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.2010年1月26日；8（1）：e1000298。
doi:10.1371/journal.pbio.1000298。

PINK1选择性地稳定在受损线粒体上以激活Parkin

德里克·普·纳伦德拉 1, Seok Min Jin先生, 田中Atsushi Tanaka, 德芬森, 克莱门特·戈蒂埃, 杰申, 马克·库克森, 理查德·尤尔
附属公司

PINK1在受损线粒体上选择性稳定以激活Parkin

德里克·普·纳伦德拉等。 公共科学图书馆生物. .

摘要

PINK1和Parkin的功能缺失突变可导致人类帕金森综合征和模型生物体线粒体功能障碍。Parkin被选择性地从细胞溶质中招募到受损的线粒体，以触发其自噬。然而，帕金如何识别受损的线粒体尚不清楚。在这里，我们表明，PINK1在单个线粒体上的表达受到电压依赖性蛋白水解的调节，以维持健康极化线粒体上的低水平PINK1，同时促进维持损伤的线粒体上PINK1的快速积累。PINK1在线粒体上的积累对于Parkin向线粒体的募集是必要的，也是充分的，PINK1和Parkin的致病突变在不同的阶段破坏了Parkin募集和Parkin-诱导的有丝分裂。这些发现为黑腹果蝇PINK1和Parkin之间的遗传上位性提供了生化解释。此外，他们支持一种对受损线粒体进行负选择的新模型，其中PINK1向Parkin发出线粒体功能障碍的信号，Parkin促进其消除。

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数字

图1
图1。PINK1选择性地聚集在去极化的线粒体上。
（A） 在时间点0用血清中的10µM CCCP处理稳定表达YFP-Parkin的HeLa细胞，进行分馏，并提取碳酸盐。富含完整线粒体蛋白的碳酸盐提取颗粒在SDS凝胶上运行，并对内源性PINK1和线粒体蛋白VDAC进行免疫印迹。我们在最初的实验中使用了稳定表达YFP-Parkin的HeLa细胞，因为不清楚PINK1的稳定性是否会受到Parkin缺失的影响，正如之前报道的那样。（B） 用20µM CCCP处理血清中稳定转导对照shRNA或PINK1 shRNA的M17人神经母细胞瘤细胞并进行分馏。富含线粒体的膜部分在SDS凝胶上运行，并进行免疫印迹，如（A）所示。（C） 用PINK1-V5转染E18大鼠皮层神经元（体外7 d）。第二天，用1µM CCCP处理细胞6 h。在SDS页面凝胶上运行全细胞裂解液，并按照（A）中的方法进行免疫印迹。（D） 转染PINK1-YFP（绿色）的HeLa细胞的活细胞成像在时间点0用血清中的10µM CCCP处理。在用CCCP去极化之前，用线粒体追踪红（MTR）（红色）脉冲标记线粒体。（E） 转染PINK1-YFP（绿色）的Mfn1/2空MEF。所有线粒体均用抗细胞色素c抗体（Cyto c；白色）染色，生物能量耦合线粒体用脉冲细胞Mitotracker Red（MTR）（红色）染色。（F） 在两个独立的实验中，分别在八个或更多的细胞中测量了PINK1阴性线粒体（PINK1-Mito）和PINK1-阳性线粒体（PINH1+Mito）的平均MTR强度/像素。显示了一个代表性实验的数据。a.u.，任意单位。（G） 用PINK1-YFP（绿色）转染HeLa细胞，并用2 mM百草枯处理16 h。用MTR（红色）对细胞进行脉冲处理，固定，并对细胞色素c（白色）进行免疫染色。（H） 在两个独立的实验中，测定了八个或更多细胞的PINK1-YFP强度和细胞色素c强度之间的皮尔逊系数指数，以及PINK1/YFP密度和MTR强度。给出了一个典型实验的数据。（I） 用CFP Parkin（红色）和PINK1KD-YFP（绿色）转染HeLa细胞，作为内源性PINK1积累的报告基因，并用2mM百草枯处理16小时。细胞用MTR（白色）脉冲处理并固定。（J） 在两个独立的实验中，测定了7个或更多细胞的PINK1 KD-YFP强度与CFP-Parkin强度、PINK1KD-YFP强度与MTR强度之间的皮尔逊系数指数。给出了一个典型实验的数据。
图2
图2。PINK1在抑制电压敏感性分裂后积累。
（A） 用DMSO处理稳定表达YFP-Parkin的HeLa细胞3.5小时，用2µM CCCP处理3.5小时，或用CCCP处理3小时，然后在没有血清的情况下洗去CCCP 0.5小时。在最后1 h的处理中添加50µM MG132和/或100µM环己酰胺。全细胞裂解物（WCL）在SDS凝胶上运行，并对内源性PINK1和微管蛋白进行免疫印迹。（B） 描述PINK1两步处理的模型。（C） 定量RT-PCR用于测量用DMSO或CCCP处理1h的HeLa细胞中PINK1 mRNA的相对表达。该图表示四个独立实验的结果。作为阳性对照，在外源性表达PINK1后，还测量了HeLa细胞中的相对PINK1 mRNA水平。PINK1 mRNA表达水平与持家基因标准化β-肌动蛋白.WT，野生型。
图3
图3。去极化线粒体的Parkin募集需要PINK1及其线粒体靶向N末端。
（A） PINK1的主要MEF+/+或PINK1−/−将YFP-Parkin（绿色）和指示构建物（载体PINK1-V5、PINK1激酶缺乏[KD]-V5或PINK1156-581[ΔN]-V5）以1∶4的比例共同转染小鼠，用二甲基亚砜或血清中的20µM CCCP处理3 h。对线粒体进行Tom20（红色）免疫染色。右侧列中的图像是中间列和左侧列的合并图像，是中间列中装箱区域的展开。（B） 在三个或多个独立实验中，对≥100个细胞/条件下（A）中YFP-Parkin和线粒体之间的克隆化进行评分。（C） 独立生成PINK1的转换MEF+/+和PINK1−/−小鼠被转染并按（A）中所述进行处理，并按（B）中所示进行评分。（D） 用10µM CCCP处理血清中稳定转导对照shRNA或PINK1 shRNA的M17人神经母细胞瘤细胞3 h，并如（A）所示成像。（E） 如（B）所述，对（D）中YFP-Parkin和线粒体之间的结肠化进行评分。（F） 对照shRNA和PINK1 shRNA M17细胞被转染并按（D）中的方式处理，将其分为富含线粒体的膜组分（Memb）和上清液（Sup）。在SDS凝胶上运行组分，并用抗Parkin和抗VDAC抗体进行免疫印迹。对两种细胞类型之间的核后上清液（PNS）中的YFP-Parkin浓度进行调整，使其接近相等。（A和D）中的比例尺代表10µm。（B、C和E）中的误差线表示标准偏差。
图4
图4。PINK1是Parkin诱导去极化线粒体自噬所必需的。
（A） PINK1的主要MEF+/+或PINK1−/−与YFP-Parkin共转染的小鼠用DMSO或血清中的20µM CCCP处理24 h。线粒体用抗Tom20抗体染色。（B） 在三个或更多独立实验中，对每种情况下>150个细胞的（A）中未检测到线粒体的细胞百分比进行评分。（C） 用对照shRNA或PINK1 shRNA稳定转导的M17人神经母细胞瘤细胞用10µM CCCP处理24小时，并如（A）所示染色。（A和C）底部行中的图像是中间行中方框所示图像的展开。（A和C）中的比例尺代表10µm。（D） 如（B）所述，对（C）中无线粒体的细胞百分比进行评分。（E） 用DMSO或10µM CCCP处理稳定转导对照shRNA或PINK1 shRNA的M17细胞24 h，并用Mitotracker Green（MTG）染色。MTG以膜电位无关的方式对线粒体脂质进行染色，是线粒体质量的敏感测量。该图代表了三个独立实验中DMSO和CCCP处理的样品之间Mitotracker Green强度的变化。（F） 在CCCP存在下，用Mitotracker Green对稳定转导对照shRNA或PINK1 shRNA的M17细胞进行脉冲处理。在0小时、16小时和24小时用平板读取器测量MTG强度损失。该图显示了三个生物复制品的数据，并代表了三个独立的实验。（B、D和E）中的误差条表示标准偏差。
图5
图5。Parkin募集动力学受PINK1表达调控。
（A） 在血清中添加10µM CCCP后，在0分钟的时间点，对单独转染mCherry-Parkin（红色）或以1∶1比例转染M樱桃-帕金（红色）和PINK1-YFP的HeLa细胞进行实时成像添加CCCP后。Parkin易位开始的时间被定义为在至少三个独立实验中，六个或更多细胞的两个或多个连续图像的两个以上象限中首次出现点状突起。N.S.，无显著性。（C） 转染YFP-Parkin（绿色）或YFP-Pargin（绿色）和PINK1-myc（比例为1∶4）的HeLa细胞的活共焦图像。用TMRE（红色）负载细胞以染色极化线粒体。细胞未经CCCP处理。最后一幅图像中的比例尺表示10µm。中间面板和右侧面板中的图像是左侧面板中方框区域的扩展。（D） 按（C）所述处理的细胞在YFP-Parkin和TMRE之间的共定位进行评分。≥在三个或更多的独立实验中，对50个细胞/实验进行评分。
图6
图6。线粒体外膜上PINK1的稳定表达足以补充Parkin。
（A） PINK1-YFP（绿色）、PINK1（111–581）-YFP-（绿色）和OPA3-PINK1（111-581）-YFP（绿）结构示意图。（B） 共焦图像描绘了HeLa细胞中PINK1-YFP、PINK1（111–581）-YFP和OPA3-PINK1（111-581）-YFP的定位。线粒体用电位染料TMRE（红色）染色。（C） 用PINK1-YFP、PINK1（111–581）-YFP-或Opa3-PINK1-（111–58）-YFP转染HeLa细胞，并用二甲基亚砜或2µM CCCP在无血清培养基中处理3 h。在SDS凝胶上运行全细胞裂解物（WCL），并对PINK1、GFP和微管蛋白进行免疫印迹。（D） 与mCherry-Parkin（红色）和PINK1-YFP（绿色。细胞未经CCCP处理。（E） 在三个或更多独立实验中，对（D）中的HeLa细胞进行了mCherry-Parkin评分，以确定其在≥150个细胞中形成线粒体点状特征。细胞未经CCCP处理。（F） 用胞浆中的FRB-PINK1（111–581）-YFP、线粒体上的TOM20（1–33）-FKBP和mCherry-Parkin转染HeLa细胞。在雷帕霉素类似物AP21967存在下，各融合蛋白（PINK1（111–58）和TOM20的线粒体外膜锚定）的FRB和FKBP结构域异源二聚体化，如果他们可以进入同一个隔间（例如胞浆）。用载体或250 nM AP21967处理细胞8 h后，在三个或更多独立实验中对≥150个细胞线粒体的mCherry-Parkin点状特征进行评分。（G） 用PINK1-YFP（绿色）、PINK1（111–581）-YFP（绿色）或OPA-PINK1（111–581）-YFP（绿色）转染或不转染ECFP Parkin的HeLa细胞的共聚焦图像，并在不存在CCCP的情况下培养96小时。对细胞进行Tom20免疫染色（红色）。为了帮助观察缺乏线粒体的细胞，一些单个细胞被描绘出来。（H） 在三个或更多的独立实验中，如果≥150个细胞中没有可检测到的线粒体，则按照（G）中的方法处理细胞。所有图像中的比例尺代表10µm。
图7
图7。帕金招募可能需要CCCP去极化后PINK1的积累。
（A） 在不含血清的情况下，用2µM CCCP单独处理1 h或CCCP 1 h+2µM CHX处理稳定表达YFP-Parkin的HeLa细胞（30 min预处理和1 h处理）。在SDS凝胶上运行全细胞裂解产物，并对内源性PINK1和负载控制GAPDH进行免疫印迹。（B） 按（A）处理的细胞被分离。在SDS凝胶上运行富含线粒体的膜组分（Memb），并对内源性PINK1和VDAC进行免疫印迹。（C） 用YFP-Parkin（绿色）转染HeLa细胞，并在有血清的情况下单独用10µM CCCP 1 h、CCCP+10µM放线菌素（30分钟预处理和1 h处理）或CCCP 1 h+100µM CHX（30分钟前处理和1小时处理）处理，并对Tom20进行免疫染色（红色）。（D） 在三个或多个独立实验中，对≥150个细胞/条件下（C）中YFP-Parkin和线粒体之间的克隆化进行评分。（E） 将稳定表达YFP-Parkin的HeLa细胞作为（A）处理并进行分馏。富含线粒体的部分在SDS凝胶上运行，并对Parkin进行免疫染色。所有图像中的比例尺代表10µm。
图8
图8。致病性PINK1突变体无法重建Parkin募集到去极化线粒体。
（A） PINK1的主要MEF−/−用YFP-Parkin（绿色）和指示的V5标记的PINK1构建体以1∶4的比例共转染的小鼠在血清中用DMSO或20µM CCCP处理3小时。用抗Tom20抗体（红色）染色线粒体。图像中的比例尺表示10µm。中间行和底部行中的图像是由顶部行中的框指示的图像的展开。（B） 在三个或多个独立实验中，对（A）中YFP-Parkin和线粒体之间的克隆化进行了评分，每种条件下的细胞数超过150个。误差线表示标准偏差。（C） 将稳定表达YFP-Parkin的HeLa细胞转染到指定的V5标记结构，在无血清培养基中用二甲基亚砜或2µM CCCP处理3 h，然后分馏。富含线粒体的膜部分在SDS凝胶上运行，并对PINK1、V5标签和线粒体蛋白VDAC进行免疫印迹。
图9
图9。Parkin的致病突变破坏了Parkin向线粒体的募集和/或Parkin诱导的有丝分裂。
（A） 用含有指示突变的YFP-Parkin（白色和绿色）转染HeLa细胞，并用CCCP处理1 h。用抗Tom20抗体（红色）标记线粒体。底部行中的图像是由中间行中的框指示的区域的展开。WT，野生型。（B） 在三个或更多独立实验中，（A）中YFP-Parkin和线粒体之间的克隆化得分≥150个细胞/条件。（C） HeLa细胞按照（A）进行转染和处理，并分为核后上清液（PNS）、富含线粒体的重膜部分（HMF）和上清液。部分在SDS凝胶上运行，并对Parkin和VDAC进行免疫印迹。（D和E）HeLa细胞如（A）中所述转染并用CCCP或DMSO处理24小时。（E） WT、R42P和R275W Parkin（绿色）的图像与（A）中一样染色。星号（*）表示工程突变；所有其他疾病都与帕金森病有关。所有图像中的比例尺代表10µm。（B和D）中的误差线表示标准偏差。
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