线粒体病理与凋亡性肌肉变性果蝇皮突变体

摘要

帕金森氏病（PD）是一种常见的神经退行性疾病，其特征是黑质致密部多巴胺能神经元的丢失和被称为路易小体（Lewy body）的神经元内蛋白质内含物的积聚。对帕金森病多巴胺能神经元丢失的分子机制知之甚少；然而，证据表明，环境和遗传因素都起到了促进作用(1–三). 虽然目前只确定了几种导致这种疾病的因素，但对PD中神经元死亡机制的重要见解来自对PD诱导化合物1-甲基-4-苯基吡啶（MPP）的研究⁺). MPP公司⁺是多巴胺能神经元的一种特殊毒素，通过抑制线粒体复合物I诱导细胞死亡(4–6). 这一发现导致了其他触发多巴胺能神经元死亡的线粒体复合物I抑制剂的鉴定(7,8)促进了对特发性PD患者线粒体完整性的研究(9–13). 这些研究揭示了PD与线粒体功能障碍之间的相关性，以及线粒体毒素的研究，为线粒体功能障碍作为PD的主要组成部分提供了有力支持。

尽管线粒体功能障碍似乎是特发性PD的一个显著特征，但导致线粒体功能障碍的分子机制仍基本未知。对帕金森病神经退行性变分子机制的深入研究开始于对这种罕见单基因形式疾病的基因座的识别。从这项工作中鉴定出的一个基因是停车场.功能丧失突变停车场导致早发型PD，称为常染色体隐性遗传青少年帕金森综合征（AR-JP）(14). AR-JP患者表现出许多特发性PD的临床特征；然而，大多数确诊病例缺乏路易体病理学。这一观察结果表明，路易体形成可能需要Parkin，或者特发性PD和AR-JP患者的多巴胺能神经元丢失通过不同的机制进行。

这个停车场该基因编码一种多肽，具有一个N端泛素样结构域、两个羧基端环填充基序和一个中间环填充（IBR）结构域。最近的研究表明，Parkin作为E3泛素蛋白连接酶发挥作用，这是具有环状结构域的蛋白质的常见功能(15–17). E3泛素蛋白连接酶与泛素激活（E1）和泛素结合（E2）酶协同作用，在泛素化途径中赋予底物特异性。Parkin作为泛素蛋白连接酶发挥作用的发现表明，未能用泛素标记特定细胞靶点是AR-JP中多巴胺能神经元丢失的原因。基于此假设的实验已经确定了Parkin的几个潜在细胞靶点，包括在特发性PD中发现的路易体内含物成分(17–20). 然而，由于缺乏AR-JP的动物模型，无法直接测试这些Parkin底物与多巴胺能神经元丢失的相关性。

为了进一步探索Parkin的生物学作用，我们使用了一种突变方法来灭活高度保守的果蝇皮正交曲线。携带空等位基因的苍蝇停车场是可行的，但表现出寿命缩短、雄性不育、飞行和攀爬缺陷。雄性不育表型源于精子发生缺陷，而运动表型则源于凋亡的肌肉退化。线粒体结构改变是生殖系和肌肉病理学的显著特征。这些结果增加了线粒体功能障碍和凋亡是AR-JP中多巴胺能神经元丢失的基础的可能性。此外，这些发现表明AR-JP-与更常见的特发性PD之间存在机制联系。

方法

结果

要识别果蝇属的同源物停车场人类Parkin蛋白序列被用于查询果蝇属基因组序列。从这项研究中，确定了一个编码468个氨基酸的多肽的基因，该多肽与人类Parkin的氨基酸同源性为42%，总的相似性为59%（图。​（图11一个). 这个基因是果蝇属编码含有泛素样结构域、环状结构域和IBR结构域的多肽的基因组，表明它代表果蝇皮正交曲线。使用poly（A）进行Northern印迹分析⁺检测到胚胎、幼虫和成人的RNA停车场在所有发育阶段的转录本中，成虫的丰度特别高（图。​（图11B类).

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图1

氨基酸序列、表达模式和突变等位基因停车场. (一个)的氨基酸序列比对果蝇属公园（D-Park）与人类公园（H-Park）。指定了N末端泛素样结构域（方框）、环指结构域（装箱和着色）和中间环结构域（着色）。(B类)poly（A）的Northern印迹分析⁺使用停车场-特定探针。尺寸单位以千为单位。成虫似乎表现出更大、数量更少的停车场除1.7kb的主要转录本外，还有转录本。(C)分子图停车场显示公园^EP（3）LA1插入，三个断点停车场这项工作中描述的缺失等位基因，以及停车场点突变。弯曲箭头表示预测的转录起始位点停车场黑框表示Parkin蛋白编码序列。上方的箭头公园^EP（3）LA1插入指定此的方向P（P）元素。

要中断停车场基因，利用P（P）元素映射接近停车场。该策略产生了一条线，指定公园^EP（3）LA1，从上游71 bp处插入停车场起始密码子（图。​（图11C). 产生更严重的等位基因停车场，的公园^EP（3）LA1在有利于产生从插入位点延伸的重合缺失的条件下，用转座酶激活插入(22). 从这个屏幕上发现了大量的缺失等位基因，包括一些删除了所有停车场编码序列，从而代表停车场（图。​（图11C). 这项工作还产生了一条染色体，上面精确地切除了公园^EP（3）LA1作为控制染色体（指定公园^{风险价值评估})在我们的研究中。

苍蝇携带任何停车场反式至Df（3L）Pc-MK公司删除染色体，删除停车场该基因在成年发育阶段是可行的，但表现出轻微的发育延迟，通常比对照晚一天羽化，寿命显著缩短(P（P）< 0.0001).停车场空苍蝇的平均寿命为27天，没有一只寿命超过50天，而苍蝇的公园^{风险价值评估}trans-to中染色体的精确切除Df（3L）Pc-MK公司平均寿命为39天，寿命可达75天。

女性停车场突变体可以生育并产生正常后代，但雄性完全不育。这一发现使我们能够筛选出≈1100个经甲基磺酸乙酯诱变的纯合可存活雄性不育系，以获得更多停车场突变独立于我们的缺失等位基因。排序停车场从该筛查中发现的两个突变基因显示出错义和过早终止密码子突变（图。​（图11C)，证实雄性不育表型是由于停车场功能。

纯合或纯杂合睾丸的分析停车场突变体表明雄性不育表型来源于精子发生的晚期缺陷。精子发生在停车场突变体一直持续到个体化阶段，在此阶段，一个通常分离为成熟精子细胞的64细胞生殖系囊肿无法分离，导致精囊中缺乏成熟精子细胞（图。​（图2）。2). 发育中精子细胞的超微结构分析停车场突变体显示精子尾部的结构不规则。成熟精子的尾部通常由鞭毛轴丝和一种特殊的线粒体衍生物（图。​（图22 C和E类). 虽然轴丝停车场突变体表现正常，内本核完整性严重受损；一些精子细胞有多个Nebenkern，而其他精子细胞只有极少量的成分（图。​（图22 D类和F类). 此外，与野生型相比，Nebenkern外基质的电子密度显著降低（图。​（图22 E类和F类). 这些结果表明，Nebenken的形成和/或功能缺陷可能是精子细胞个体化失败的基础停车场突变体。

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图2

停车场突变体表现出与异常线粒体衍生物相关的精子细胞个体化缺陷。(一个)停车场⁺睾丸显示有许多单个精子从破裂的睾丸中释放出来（箭头）。成熟精子的长而薄的细胞核也可以在精囊（箭头）内看到。圆形细胞核对应于睾丸鞘细胞。(B类)分析停车场⁻睾丸显示精囊中没有成熟精子（箭头所示）。然而，成熟精子细胞形成(插入)但未能个体化并保持为合胞体束。(C)野生型晚期64细胞囊肿横截面的超微结构分析，显示发育中精子细胞的规则排列（箭头所示）。(E类)个体化后成熟精子的高倍横截面显示轴突（Ax）和线粒体衍生物Nebenkern（N）紧密包裹在膜中。注意Nebenkern中被均匀电子密度材料包围的副晶体结构（箭头所示）。在停车场⁻突变体(D类和F类)轴突具有高度规则且形状良好的外观，但Nebenkern显示出异常分布。一些精子细胞与多个大型Nebenkern（箭头）有关，而另一些精子细胞的Nebenkern（箭头）显著减少。此外，围绕Nebenkern副晶结构的电子密度矩阵呈弥散状(F类，黑色箭头，与比较E类). (一个和B类)解剖的睾丸用DAPI染色以标记细胞核。(B类 插入)罗丹明结合的阴茎倍体蛋白被用来突出精子细胞的尾部。基因型；停车场⁺:公园^{风险价值评估}/Df（3L）Pc-MK公司,停车场⁻:公园¹³/Df（3L）Pc-MK公司.

除了寿命缩短和雄性不育外停车场空等位基因以及根据雄性不育表型恢复的等位基因赋予了部分渗透性下降的翅膀表型作为纯合子或作为转杂合子Df（3L）Pc-MK公司染色体（图。​（图3三 一个和B类). 该表型的外显率随年龄增加而增加；≈40%的新关闭的苍蝇表现出异常的翅膀姿势，而在10天龄时，超过70%的苍蝇停车场突变体表现出这种表型。这一发现促使我们分析了停车场突变体。这些分析表明停车场突变体（图。​（图3三 C和D类). 这两种表型也在停车场翅膀姿势正常的突变体（数据未显示）。上升衰减率在停车场突变体和野生型苍蝇表明停车场变种人成年后开始攀爬能力下降。

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图3

中胚层正常的机翼姿态、飞行和运动需要驻车功能。(一个和一个'）1日龄对照果蝇的翅膀姿势(公园^{风险价值评估}/Df（3L）Pc-MK公司)和(B类和B类′）年龄匹配停车场突变体(公园²⁵/Df（3L）Pc-MK公司)显示了羽翼向下的表型停车场突变体。(C和D类)停车场与对照苍蝇相比，突变体表现出飞行和攀爬能力受损（参见方法详细信息）。所有测试的苍蝇都是转基因的Df（3L）Pc分子量删除和停车场指示的等位基因。(E类和F类)异位表达停车场在中胚层中含有24B-GAL4(24)或Dmef2-GAL4(21)驾驶员恢复飞行和爬坡能力停车场突变体。所有测试的苍蝇都是转基因的Df（3L）Pc-MK公司删除和停车场显示等位基因。基因型：拯救1：w个;UAS园区/+;公园¹³/24B-镀锌4,英国国防部; 救援2：w个;UAS园区/+;公园¹³/Dmef2-GAL4型,英国国防部; 控制1：w个;公园¹³/Dmef2-GAL4型,英国国防部; 控制2，w个;公园¹³/24B-GAL4，Df; 控制3：w个;UAS园区/+;公园¹³/英国国防部。误差条表示SEM。

解决运动缺陷的来源停车场突变体，UAS/GAL4系统(24)用来表达停车场在特定组织中。驱动的两条GAL4线路停车场中胚层中的表达被发现可以拯救昆虫的翅膀姿势、飞行和攀爬表型停车场突变体达到野生型或接近野生型水平（图。​（图3三 E类和F类)，证明肌肉组织需要Parkin功能。

主要飞行肌肉[间接飞行肌肉（IFM）]的组织学分析停车场突变体显示肌肉完整性严重受损，这与肌肉功能障碍在停车场飞行缺陷（图。​（图44 一个和B类). 肌肉完整性在年几乎完全恢复停车场异位表达的突变体停车场肌肉（图。​（图44C). 来自的喙肌分析停车场突变体显示出与IFM相似的病理学，表明这种表型对飞行肌肉不是特异性的（数据未显示）。然而，参与跳跃反应的转子肌三角抑制肌和参与幼虫运动的幼虫体墙肌在形态和功能上均正常停车场突变体（数据未显示），表明只有一部分肌肉受到停车场功能。

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图4

帕金突变体表现为肌肉变性和线粒体病理。(一个–C)干扰素纵向切片的苏木精和伊红染色显示对照组肌肉保存良好(一个)与急性退化相比停车场突变体(B类)以液泡形成（箭头）和细胞碎片堆积（箭头）为特征。转基因表达停车场大幅恢复肌肉完整性(C)，尽管偶尔仍可见空泡（箭头所示）。(插图)IFM的横截面。(D类和G公司)节至停车场⁺成人IFM显示出规则而紧密的肌原纤维排列（白色箭头），有许多电子密度高的线粒体（红色箭头和插入). (E类和H（H）)停车场⁻成人IFM表现为不规则且分散的肌原纤维排列，具有弥散的Z线和M带。线粒体严重肿胀和畸形，显示嵴解体（红色箭头和插入). (F类和我)肌原纤维和线粒体的完整性可以通过转基因表达停车场在肌肉组织中。(J型–O（运行）)线粒体病理是进行性的，在肌原纤维变性之前。(J型和M（M）)来自对照96小时蛹的IFM显示出许多电子密度线粒体，而年龄匹配停车场突变体(K（K）和N个)已经有电子密度较低、嵴较少的线粒体。(L（左）和O（运行）)到120小时，停车场⁻蛹仍显示出完整的肌原纤维结构，但随着嵴继续退化，线粒体大量肿胀。基因型：停车场⁺:w个;公园^{风险价值评估}/Df（3L）Pc-MK公司,停车场⁻:w个;公园²⁵/Df（3L）Pc-MK公司，转基因拯救：w个;UAS园区;公园²⁵/24B-镀锌4,公园²⁵。（比例尺：D类–L（左），2微米；M–O型和插图在里面D–F型，0.5微米）Z、 Z线；M、 M-波段；APF，蛹形成后。

1~2日龄儿童IFM的超微结构分析停车场突变体显示肌原纤维密度总体下降，肌原纤维Z线加宽，肌节长度缩短（图。​（图44 D类和E类). 然而，肌原纤维的结构改变是可变的，与对照苍蝇的肌原纤维结构改变没有区别。相反，肿胀的线粒体表现出嵴的严重破坏和崩解是IFM的一个统一特征停车场突变体（图。​（图44 D类,E类,G公司、和H（H）). 转基因表达停车场在肌肉组织中恢复肌原纤维的完整性和线粒体形态（图。​（图44 F类和我). 通过分析IFM超微结构，研究线粒体和肌原纤维病理学之间的时间关系停车场IFM形成后不久蛹发育阶段的突变体。蛹形成后96或120小时，肌原纤维的完整性停车场突变体与对照组相似，没有退化迹象（图。​（图44 J型–L（左）). IFM超微结构的唯一可检测差异停车场突变体和对照动物在蛹发育阶段是线粒体基质的分解停车场突变体（图。​（图44 M（M）–O（运行）). 这些结果表明线粒体病理学是肌肉功能障碍的早期指标，并且肌肉病理学本质上是退化的。

确定肌肉退化是否停车场突变体通过凋亡机制进行，IFM在停车场突变体和年龄匹配的对照苍蝇接受末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP末端标记（TUNEL）染色(28). 蛹形成后96和120小时，未检测到TUNEL染色停车场突变体和对照苍蝇（图。​（图55和数据未显示）。然而，在1日龄成人的IFM中观察到TUNEL阳性细胞核的急剧增加停车场与年龄匹配的对照苍蝇相关的突变，表明肌肉线粒体缺陷最终通过凋亡机制导致细胞死亡（图。​（图55 C和D类).

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图5

停车场突变体表现为飞行肌细胞凋亡。96小时的IFM(一个)和120小时(B类)停车场突变蛹缺乏TUNEL阳性细胞核。一日龄控制蝇类(C)也缺乏TUNEL阳性细胞核，而年龄匹配停车场突变体(D类)有许多凋亡细胞核（绿色）。磷灰石（红色）突出肌肉组织。基因型：停车场⁺:w个;公园^rvA公司/Df（3L）Pc-MK公司,停车场⁻：w;公园²⁵/公园²⁵.

检查停车场在大脑中，从1天、10天和30天龄的苍蝇身上制备切片。标准组织学分析显示主要大脑中心的适当发育（图。​（图66 一个和B类). 老年人未发现神经膜完整性或细胞皮层数量明显丧失停车场突变苍蝇与对照相比（图。​（图66 一个和B类). 因为多巴胺能神经元是AR-JP的优先靶点，所以对大脑切片进行酪氨酸羟化酶免疫染色(27). 对背内侧、背外侧、前内侧簇和延髓的多巴胺能神经元进行评估。在这些细胞组中没有观察到明显的神经元损失。酪氨酸羟化酶免疫反应终末密度也基本保持不变。然而，老年人背内侧多巴胺能细胞簇的细胞可靠地显示出细胞体收缩和近端树突酪氨酸羟化酶免疫染色减少停车场相对于对照组的突变体（图。​（图66 C和D类). 在其他多巴胺能细胞组中未观察到此类变化。鉴于α-突触核蛋白（另一种与家族性帕金森病有关的蛋白）在多巴胺能神经元簇中的毒性增强，对背内侧簇的优先效应非常有趣(27,29).

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图6

损失停车场功能不会导致一般神经元变性或多巴胺能神经元丢失。(一个和B类)对照组苏木精和伊红染色的额叶切片(一个)与相比停车场突变体(B类)30日龄的苍蝇显示出神经系统的适当组织，包括形状良好的椭球体（eb）、蒂（p）、食管下神经节（sog）、髓质（m）和椎板（l）。此外，在停车场与细胞皮层或神经膜中的对照相比，突变体。(C和D类)酪氨酸羟化酶免疫染色显示对照苍蝇背内侧群神经元数量相似(C)与相比停车场突变体(D类)尽管细胞体收缩（箭头）和近端树突染色减少（箭头）经常很明显。基因型：停车场⁺:w个;公园^{风险价值评估}/Df（3L）Pc-MK公司,停车场⁻:w个;公园¹³/Df（3L）Pc-MK公司.

讨论

为了研究Parkin的生物学作用以及Parkin功能丧失导致选择性细胞死亡的机制，我们创建了一个果蝇属通过靶向破坏高度保守的AR-JP模型果蝇皮正交曲线。我们证明了这一点果蝇皮空突变体是可行的，但寿命很短停车场功能导致雄性不育、运动障碍和多巴胺能神经元的结构改变。雄性不育表型来源于雄性生殖系中的精子细胞个体化缺陷，而运动缺陷则来源于凋亡性肌肉退化。

两者之间的明显区别果蝇皮突变体和AR-JP与受缺失停车场功能。黑质多巴胺能神经元似乎是AR-JP患者受影响的主要组织，而在果蝇皮突变体来源于肌肉和生殖系病理学。然而，负责这些不同组织病理学的潜在分子机制可能高度保守。的确，雄性生殖系和IFM的超微结构检查停车场突变体显示线粒体缺陷是这些不同组织类型的共同病理特征。尽管还需要进一步的工作来确定线粒体病理学与精子个体化缺陷的相关性，但对IFM发病机制的研究强烈表明，线粒体病理学是一种主要缺陷。因此，这些结果表明帕金果蝇表型来源于线粒体功能障碍的共同起源。有多种细胞损伤能够产生在停车场突变体，还需要进一步的工作来阐明停车场功能触发线粒体病理学并最终导致细胞死亡。

我们发现线粒体病理和凋亡是IFM变性的显著特征，这增加了AR-JP多巴胺能神经元丢失的类似机制的可能性停车场在线粒体完整性或凋亡方面，大量证据表明线粒体功能障碍和凋亡是特发性帕金森病神经退行性变的重要因素(30–32). 因此，我们的研究结果提供了AR-JP与更广泛的特发性PD之间潜在的机制联系。

致谢

缩写

脚注

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