无名指间环（RBR）蛋白家族

简短摘要

摘要

基因组织和进化史

无名指之间的环（RBR）蛋白是一大类多样的蛋白质，其特点是具有紧凑的序列模块，预计将形成由环分隔的三个指环型或“环”结构域[1，2]。RBR结构域通常作为具有不同功能模块的多域蛋白质的一部分出现，并似乎介导蛋白质与蛋白质的相互作用。大多数家族成员的功能尚未通过实验进行探索，但已知一部分RBR蛋白具有E3泛素连接酶活性。

RBR区域中每个环结构域的序列通常包含八个半胱氨酸和组氨酸残基簇，这些残基可能结合金属离子。氨基末端环状结构域（RING1或N-ring）被认为结合两个锌离子并折叠成经典的交叉支撑无名指，而羧基末端环（RING2或C-ring）似乎只结合一个金属离子并形成与经典无名指不同的疏水核[三]。中央半胱氨酸/组氨酸簇也可能形成环状指状结构。莫雷特和博克[4]导出了该域基于序列轮廓的一般特征，并将其称为IBR（中间环）。独立，范德雷登等. [5]识别了该域-具有更受限的PROSITE样模式[6]C类₆HC-作为DRIL（双环指连接）结构域，并称为包含ring-DRIL-ring的蛋白质家族TRIAD。这两个定义大体上是重叠的，但并不完全相同。莫雷特和博克的方法[4]符合序列同源性的概念和统计显著性序列相似性的标准，因此是首选标准。

RBR蛋白构成了一个庞大而多样的家族，目前在序列数据库中约有400个代表。基于RBR片段内的序列保守性，RBR蛋白被分为15个亚家族（A-I、P、S、T、U、X、Z；图​图1）。1). 还有大约10个孤儿序列可以被视为自己的组。亚家族A（阿里阿德涅样蛋白）可进一步细分为约10个簇（A0-A9）。类似地，可以区分S亚家族（仅在病毒中发现）、T亚家族（TRIAD3蛋白）和Z亚家族（只在原生动物中发现）的几个亚群。不同组序列代表的RBR段对齐如图所示​图11有关半胱氨酸/组氨酸模式和环大小的守恒的详细信息，请参阅本文在线提供的附加数据文件1。其他信息（序列列表、子组比对、注释、补充文本和表格）也可在我们的网站上获得[7].

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图1

RBR域段的多重对齐。该图包括64个具有代表性的RBR段的序列。这种比对是用于创建图2中的系统发育树的大比对的一部分。序列标识符给出了子科代码（第一个字母），后跟分类单元和GenBank中的登录号。三个环状结构域之间的环段用“XX”表示。底部的灰色条表示排列位置的氨基酸类型保存程度。对齐主要使用CLUSTALX[70]生成，并手动编辑。出租车缩写：Am，蜜蜂; 在，拟南芥; 总工程师，秀丽隐杆线虫; 日期，盘状网柄菌; Dm中，黑腹果蝇; 博士，达尼奥雷里奥; 广州，赤霉素; Hs、，智人; 编号：，粗糙脉孢菌; 服务提供商，葡萄裂殖酵母.

基因组测序项目大大增加了RBR基因的信息；它们包含一个复杂而古老的基因家族，已在所有被检测的真核生物及其一些病毒中发现。酵母中有两种RBR蛋白酿酒酵母，6英寸黑腹果蝇，10英寸秀丽隐杆线虫，约40英寸拟南芥斑马鱼大约23岁(达尼奥雷里奥)，约15人（附加数据文件1）。RBR蛋白的基因散布在整个基因组中。它们的染色体位置和外显子数目不同。例如，Mladek等. [8]研究了Ariadne（A）亚家族拟南芥：16阿塔利基因分布在所有5条染色体的10个位点上。尽管序列保守，但它们具有不同的基因结构。外显子的数量在一个之间变化(亚特兰大3)和15(亚特兰大5，亚特兰大7和亚特兰大8). 这个阿塔利基因在植物发育过程中以器官特异的方式进行差异表达。

RBR蛋白的剪接亚型广泛存在[8-10]。至少对于一些RBR蛋白来说，选择性剪接会导致缩短的同种型，从而控制各自亲本较大同种型的细胞定位和功能[9]。对于大鼠转录因子RBCK1，RBR结构域在其转录活性中起着关键作用[11]。RBCK2已被鉴定为RBCK1的一种替代剪接变体，它缺乏RBCK1的羧基末端部分，包括RBR区[11]。吉本等. [9]结果表明，RBCK2通过将RBCK1束缚在细胞质中来抑制其转录活性。最近报道了一种类似的缺乏RBR区域的parkin替代剪接变体[12].

RBR区域的遗传模块编码在进化过程中明显在多个基因环境中重复使用，并通过点突变和插入/删除进行了顺序修改，并重新组合到新的基因组位置。有人提出了一种基于逆转录转座子的机制来支持这些变化，证据表明这来自于拟南芥[8]。不同分类范围内RBR片段之间的推测系统发育关系如图所示​图2，2值得注意的是，一些RBR蛋白亚家族仅在特定分类群中发现（附加数据文件1）；例如，仅在动物中发现了亚家族C（例如环指蛋白144）、I（IBR域包含蛋白1，IBRDC1）、P（parkin）、U（阿里阿德涅样E3泛素连接酶，PAUL）和X（人类乙型肝炎病毒X相关蛋白，XAP）。其他几个亚科对真菌（E亚科和F亚科）和植物（G亚科和H亚科）具有特异性。除了高等真核生物中的大量RBR蛋白基因外，它们还显著存在于单细胞真核生物、昆虫痘病毒和虹彩病毒中[7]（附加数据文件1）。有趣的是，在古细菌或真细菌基因组中没有真正可以称为RBR家族成员的基因。

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图2

RBR结构域片段的系统发生树。使用102个代表人口最多亚群的蛋白质的RBR片段的大比对创建树。我们使用了来自Forester软件包[71-73]的程序SEAVIEW和工具ATV。每个条目的标签如图1所示。通常，亚科成员很好地聚集在一起，亚科内的系统发育关系被确定为具有重要意义。靠近树根，分支变得越来越不确定。一些真菌和原生动物的序列更具异质性，出现在多个树位置。这个D.盘状体序列{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“XP_646567.1”，“term_id”：“66826425”，“term_text”：“XP_646567.1”}}XP_646567.1电话不与其他ARA54序列一起出现，但由于序列结构中的RWD域，被分配到“B（ARA54）”组。

特征结构特征

整个RBR片段通常包含大约200个连续氨基酸。从氨基到羧基末端，环状序列域趋向于变小——N-ring约60个残基，IBR约50个残基和C-ring约40个残基[1，2]。RBR区氨基端的环具有较高的序列和大小可变性。相比之下，半胱氨酸/组氨酸位置在N-RING和IBR中更为保守。在半胱氨酸和组氨酸模式位置仅在已知只结合一个锌离子的C-RING结构域中观察到非半胱氨酸或非组氨酸残基的取代。一些RBR蛋白似乎在没有C-RING的情况下仍然有功能，但parkin和其他蛋白显然需要RBR区域的这一部分才能作为E3泛素连接酶发挥正确的功能[2].

不幸的是，RBR地区几乎没有直接的结构信息。卡皮利等. [三]报告了三维结构（PDB登录号1个d2)人类Ariadne蛋白HHARI中的C-RING（UNIPROT登录号的残基326-395｛“type”：“entrez protein”，“attrs”：｛“text”：“Q9Y4X5”，“term_id”：“20532376”，“term_text”：“Q9Y4X5”｝Q9Y4X5型，亚家族A1/Ari1），折叠成一个结合单个锌离子的新结构（图​（图3a）。3a年). 此外，三维结构（PDB1个WIM，结构报告未发表），主要代表人类UbcM4相互作用蛋白4（C/RNF144亚家族；UNIPROT登录号{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“P50876”，“term_id”：“160358924”，“term_text”：“P50876“}}第50876页)非常类似于经典的环形域（图​（图3b）。3亿). 没有任何IBR域的结构信息。

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图3

RBR段中环域的结构。结构图是用程序VMD生成的[74]。主链痕迹和二级结构显示为带状，锌离子显示为红色球体。（a）人类Ariadne-1同源蛋白HHARI中RBR区域（C-RING）的羧基末端部分（PDB登录号1轮驱动2; UNIPROT登录号的残留物326-395{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“Q9Y4X5”，“term_id”：“20532376”，“term_text”：“Q9Y4X5”}}Q9Y4X5型; 亚家族A1/Ari1）。（b）人UbcM4相互作用蛋白4 RBR片段的N-RING（PDB登录号1个WIM; UNIPROT登录号的残留物20-100{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“P50876”，“term_id”：“160358924”，“term_text”：“P50876“}}第50876页; 子家族C/RNF144）。

除了RBR片段内的保守外，在遥远分类群之间保守的序列结构也是RBR蛋白质分类的重要标准，如图所示​图4。4。附加段的功能意义及其与序列中RBR部分的合作通常不明确，这无疑是近期的一项紧迫研究任务。例如，确定dorfins（D亚家族）中的两个疏水区域（每个都是跨膜螺旋的长度）是否作为膜连接模块发挥作用，或者它们是否对蛋白质复合物的形成至关重要，这将是很有意义的。可用数据冲突。TMHMM程序预测了两个长跨膜螺旋（每个长30-35个残基，含保守脯氨酸）[13]和DAS-TM过滤器[14，15]在dorfin-RBR区域的羧基末端侧。羧基末端缺失包括疏水片段，但RBR区域未被触及，导致酶无法结合泛素化底物[16]，表明该区域负责泛素的结合。另一方面，蛋白质在核膜和中心体附近的定位、与波形蛋白的共定位以及与钙敏感受体CaR（一种完整的膜蛋白）的相互作用支持了膜包埋[16，17]。RNF144（亚家族C）和IBRDC1（亚家族I）在RBR区域的羧基末端侧也有预测的跨膜螺旋，RNF144在高尔基膜的定位已经显示[18].

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图4

RBR蛋白的序列结构。显示了RBR蛋白亚家族的详细序列结构。球状结构域（如cullin）和非球状结构区（负电荷簇或富含脯氨酸的区域）采用彩色编码，如图例所示。应注意，所示为典型的序列架构。有几个例外：例如，PAUL蛋白质大多含有三个额外的锌指，但少数代表只有一个锌指。类似地，除了原生动物成员只有一个或并没有外，多芬鱼有两个预测的疏水螺旋。Fungi1组的两个序列非常不同，只有RBR片段有共同之处。在Plant1代表中，一个蛋白质包含两个RRM结构域，而不是通常的两个KH结构域。域登录号：APC10、PF03256；碎玻璃，SM00182；DEXDc，SM00487；IBR，SM00647；后轮驱动，SM00591；DUF1605，PF07717；HA2，PF04408；HELICc，SM00490；KH、SM00322；RRM，SM 00360；ANK，SM002481；UBA，SM00165；UBQ，SM00213；UIM卡，SM00726；和ZnF_RBZ，SM00547。前两个字母“PF”和“SM”分别表示PFAM和SMART数据库。

RBR区域与泛素化途径已知的结构域和基序（如泛素相关的UBA、泛素UBQ和泛素相互作用基序，UIM）的结合并不令人惊讶，而与解旋酶结构域（DEXDc和HELICc）、核酸结合域（KH和RRM）的关联在RBR蛋白参与基因表达调控的背景下，蛋白结合域（RWD、犰狳/HEAT重复序列和锚蛋白片段）是有意义的。泛素化和RNA代谢之间的功能联系似乎是一种普遍现象[19].

本地化和功能

RBR蛋白具有多种功能，从控制蛋白质质量到调节翻译和信号传导[10，20-22]。一些RBR蛋白最初被发现的方式突出了这种多样性。蛋白质相互作用研究首先引起了对RBR蛋白的关注。例如，XAP3[23]和大鼠RBCK1[11]以蛋白激酶C-β相互作用蛋白的调节结构域为诱饵发现，Ariadne蛋白被发现是果蝇、小鼠和人类中泛素结合酶（E2）的相互作用伙伴[24-27]。推测的阿里阿德涅样E3泛素连接酶PAUL出现在以肌肉特异性激酶（MuSK）细胞质域为诱饵提取的复合物中[28]。Parkin是功能性最好的RBR蛋白[29，30]。在临床背景下，编码帕金森病的基因突变与散发性早发性帕金森病和常染色体隐性青少年帕金森病有关[29，30]帕金最近也与细胞内病原体的易感性有关，如伤寒沙门菌，副伤寒杆菌和麻风分枝杆菌和癌症[31-35]。其他几种RBR蛋白与人类神经退行性疾病、感染易感性和癌症有关[2，21，36，37].

据报道，E3泛素连接酶对15种RBR蛋白具有活性，迄今为止已鉴定出25种底物和70多种相互作用物（图​（图5；5; 附加数据文件1）。作为典型的E3酶，RBR蛋白与泛素结合酶（E2s）相互作用，催化泛素与靶蛋白的共价连接[38]。对于大多数特征化的RBR蛋白，N-RING对于招募特定E2和结合底物至关重要。然而，这一规则也有例外，非RBR区域也定义了底物相互作用（图​（图5；5; 附加数据文件1）。RBR蛋白被认为是单分子E3泛素连接酶（E3s）。然而，parkin和parkin-like细胞质蛋白（PARC）与SCF-like E3泛素连接酶复合物的成分相互作用，如cullin和F-box蛋白[39，40].

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图5

已知与RBR蛋白的相互作用物。每个区域的相互作用蛋白被框起来，前面是它们相互作用的RBR蛋白亚家族的名称：A，Ariadne；A3，Parc；B、 ARA54；D、 多芬；P、 停车场；C、 RNF144；十、 XAP；U、 保罗；T、 三、。RBR蛋白某些亚家族中存在的额外氨基末端结构域以浅蓝色突出显示，并用结构域缩写表示，在括号中显示了它们所在的亚家族。UBL，泛素样结构域；UBA，泛素相关结构域；ZnF_RBZ，锌指；cullin，cullin样结构域；ARM/HEAT、犰狳和HEAT重复；APC10，后期促进复合物亚基10。多芬中存在羧基末端疏水段。附加数据文件1中列出了其他基质和相互作用物。

Parkin和dorfin保护多巴胺能神经元免受线粒体损伤的影响[41-43]以及通过泛素介导的蛋白酶体降解和/或此类蛋白质的亚细胞系留从有害水平的聚集蛋白[29，30，44]。它们还参与内质网相关降解途径（ERAD）。它们与与内质网相关的E2相互作用，以及促进跨膜蛋白未折叠或错误折叠形式的降解，如帕金相关内皮素受体样受体（Pael-R），都支持这一点[45]，synaptotagmin XI[46]，AAA-ATP酶含缬氨酸蛋白[47]和多巴胺转运体[48]在内质网中积累之前。此外，质膜受体如Toll样受体TLR4和TLR9是RBR蛋白TRIAD3A的底物[10]。这导致了一个假设，即TRIAD3A控制Toll信号介导的促炎反应的强度和持续时间。最近的一项研究提出了帕金通过结合EGFR和EGFR途径底物15（EPS15）并泛素化EPS15，从而调节EGFR的内化和降解，在调节来自表皮生长因子受体（EGFR）的信号传导中的新作用[22].

至少有三种RBR蛋白参与细胞周期和凋亡的调控。PARC是抑癌蛋白p53的负调控因子。PARC的过度表达可以在细胞质中隔离p53，而不会使其泛素化降解[49]。相反，RBR蛋白p53RFP是RNF144亚家族（C）的成员，其靶向细胞周期进展抑制剂（p21^{WAF1（加权平均1）})用于降解。锌指蛋白抑制NF-κB蛋白（ZIN）是TRIAD3的剪接变异体，类似地支持NFκB活化抑制剂（RIP）的降解。p53RFP或RIP过度表达诱导细胞凋亡[50，51].

由人类免疫缺陷病毒（HIV）编码的Vif蛋白诱导锌离子移位到细胞核，这表明RBR蛋白可能是干扰病毒复制的理想候选蛋白。Vif对HIV-1颗粒的组装和逆转录复合物的稳定性至关重要[37]。病毒感染的另一个可能调节因子是RBR蛋白血红素氧化IRP2泛素连接酶（HOIL-1），它与乙型肝炎病毒的X蛋白相互作用，增强其激活X反应启动子的能力[23].

Ariadne亚家族的RBR蛋白可能参与翻译调控，因为Ariadne-亚家族蛋白HHARI泛素化真核mRNA帽结合蛋白4EHP[20]明显改变了4EHP与mRNA帽的结合效率。4EHP泛素化也可能是特定mRNA群体细胞内分区的信号。

RBR蛋白可以被其相互作用伙伴招募到特定的亚细胞隔室。例如，RBCK1通过与其RBR域缺陷剪接变体RBCK2的相互作用而转位到细胞核[9]。这种核质穿梭在RBR蛋白中很常见，并且由以下蛋白相互作用图支持果蝇属[52]这揭示了RBR蛋白ARI-2与经典核转运受体核蛋白3的相互作用。另一方面，一些RBR成员可能能够自己调节核质转运。

例如，parkin与Ran-binding蛋白质2（RanBP2）相互作用并泛素化，Ran-binding蛋白2与小泛素相关修饰物（SUMO）E3连接酶家族相关，是核孔复合体的组成部分[53]。parkin与SUMO-1的结合增强了parkin的核转位和自泛素化，表明其E3活性和亚细胞定位都是通过与SUMO1的结合而调节的[54].

监管机制

RBR蛋白也受到翻译后调节，这种调节主要倾向于抑制它们的E3活性。Parkin的稳定性由环指结构域E3连接酶FLRF/Nrdp1控制，该连接酶与氨基末端相互作用，降低Parkin半衰期和酶活性[55]。自身泛素化已被证明可抑制Ariadne、雄激素受体相关蛋白54（ARA54）、RNF144、dorfin、parkin和TRIAD3亚家族成员的E3活性[10，16，49，56-62]（附加数据文件1）。Parkin的E3活性也通过伴侣样蛋白14-3-3η与其连接区的结合而受到抑制（图​（图5）。5). 14-3-3η在与α-突触核蛋白紧密结合后从这种抑制性复合物中释放出来。因此，帕金的活性由14-3-3η和α-突触核蛋白相互调节[63]。Hsc-70-相互作用蛋白（CHIP）的羧基末端和伴侣Hsp70对帕金的类似拮抗调节参与了未折叠Pael-R的降解[45]。Hsp70通过与未折叠的Pael-R和parkin形成复合物来抑制parkin的E3活性，而CHIP诱导Hsp70解离并增强parkin活性和Pael-R.parkin也通过与Bcl-2相关的athanogene 5（BAG5）和Hsp70相互作用增强对蛋白质聚集体的固存而受到抑制[64].

磷酸化参与parkin的负调控，因为应激诱导的磷酸化减少导致其活性增加[65]。Parkin由一氧化氮（NO）修饰以双相方式控制[66，67]。在S-亚硝基化的前两个小时内，帕金的催化活性增加。然后逐渐下降，并在NO暴露24小时后被抑制[68]。鉴于磷酸化和S-亚硝基化是可逆的，已检测到一种新型不可逆共价加合物，即帕金的多巴胺衍生邻苯二酚修饰物，可降低E3活性和溶解度。Parkin对这种修饰特别敏感，因为加合物不能转移到Ariadne亚家族成员HHARI[69].

边境

RBR蛋白及其相互作用伙伴似乎参与了几乎所有主要的细胞事件：转录和RNA代谢、翻译、亚细胞系留、翻译后修饰和蛋白质稳定性的调节、细胞和应激信号、细胞周期控制以及微生物感染过程。这些对RBR蛋白不同功能的初步了解主要是通过对多用途神经保护剂parkin、其他十种动物RBR蛋白和一种单一成员的详细分析获得的拟南芥基本上，对于剩余的大约350个RBR蛋白，尤其是动物特异性IBRDC1，以及植物、真菌、原生动物和病毒特异性亚科（H、G、F、E、Z和S），我们一无所知。其中一些RBR蛋白也可能具有E3活性。然而，目前尚不清楚RBR蛋白是否作为单分子和/或在SCF-like E3连接酶复合物中发挥作用，以及它们是否催化单或多泛素化和赖氨酸48或63型连接。除了E3连接酶功能外，RBR片段还可能充当激活域，与细胞骨架组件相互作用，并充当栓系模块。因此，未来的一个挑战是分析它们不断变化的亚细胞分布。

一些RBR蛋白与神经退行性疾病和感染性疾病、IBR和完整RBR结构域的三维结构以及负责相互作用和结构稳定的残基的知识有关，这将是确定治疗药物可能设计的特定靶点的先决条件。未来的工作应揭示附加域的功能重要性及其与RBR域的合作。这对被忽视的有机体特定亚家族的成员来说尤其重要，因为这些亚家族存在于构成致病性、农业和水产养殖威胁的有机体中（例如，人类致病性原生动物溶组织内阿米巴和真菌烟曲霉、植物病原真菌赤霉素和稻瘟病菌以及鱼类和两栖类病毒、淋巴囊虫病病毒和石斑鱼虹彩病毒）。RBR蛋白的未来分析将带来更多惊喜和令人惊讶且有价值的发现。

附加数据文件

附加数据文件1包含补充表格和其他参考，可在线获取。

补充材料

工具书类