Pink1 forms a multiprotein complex with Miro and Milton, linking Pink1 function to mitochondrial trafficking

doi:10.1021/bi8019178

.2009年3月10日；48(9):2045-52.

doi:10.1021/bi8019178。

Pink1与Miro和Milton形成多蛋白复合物，将Pink1的功能与线粒体运输联系起来

安德烈亚斯·魏霍芬¹, 凯利·让·托马斯, 贝斯·奥斯塔舍夫斯基, 马克·库克森, 丹尼斯·J·塞尔科

附属公司

PMID： 19152501
预防性维修识别码： PMC2693257型
内政部： 10.1021/bi8019178

Pink1与Miro和Milton形成多蛋白复合物，将Pink1的功能与线粒体运输联系起来

安德烈亚斯·魏霍芬等。生物化学. 2009.

.2009年3月10日；48(9):2045-52.

doi:10.1021/bi8019178。

作者

安德烈亚斯·魏霍芬¹, 凯利·让·托马斯, 贝斯·奥斯塔舍夫斯基, 马克·库克森, 丹尼斯·J·塞尔科

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿市布里格姆女子医院和哈佛医学院神经疾病中心，邮编02115。

PMID： 19152501
预防性维修识别码： PMC2693257型
内政部： 10.1021/bi8019178

摘要

Pink1的隐性突变导致黑质多巴胺能神经元选择性变性，这是帕金森病的特征。Pink1是一种部分靶向线粒体的激酶，Pink1功能的丧失可以改变线粒体形态和动力学，从而支持线粒体功能障碍与帕金森病病因之间的联系。在这里，我们报道了一种线粒体多蛋白复合物的无偏鉴定和确认，该复合物包含Pink1、非典型GTPase Miro和衔接蛋白Milton。我们的屏幕还确定了Pink1和Mitofilin之间的相互作用。基于先前确定的Miro和Milton在沿微管运输线粒体中的功能，我们假设Pink1在线粒体运输中起作用。通过亚细胞分馏，我们发现Miro和Milton的过度表达增加了线粒体Pink1池，表明Pink1在线粒体外膜发挥作用。此外，我们证明，在没有线粒体靶向序列的情况下表达的Pink1仍然可以通过Miro和Milton靶向富含线粒体的亚细胞组分。后一项发现对于解释之前报道的Pink1在没有线粒体靶向序列的情况下表达的保护作用很重要。最后，我们发现Miro和Milton的表达抑制了细胞培养中Pink1功能丧失引起的线粒体形态改变。我们的研究结果表明，Pink1在细胞线粒体的运输中发挥作用。

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数字

图1
Miro-2和Mitofilin作为线粒体Pink1结合蛋白的鉴定。（A） Pink1-FLAG从线粒体上拉下的MS/MS测序结果。Pink1-FLAG（PF）和阴性对照（−）的相对峰面积比较显示Miro-2和Mitofilin是Pink1的特异结合伙伴。（B）新型Pink1结合伙伴的确认。Pink1-FLAG或模拟载体在HEK-293FT细胞中瞬时表达。检测细胞提取物中的Miro-2、Mitofilin和Pink1（输入），然后使用抗FLAG抗体进行免疫沉淀（IP）。内源性Miro-2和Mitofilin的Western blotting通过MS/MS测序证实了检测结果。

图2
Pink1与Miro-2和Milton-1形成蛋白质复合物。（A） Pink1-FLAG、Pink1激酶读取（KD）-FLAG或模拟载体与Myc-Miro-2瞬时共转染COS7细胞。检测细胞提取物中的转染蛋白（Input），然后用抗FLAG抗体（M2）进行IP处理。然后检测免疫沉淀物中的Myc-Miro-2和Pink1-FLAG。（B）将Myc-Miro-2或模拟载体与Pink1共同转染到COS7细胞中。使用Western blotting分析细胞提取物（Input）转染蛋白的表达，然后使用抗Myc抗体（A14）进行IP。检测免疫沉淀物中的Pink1-FLAG和Myc-Miro-2。（C）连续的co-IP揭示了Pink1/Miro-2/Milton-1多蛋白复合物。Xpress-Milton-1在COS7细胞中与Miro-2和/或Pink1-FLAG瞬时共表达。细胞提取物经过抗FLAG IP处理。然后使用FLAG肽洗脱免疫沉淀物并进行抗Myc IP。检测细胞提取物（输入）和两种免疫沉淀物中的Pink1-FLAG、Myc-Miro-2和Xpress-Milton-1，发现由Pink1、Miro-2及Milton-1（中间通道）组成的多蛋白。所用抗体的名称显示在括号中；*表示交叉反应带。

图3
Miro-2或Milton-1的过度表达增加了Pink1在线粒体池中的百分比。利用COS7细胞的差速离心进行亚细胞分馏，这些细胞与Pink1瞬时共表达（A）mock、（B）Myc-Miro-2或（C）Xpress-Milton-1载体。通过蛋白质印迹法探测级分中的Pink1、Myc-Miro-2、Xpress-Milton-1和隔室标记蛋白。（D）模拟、Myc-Miro-2或Xpress-Milton-1表达后，定量分析Pink1 66 kDa（D）和Pink1 55 kDa（E）的细胞溶质（S100k）、富含线粒体（P10k）和富含微粒体（P100k）组分之间的相对亚细胞分布（n=3，平均数±SEM）。与模拟结果相比，有显著变化（*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001；纽曼-凯尔斯多重比较测试的单因素方差分析）。

图4
Miro-2和Milton-1将ΔMTS-Pink1募集到线粒体。（A）ΔMTS-Pink1与Miro-2相互作用。用mock、Pink1 FLAG或ΔMTS-Pink1-FLAG（Pink1 aa 112−581）载体将Myc-Miro-2瞬时共转染到COS7细胞中。对细胞提取物进行Pink1和Myc-Miro-2探测（输入），然后与抗FLAG抗体（M2）共注入。针对Myc-Miro-2和Pink1进行的沉淀物的Western blotting表明Pink1-FLAG和ΔMTS-Pink1-FLAG与Myc-Miro-2特异结合。（B）模拟、Myc-Miro-2或Xpress-Milton-1共表达后，定量分析ΔMTS-Pink1转染体细胞溶质（S100k）、富含线粒体（P10k）和富含微粒体（P100k）部分的相对亚细胞分布（n=3，平均值±SEM）。有显著变化（*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001；纽曼-凯尔斯多重比较试验的单因素方差分析）。下图显示了模拟、Myc-Miro-2或Xpress-Milton-1转染后S100k、P10k和P100k组分的代表性红外ΔMTS-Pink1免疫印迹。

图5
Miro-2和Milton-1的过度表达抑制了Pink1沉默诱导的M17细胞线粒体形态的改变。（A）对照shRNA株的线粒体形态示例，显示有线粒体YFP标记的细胞具有细长、聚集或碎片状线粒体（比例尺，2μm）。（B）将Myc-Miro-2或Xpress-Milton-1瞬时转染到稳定表达干扰对照或Pink1 shRNA的M17细胞中。然后通过Western blot分析检测细胞提取物中的转染蛋白。（C） Pink1沉默后线粒体形态的定量分析，无与Miro-2或Milton-1过度表达的比较（n=4，平均值±SEM，每次实验计数30个细胞）。显示出显著变化（与对照shRNA条件相比）（*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001；Newman-Keuls多重比较试验的单向方差分析）。聚集类中前两个条（对照shRNA和Pink1 shRNA）的缺失表明，在这些细胞中基本上没有观察到聚集的线粒体。

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1. Beilina A、Van Der Brug M、Ahmad R、Kesavapany S、Miller DW、Petsko GA、Cookson MR。PTEN诱导的推定激酶1突变与隐性帕金森病相关，对蛋白质稳定性有不同的影响。程序。国家。阿卡德。科学。美国2005年；102:5703–5708.-项目管理咨询公司-公共医学

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