)与Yme1 siRNA类似，但没有线粒体碎片(n个= 200). 相比之下，99%单独用Opa1 siRNA转染的细胞具有破碎的线粒体，如前所述(Griparic等人，2004年). 这些结果表明Yme1对Opa1具有上位性。

我们使用电子显微镜检查了Yme1 siRNA对线粒体内部结构的影响（图S3，C-F）。为了进行比较，细胞还转染了Drp1 siRNA以及Yme1和Opa1 siRNA。这些转染均未对嵴形态产生剧烈影响。Yme1 siRNA确实导致一些嵴出现紊乱，但结果并不强烈，也不容易量化。Yme1/Opa1双siRNA细胞也没有明显缺陷。Opa1 siRNA可影响嵴形态(Griparic等人，2004年)但这可能被Yme1 siRNA引起的连接性增加所抑制。在Mgm1和Dnm1（Opa1和Drp1的同源物；Sesaki等人，2003年). 我们得出结论，Yme1 siRNA没有显著破坏线粒体的内部结构。

亚细胞分离和蛋白质印迹

为了分离Yme1印迹的线粒体，细胞在600℃离心5分钟克用线粒体分离缓冲液清洗(Griparic等人，2004年). 细胞膜被超声波破坏。通过在1000下离心5分钟去除细胞核和未破坏的细胞克.线粒体在10000下进一步离心30分钟制成丸克将颗粒重新悬浮在laemmli样品缓冲液中，通过SDS-PAGE对粒径进行分级，并用硝酸纤维素进行印迹。

细胞提取物是在莱姆利样品缓冲液中通过直接裂解产生的。煮沸5分钟后，通过SDS-PAGE对样品进行解析（Opa1为6%，其他蛋白质为10%或12%）。用小鼠Opa1和Tim23抗体（BD Biosciences）、小鼠caspase 9和PARP抗体（BD-Biosciences）、caspase 3抗体（Abcam）、Omi抗体（BioVision）、大鼠抗myc抗体（AbD Serotec）、山羊抗Hsp60抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）和微管蛋白单克隆抗体（Sigma-Aldrich）检测印迹。PARL抗体由B.De Strooper提供，Yme1抗体由C.Koehler（加利福尼亚大学洛杉矶分校，加利福尼亚州洛杉矶）提供。使用HRP标记的二级抗体和化学发光试剂开发印迹（GE Healthcare）。

转染构建物和siRNA寡核苷酸

含有野生型Opa1亚型1的表达构建体如前所述(Griparic等人，2004年). 通过PCR将一个C末端myc标记添加到该结构中。通过从HeLa cDNA中扩增外显子5b，并在myc标记的亚型1结构体中克隆该片段与BclI和BstBI位点，生成了第7个异构体。通过从HeLa cDNA扩增外显子4b和周围序列，并在myc标记的亚型1构建物中克隆带有BclI和BstBI位点的该片段，同样生成了5号异构体。使用AGGTTCTCCGGAAGAATCGAAAGTGACAAGCATTAGTTAG和AATGCTTGTCACTTCAGATTCTTCCGGAACCTGAGGT引物进行定点突变，通过融合PCR对S1裂解位点进行缺失。将突变片段克隆到具有BclI和BstBI位点的亚型1、5和7 myc标记结构中。新克隆被测序以确保保真度。

siRNA的寡核苷酸由Sigma-Poligo合成。它们的序列是GATGCATTAAAACTGGTTTT（第一个）、ACTTCCAAAAGGAATTCTTT（第二个）和TCTTGTGAACCAGCTGCATT（第三个）（Yme1）、ATCCAGTGCCAGGTTATTT（PARL）、GGTACAGCTGAATCCTT（HtrA2/Omi，GCAGAGAATGGTAATT用于Drp1，GATCATGCCACGGTTT用于所有Opa1亚型，GTCATAGGAGCTTGACCTA用于Opa1外显子4b，GAGGAAGCGCT用于Opa1Opa1的外显子5b。加扰控件具有反向的感觉链序列。HeLa细胞在转染前1天分裂，第二天融合30–50%。使用60 pmol siRNA双链体用寡效胺（Invitrogen）进行转染。在第2天，细胞以1:3或1:4的比例分裂至6厘米或玻璃底培养皿，并在第3天再次转染。第4天，一些细胞用于RNA分离。其他人用MitoTracker红（Invitrogen）和CCCP孵育。为了使用Yme1 siRNA恢复CCCP，使用LipofectAMINE 2000（Invitrogen）将siRNA和MitoDsRed（CLONTECH Laboratories，Inc.）转染细胞。

当抗体可用时，用实时PCR或Western blotting定量siRNA对表达水平的影响。对于实时PCR，使用RNeasy试剂盒（QIAGEN）分离总RNA。使用ThermoScript（Invitrogen）逆转录200-300 ng RNA。使用ICycler和iQ SYBR绿色Supermix（Bio-Rad实验室）进行实时PCR。肌动蛋白mRNA作为对照。每个样品一式三份进行测量。使用个人密度计SI和ImageQuant软件（分子动力学）通过密度测定法定量蛋白质印迹。

我们感谢David Chan博士和Song Zhiyin博士分享他们未发表的数据。我们感谢Marianne Cilluffo在电子显微镜方面的专家协助，感谢Carla Koehler博士和Bart De Strooper博士提供抗体。我们还感谢De Strooper博士提供PARL敲除细胞。我们感谢Noh-Jin Park在实时PCR方面的帮助，并感谢我们实验室的成员对手稿进行了有益的讨论和批判性阅读。

这项工作得到了美国癌症协会（RSG-01-147-01-CSM）、美国国立卫生研究院（GM051866）和癌症研究协调委员会的资助。L.Griparic得到了美国心脏协会（西方国家附属机构）的一个研究金的支持。