Cytoplasmic Pink1 activity protects neurons from dopaminergic neurotoxin MPTP

doi:10.1073/pnas.0705363105

.2008年2月5日；105(5):1716-21.

doi:10.1073/pnas.0705363105。 Epub 2008年1月24日。

细胞质Pink1活性保护神经元免受多巴胺能神经毒素MPTP的影响

M埃姆达杜尔·哈克¹, 凯利·J·托马斯, 谢丽尔·德索萨, 史蒂夫·卡拉汉, 托鲁·北田, 露丝·S·斯拉克, 保罗·弗雷泽, 马克·库克森, 阿努拉·坦登, 大卫·S·帕克

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细胞质Pink1活性保护神经元免受多巴胺能神经毒素MPTP的影响

M Emdadul Haque先生等。美国国家科学院程序. 2008.

.2008年2月5日；105(5):1716-21.

doi:10.1073/pnas.0705363105。 Epub 2008年1月24日。

作者

M Emdadul Haque先生¹, 凯利·J·托马斯, Cheryl D’Souza（谢丽尔·德索萨）, 史蒂夫·卡拉汉, 托鲁·北田, 露丝·S·斯拉克, 保罗·弗雷泽, 马克·库克森, 阿努拉·坦登, 大卫·S·帕克

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¹加拿大安大略省渥太华市渥太华大学渥太华健康研究所神经科学组。

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摘要

PTEN诱导的假定激酶1（Pink1）是最近发现的与家族性帕金森病（PD）隐性形式相关的基因。该激酶包含线粒体定位序列，据报道至少部分位于线粒体中。然而，Pink1缺失导致多巴胺神经元丢失的方式及其对线粒体功能的影响以及与死亡的相关性尚不清楚。在这里，我们报告了RNAi对Pink1的缺失增加了MPP（+）诱导的神经元毒性。此外，野生型Pink1（而非与家族性PD相关的G309D突变体或工程化激酶缺失突变体K219M）可在体内外保护神经元抵抗MPTP。有趣的是，一种含有推定线粒体靶向基序缺失的突变体靶向细胞质，但仍能对1-甲基-4-苯基吡啶（MPP（+））/1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的毒性提供保护。此外，我们还发现内源性Pink1定位于细胞溶质和线粒体部分。因此，我们的研究结果表明，Pink1在神经元存活中起着功能性作用，细胞质靶点除了在线粒体中的其他作用外，可能对这种保护作用很重要。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
NIH 3T3细胞系或皮层神经元中Pink1的敲除。(一个)将靶向小鼠Pink1基因的siRNA转染NIH 3T3细胞，转染24 h后收集细胞分离RNA；以Pink1引物和S12引物为内对照进行RT-PCR。(B类)或者，在电镀时用携带shRNA Pink1的腺病毒感染皮层神经元，并对细胞进行RT-PCR处理。(C)感染shRNA Pink1病毒或对照后的皮层神经元用Pink1抗体进行免疫染色。(D类)感染对照和shRNA Pink1病毒的Pink1免疫染色神经元荧光强度的量化。星号表示重要性(*P（P）*< 0.05). 数值为平均值±SEM(n个= 30–34). (E类)shRNA敲低皮层神经元中的Pink1使细胞对MPP敏感⁺在电镀3天后，用shRNA质粒转染皮层神经元。用20μM MPP处理细胞⁺24小时后，根据细胞核完整性计算GFP阳性细胞数。星号表示重要性(*P（P）*<0.05）。

**图2。**
原代皮层神经元培养3天，然后用磷酸钙转染不同的构建物。(一个)用20μM MPP处理细胞⁺48小时后，通过评估GFP阳性神经元的核完整性来评估神经元存活率。(B类)WT Pink1或ΔNPink1（N末端截断Pink1）对皮层神经元MPP的神经保护作用⁺突变体G309D或K219M没有表现出任何保护作用。数据为平均值±SEM(n个= 3). 星号表示重要性(*P（P）*<0.05）与MPP相比⁺控件。

**图3。**
用WT Pink1或ΔNPink1对COS-7细胞系进行免疫染色。(一个)用WT或ΔNPink1转染细胞，转染24小时后，用有丝分裂跟踪器孵育细胞并固定进行免疫染色。用抗Flag抗体染色细胞以显示Pink1，并通过共焦显微镜拍摄图像。(B类)将GFP、WT、ΔNPink1和K219M-Pink1构建物转染NIH 3T3细胞。然后，转染24小时后，用等量的缓冲液将细胞分为细胞溶质和线粒体部分。每个组分的电泳体积相等。

**图4。**
WT或ΔNPink1提供了针对MPTP管理的保护。腺病毒（2μl，1×10⁷在开始MPTP治疗前7天，将表达WT、ΔNPink1、G309D和K219M Pink1的颗粒/μl）直接注射到动物的纹状体。使用表达GFP的病毒作为对照。将大脑切片成14μm的薄片进行TH染色。(一个)MPTP治疗2周后，动物同侧TH-免疫阳性神经元的代表性图像。(B类和C)TH-免疫阳性(B类)或甲酚紫染色(C)对SNc同侧或对侧区神经元进行定量。数据为平均值±SEM(n个= 3–4). (D类)将GFP载体（第1道）、WT Pink1（第2道）、ΔNPink1（第3道）、G309D（第4道）和K219M（第5道）病毒传递到小鼠大脑后1周，Pink1/突变体的表达进行免疫印迹处理。星号表示重要性(*P（P）*<0.05）。

**图5。**
Pink1在HEK293、NIH 3T3细胞和皮层神经元中的亚细胞分布。(一个,B类,D类)1000×离心后收集上清液克转染WT Pink1的细胞裂解液(一个)，未转换(B类)、HEK293或NIH 3T3(D类)对细胞进行顺序离心，用SDS/PAGE对颗粒进行分析，并用Pink1抗体进行检测(一个,B类,D类)或各种细胞器标记(C,D类). 3k、细胞核、重线粒体和质膜；10k、线粒体、溶酶体和高尔基体；20k、溶酶体、大囊泡和rER；100k，内质网小泡、质膜、高尔基体和内体；100k sup，可溶性细胞质蛋白。(D类)或者，如*材料和方法*由于相对于从培养的成纤维细胞中获得的神经元提取物而言，可用的神经元提取物有限，因此进行了该程序。

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